周毅葉 ，王祺，賈妍卓，梁玉琳，王堯，王雨琪，鄒俊波，2，史亞軍，2，張小飛，2

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712046

辛夷又稱望春花，為武當(dāng)玉蘭或玉蘭的干燥花蕾，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。辛夷能溫中解肌，善于通透九竅，尤善通鼻竅，對鼻炎、頭痛、鼻塞、齒疼等有良好的治療作用。辛夷外可祛風(fēng)除寒，內(nèi)可升達(dá)肺胃清氣?，F(xiàn)代藥理研究表明，辛夷揮發(fā)油可收縮鼻黏膜血管，促進(jìn)黏膜分泌物吸收，進(jìn)而保護(hù)鼻黏膜，減輕鼻腔炎癥，有局部抗過敏、收斂、刺激和麻醉、抑菌、抗炎作用[1-2]。

過敏性鼻炎屬中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”范疇，臨床表現(xiàn)為鼻癢、噴嚏、流清涕、鼻塞等。辛夷為治療過敏性鼻炎常用藥，其作用機(jī)制尚不明確，藥效成分和核心靶點(diǎn)蛋白有待探究。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過篩選辛夷活性成分作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)，建立藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，探討辛夷治療過敏性鼻炎的作用機(jī)制，為其藥理研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 辛夷活性成分篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），在“Herb name”詞條框中輸入“辛夷”，獲取辛夷條目，點(diǎn)擊進(jìn)入并獲取分子信息，包括活性成分的分子名稱（molecule name）、口服生物利用度（OB）、相對分子質(zhì)量（MW）、類藥性（DL）等。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 作為條件篩選辛夷的活性成分。

1.2 辛夷活性成分相關(guān)蛋白靶點(diǎn)獲取

根據(jù)篩選得到的活性成分，在TCMSP 中點(diǎn)擊“Related Targets”，獲取成分的“Targets Information”，得到該成分作用的靶蛋白名（target name）。在Uniprot（http://www.uniprot.org/）中，使用Uniprot KB 檢索功能，在檢索框中輸入靶蛋白名，檢索條件為“organism：homo sapiens”和“reviewed：yes”，獲取基因名（gene name）和Uniprot ID。檢索結(jié)果以.exe格式導(dǎo)出，保留不同成分作用蛋白靶點(diǎn)基因條目，包括辛夷活性成分對應(yīng)人類的相關(guān)蛋白靶點(diǎn)基因及其對應(yīng)Uniprot ID。

1.3 辛夷成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將辛夷活性成分和相關(guān)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，使成分-靶點(diǎn)關(guān)系可視化，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，以自由度（degree）為篩選參數(shù)，進(jìn)行化合物成分和蛋白靶點(diǎn)的篩選。在該網(wǎng)絡(luò)中，活性成分與蛋白靶點(diǎn)均由節(jié)點(diǎn)（node）表示，二者的作用關(guān)系用邊（edge）表示，最終得到成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 過敏性鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)基因獲取

通過TTD（https://db.idrblab.org/ttd/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）、DisGeNET（http://www.disgenet.org/web/DisGeneT/menu/home ）、OMIM（http://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫，以“allergic rhinitis”為關(guān)鍵詞檢索過敏性鼻炎相關(guān)基因，分別獲取過敏性鼻炎相關(guān)基因和蛋白靶點(diǎn)信息，對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理合并，并刪除重復(fù)值（相同的Gene 簡稱），得到包括基因、對應(yīng)靶點(diǎn)名稱（target name）和UN 結(jié)果（Uniprot）的Excel 文件。

1.5 辛夷活性成分靶點(diǎn)與過敏性鼻炎疾病靶點(diǎn)交集數(shù)據(jù)獲取

建立辛夷活性成分靶蛋白的Excel 文件，包括分子名稱（molecule name）、成分編號（RST ID 自定義）、基因名（gene names）和Uniprot ID（Entry ID，單一基因的標(biāo)準(zhǔn)化，Uniprot 數(shù)據(jù)庫中的唯一編號）和蛋白名（protein names）。建立過敏性鼻炎相關(guān)靶蛋白的Excel 文件，包括蛋白名（protein names）、基因名（gene names）和Uniprot ID（Entry ID）。對過敏性鼻炎疾病靶點(diǎn)與辛夷活性成分靶點(diǎn)運(yùn)用Excel 篩選功能，以“gene names”為查詢條件，映射出每個活性成分與過敏性鼻炎相關(guān)靶蛋白的交集，獲得辛夷活性成分靶蛋白與過敏性鼻炎靶蛋白交集的關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括蛋白名、基因名和Uniprot ID。

