劉建林 李 惠 胡春艷 王慧超 呂心瑞

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)所致的慢性腎臟疾病，屬DM慢性微血管并發(fā)癥。尤其是近年來，隨著DM患病基數(shù)的不斷增長，DN患病人數(shù)也逐年上升，已成為終末期腎臟疾病(end stage of renal disease,ESRD)的主要病因之一，DN早期防治也已成為亟待解決的重要公共衛(wèi)生課題。臨床試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)腎小球纖維樣病變是DN腎臟病變進(jìn)一步惡化的典型病理表現(xiàn)。抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factors-β,TGF-β1)過量表達(dá)是防治腎小球纖維化的關(guān)鍵。維A酸(retinoic acid,RA)是維生素A的中間代謝產(chǎn)物，研究已證實(shí)，組織RA在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞分化、胚胎生長、腫瘤發(fā)生中扮演重要角色，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖及分化，但既往針對(duì)RA的臨床研究也多側(cè)重于腫瘤疾病、皮膚病等，在DN中的臨床報(bào)道相對(duì)鮮見。基于此，本研究擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析RA對(duì)DN大鼠腎臟保護(hù)作用，并通過對(duì)TGF-β1通路及相關(guān)下游調(diào)控蛋白表達(dá)水平的測(cè)定探究其分子機(jī)制，旨在為DN的臨床防治提供方向，具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性大鼠及大鼠飼料均購自上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)公司，質(zhì)量200～250 g；動(dòng)物飼養(yǎng)溫度23℃、濕度44%，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)；高脂飼料為基礎(chǔ)飼料84.5%、蛋黃粉7%、豬油8%、膽酸鈉0.5%，由本實(shí)驗(yàn)室自行配置。

1.1.2 試劑 放射免疫沉淀法裂解緩沖液(radio immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA裂解液)由實(shí)驗(yàn)室自行配置[10%磷酸酶抑制劑∶1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)]；山羊抗兔IgG/HRP聚合物、DAB顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallo proteinase 9,MMP-9)試劑盒均購自北京中杉金橋有限公司；RA、鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、格列本脲購自美國Sigma化學(xué)公司；伊紅及蘇木素均購自BASO生物科技有限公司；尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血肌酐(serum creatinine, Scr)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Nephrin、Podocin、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(phosphorylated p38,p-p38MAPK)、TGF-β1、Caspase -3、Smad家族蛋白2/3(Smad2/3)、磷酸化Smad 2/3(p-Smad2/3)抗體購自英國Abcom公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 載玻片、蓋玻片均購自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司；石蠟切片機(jī)為Lecia RM 2135；脫水機(jī)為Leica TP1020；烤片機(jī)為安徽電子科學(xué)研究所QP-B；光學(xué)顯微鏡為日本OLYMPUS；蛋白電泳儀、電壓穩(wěn)壓儀、蛋白轉(zhuǎn)印槽均購自美國Bio-Rad公司；7600 型全自動(dòng)生化分析儀購自日本日立公司；染色玻璃缸購自上海鼎杰生物科技有限公司；血糖儀/試紙購自美國強(qiáng)生；酶標(biāo)儀購自美國Bio Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 60只SPF級(jí)大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、格列本脲組、RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組，每組10只；其中正常對(duì)照組、模型組給予5 mg/kg生理鹽水；格列本脲組按5 mg/kg給予格列本脲，RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組分別按15 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg給予RA；給藥方式為連續(xù)灌胃；按1次/天頻率持續(xù)給藥6周；6組大鼠均規(guī)律喂養(yǎng)普通飼料，自由飲水。每組大鼠數(shù)量不足10只則按隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動(dòng)物并造模。