1.6 交集蛋白靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

檢索String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），點(diǎn)擊“Multiple Proteins”，在“List Of Names”詞條框中輸入交集靶點(diǎn)，并在“Organism”詞條框中選擇“Homo sapiens”，點(diǎn)擊“SEARCH”，點(diǎn)擊“CONTINUE”，獲取交集蛋白靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，保存文件并導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件，繪制交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，以自由度（degree）為篩選參數(shù)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)，使交集蛋白靶點(diǎn)之間的關(guān)系更為明確。

1.7 交集靶點(diǎn)生物過程和KEGG 通路富集分析

運(yùn)用R 語言clusterProfiler 包對辛夷活性成分治療過敏性鼻炎靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，獲取其生物過程（biological process，BP），并進(jìn)行KEGG 通路富集分析。

1.8 分子對接

為進(jìn)一步驗(yàn)證活性成分與蛋白靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性，利用Discovery Studio 4.0 軟件，將前5 個靶蛋白與其對應(yīng)的藥物活性成分進(jìn)行分子對接，并對結(jié)果進(jìn)行分析。在DrugBank（https://www.drugbank.ca/）中得到靶蛋白對應(yīng)的陽性藥，從蛋白數(shù)據(jù)庫PDB（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中搜索并下載靶蛋白及陽性藥三維結(jié)構(gòu)，作為分子對接的載體。從PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索并下載配體的.sdf 格式文件，用于與蛋白質(zhì)、陽性藥結(jié)構(gòu)的分子對接。利用Discovery Studio 4.0 的Clean Protein 工具對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行以下操作：刪除配體分子和水分子、不全不完整殘基、多余蛋白質(zhì)構(gòu)象，并加氫和分配相關(guān)電荷。利用LibDock 工具，Comformation Method 參數(shù)設(shè)置為“BEST”，Docking Preferences 參數(shù)設(shè)置為“High Quality”，其余參數(shù)為默認(rèn)，記錄配體在此口袋的打分值LibDock Score。

2 結(jié)果

2.1 辛夷活性成分

通過TCMSP 檢索到184 個辛夷化合物，篩選出19 個活性化合物，見表1。

2.2 辛夷活性成分對應(yīng)靶蛋白

通過TCMSP分別獲取19個成分作用的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名稱，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫Search PubChem 檢索得到對應(yīng)Canonical SMILES，再用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫檢索Predict targets，得到藥物作用的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名稱，合并后共獲取928 條靶點(diǎn)信息。

表1 辛夷活性化合物基本信息

2.3 辛夷活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)由431 個節(jié)點(diǎn)組成，包括18 個藥物成分節(jié)點(diǎn)和413 個蛋白靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，自由度最大為116，最小為1，平均自由度4.292，以大于平均自由度為條件篩選核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1。主要活性成分（自由度）包括異二氫氟喹諾酮A（116）、加爾加拉文（113）、鵝掌楸樹脂酚B 二甲醚（108）、去核劑a（105）、去甲檳榔堿（104）等。

圖1 辛夷核心成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 過敏性鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)

從TTD、DrugBank、DisGeNET、OMIM 數(shù)據(jù)庫中分別獲取到27、10、163、266 條疾病相關(guān)靶點(diǎn)，去重后得到336 條過敏性鼻炎相關(guān)基因靶點(diǎn)信息。

2.5 辛夷成分靶點(diǎn)與過敏性鼻炎疾病靶點(diǎn)交集分析

辛夷成分靶點(diǎn)（353 個）與過敏性鼻炎疾病靶點(diǎn)（283 個）取交集，得到43 個靶點(diǎn)基因，分別為PTGS2、ADRB2、ALOX5、GABRA2、PIK3CG、PIK3CA、PIK3CD、PIK3CB、NR3C1、TBXA2R、PTGER3、HIF1A、KNG1、PTGS1、MMP9、GSTP1、ADRA2C、CHRM2、CHRM3、ADAM10、TSPO、PDE5A、HRH3、HRH4、IRAK4、PDE4D、PRKCQ、CCR4、ADORA2A、TLR9、TGFBR1、PLA2G7、IDO1、PLAT、CNR1、CNR2、PRKCG、ICAM1、SERPINE1、CFTR、CCR5、FABP4 和C5AR1。

2.6 交集蛋白靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用String 獲取交集蛋白靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，包含40 個節(jié)點(diǎn)（3 個靶點(diǎn)未參與）、149 條邊，平均自由度為6.93，平均局部聚類系數(shù)為0.673，見圖2。

2.7 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

辛夷治療過敏性鼻炎成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)由60個節(jié)點(diǎn)組成，包含17 個藥物成分節(jié)點(diǎn)和43 個蛋白靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，見圖3。該網(wǎng)絡(luò)最大自由度為16，平均自由度為4.1。取大于平均自由度的節(jié)點(diǎn)作為辛夷治療過敏性鼻炎成分-靶點(diǎn)-疾病核心網(wǎng)絡(luò)，包含8 個成分節(jié)點(diǎn)和6 個蛋白靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，見圖4。8 個成分（自由度）分別為鵝掌楸樹脂酚B 二甲醚（16）、加爾加拉文（16）、異二氫氟喹諾酮A（16）、去核劑a（14）、亞油酸乙酯（13）、去甲檳榔堿（13）、(-)-白玉蘭亭B（11）山蒟酮（10）。6 個蛋白靶點(diǎn)分別為前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、前列腺素G/H 合成酶1（PTGS1）、PI3 激酶p110α 亞單位（PIK3CA）、花生四烯酸鹽5-脂氧合酶（ALOX5）、前列腺素EP3 受體（PTGER3）、毒蕈堿乙酰膽堿受體M3（CHRM3），其自由度分別為15、7、6、6、5、5。

圖2 辛夷治療過敏性鼻炎交集蛋白靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖3 辛夷治療過敏性鼻炎成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

圖4 辛夷治療過敏性鼻炎成分-靶點(diǎn)-疾病核心網(wǎng)絡(luò)

2.8 生物過程和KEGG通路富集分析

GO富集分析得到613條生物過程，核心生物過程見圖5?？梢钥闯?，辛夷治療過敏性鼻炎與5條生物過程緊密相關(guān)，分別為炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞遷移、體液水平調(diào)節(jié)、對外界刺激反應(yīng)的積極調(diào)節(jié)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)。KEGG 通路富集分析得到95條調(diào)控通路，核心通路見圖6。可以看出，辛夷治療過敏性鼻炎與5條通路緊密相關(guān)，分別為刺激神經(jīng)組織中的交互、膽堿能突觸、HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、趨化因子信號通路。

2.9 分子對接分析

選擇成分-靶點(diǎn)-疾病核心網(wǎng)絡(luò)中自由度居前5位的蛋白靶點(diǎn)，與其對應(yīng)化合物進(jìn)行分子對接，采取剛性對接，利用Discovery Studio4.0軟件進(jìn)行陽性藥驗(yàn)證，結(jié)果見表2、表3，相互作用關(guān)系見圖7～圖11。

圖5 辛夷治療過敏性鼻炎BP富集分析

圖6 辛夷治療過敏性鼻炎KEGG 通路富集分析

表2 辛夷治療過敏性鼻炎核心靶點(diǎn)與化合物結(jié)合活性得分

表3 辛夷治療過敏性鼻炎核心靶點(diǎn)與化合物、陽性藥結(jié)合活性得分比較

圖7 ALOX5與XY-14 相互作用關(guān)系圖

圖8 PTGER3與XY-01相互作用關(guān)系圖

圖9 PTGS1與XY-19 相互作用關(guān)系圖

圖10 PTGS2與XY-12相互作用關(guān)系圖

圖11 PIK3CA 與XY-01相互作用關(guān)系圖

3 討論

過敏性鼻炎常為基因、空氣環(huán)境因素，或兩者共同作用所導(dǎo)致，主要為塵、螨、花粉等[3-4]吸入性變應(yīng)原侵襲鼻腔，并誘導(dǎo)特異性IgE 抗體與之反應(yīng)而發(fā)病。近年來，隨著環(huán)境條件的改變，空氣環(huán)境成為過敏性鼻炎的主要致病因素[5]。中醫(yī)認(rèn)為，該病發(fā)生與外感風(fēng)寒、臟腑功能失調(diào)或邪氣入侵鼻竅有關(guān)，并根據(jù)臨床表現(xiàn)將其分為腎陽虧虛型、氣虛寒型、氣虛血瘀型、外寒內(nèi)熱型等。臨床需辨明寒熱和臟腑病位及其病機(jī)，根據(jù)不同證型，可采用溫陽補(bǔ)腎法[6]、溫肺散寒法[7]、補(bǔ)中益氣法[8]、活血化瘀法[9]、平調(diào)寒熱法[10]治療。辛夷善通鼻竅，故在過敏性鼻炎各證型的治療中多有使用。

本研究通過對辛夷主要活性成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，并與過敏性鼻炎的疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，篩選出辛夷治療過敏性鼻炎的活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，對網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)進(jìn)行生物過程和信號通路分析。結(jié)果表明，辛夷治療過敏性鼻炎的主要活性成分為鵝掌楸樹脂酚B二甲醚、加爾加拉文、亞油酸乙酯等，PTGS2、PTGS1、PIK3CA、ALOX5、PTGER3等靶點(diǎn)是白細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、體液水平調(diào)節(jié)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對外界刺激反應(yīng)的積極調(diào)節(jié)等生物過程的核心靶點(diǎn)。湯雁利等[11]研究康復(fù)新藥物的抗炎作用及其機(jī)制，結(jié)果表明康復(fù)新可抑制巨噬細(xì)胞的炎癥作用，是通過降低PTGS2基因的表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步表明PTGS2與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。廖世峨等[12]研究ALOX5與兒童哮喘易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示ALOX5與哮喘的嚴(yán)重程度、過敏、肺功能指標(biāo)等有關(guān)。同時，過敏性鼻炎可誘導(dǎo)哮喘，ALOX5基因與其易感性也存在密切關(guān)系[13]，表明ALOX5對過敏性鼻炎的易感性與過敏性有重要作用。膽堿能突觸、刺激神經(jīng)組織中的交互、HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、趨化因子信號通路等為辛夷治療過敏性鼻炎的主要信號通路。范雋等[14]研究HIF-1信號通路對鼻炎發(fā)病機(jī)制的影響，表明HIF-1信號通路與鼻腔內(nèi)的鉤突黏膜組織密切相關(guān)。李影等[15]對腫瘤壞死因子參與炎癥反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)的研究指出，腫瘤壞死因子直接或間接募集并激活活化轉(zhuǎn)錄因子信號通路，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，從而參與炎癥性疾病。祁建妮[16]對microRNA-210調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的研究表明，固有免疫中的巨噬細(xì)胞識別細(xì)胞膜表面的模式識別受體，進(jìn)而識別細(xì)菌和病毒，經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)化激活轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子與抗體結(jié)合后產(chǎn)生大量促炎因子、趨化因子，同時，促炎因子和趨化因子具有清除微生物感染的作用。另外，辛夷參與的體液水平調(diào)節(jié)、對外界刺激反應(yīng)的積極調(diào)節(jié)的生物過程是治療過敏性鼻炎體內(nèi)調(diào)節(jié)的主要過程。

本研究表明，辛夷活性成分可通過參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞遷移、體液水平調(diào)節(jié)、對外界刺激反應(yīng)的積極調(diào)節(jié)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)等生物過程，以及刺激神經(jīng)組織中的交互、膽堿能突觸、HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、趨化因子信號通路等生物通路發(fā)揮治療過敏性鼻炎作用。辛夷活性成分具有良好的抗組胺、抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)的作用，通過多靶點(diǎn)與多成分的協(xié)同作用，達(dá)到治療過敏性鼻炎的效果。本研究可為過敏性鼻炎治療藥物的實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供依據(jù)。