1.2.2 DN大鼠模型建立 SPD級(jí)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分出10只作為正常組，余下大鼠參照文獻(xiàn)制作DN模型。造模大鼠禁食12 h，采用左腎切除術(shù)聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)：0.1 mmol/L無菌枸櫞酸鈉緩沖液將STZ配置成2%溶液。4周后按60 mg/kg劑量經(jīng)腹腔注射STZ，對(duì)照組則注射等劑量無菌枸櫞酸鈉緩沖液，給藥后72小時(shí)采集大鼠尾靜脈血，血糖儀測(cè)定血糖，連續(xù)3次隨機(jī)血糖(random blood glucose，RBG)≥16.7 mmol/L則提示DM大鼠造模成功(2只血糖未達(dá)標(biāo)，棄用)；6周后24 h尿蛋白(urine protein,UP)>30 mg則提示DN大鼠造模成功(3只 24 h UP未表達(dá)，棄用)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù) 實(shí)驗(yàn)期間，按2周/次頻率給大鼠稱重，并測(cè)定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)；待尿液采集、腹主動(dòng)脈采血及稱重結(jié)束后處死大鼠，迅速取出腎臟，生理鹽水洗滌后吸干水分，去除包膜后稱腎質(zhì)量，并計(jì)算腎臟指數(shù)(腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量×1 000‰)，并將左腎浸泡于4%中性甲醛用于病理組織檢查；右腎則置于-80℃液氮后用于蛋白表達(dá)測(cè)定；記錄各組干預(yù)前、干預(yù)后第6周的體質(zhì)量及干預(yù)后第6周的腎臟指數(shù)。

1.3.2 大鼠24 h尿蛋白含量、尿排泄量比較 于6周時(shí)在末次給藥結(jié)束前1 d用金屬代謝籠采集大鼠24 h尿液，記錄各組大鼠24 h總尿量、24 h尿蛋白含量、尿排泄量。

1.3.3 大鼠BUN、Scr、FBG 各組大鼠稱重后腹腔注射烏拉坦麻醉，腹主動(dòng)脈采血并離心取血清，置于-20℃保存，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血BUN、Scr、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)水平。

1.3.4 大鼠腎臟病理變化 取左腎，切成小塊后4%中性甲醛固定，蒸餾水洗滌組織后70%乙醇過夜，脫水、透明、石蠟包埋，切片、封片后HE染色，200倍鏡下觀察各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)變化，腎小球系膜有無增生、腎小管有無萎縮、腎間質(zhì)有無炎癥細(xì)胞浸潤等。

1.3.5 大鼠腎組織TGF-β1 通路及相關(guān)下游調(diào)控蛋白表達(dá)水平 采用免疫印跡法(Western blotting法)測(cè)定Nephrin、Podocin、p38MAPK、p -p38MAPK、TGF -β1、Caspase -3、Smad2/3及p-Smad2/3 蛋白表達(dá)情況。取各組大鼠右腎組織，RIPA裂解液均漿后冰上孵育，4℃、12 000 r/min條件下離心20 min，BCA法對(duì)上清液進(jìn)行蛋白定量，加上樣緩沖液制備樣本，取40 μg蛋白，12%SDS-PAGE凝膠電泳，而后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，含5%BSA的TBST室溫封閉3～5 h，分別加入兔抗鼠抗體Nephrin、Podocin、p38MAPK、p -p38MAPK、TGF -β1、Caspase -3、Smad2/3及p-Smad2/3，比例分別為1∶1 000、1∶500、1∶1 000、1∶1 000、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶1 000，以β-actin(1∶2 000)為參照，4℃過夜；次日用含5%BSA的TBST洗膜5次，每次5 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗(1∶10 000)室溫孵育60 min后 TBST洗膜5次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯影；Image J軟件進(jìn)行圖像分析，以光密度比值代表Nephrin、Podocin、p38MAPK、p-p38MAPK、TGF-β1、Caspase -3、Smad2/3、p-Smad2/3表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)比較 模型組大鼠體質(zhì)量下降(

P

<0.05)，其余各組大鼠體質(zhì)量較入組時(shí)均上升(

P

<0.05)；與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量下降，而腎臟指數(shù)上升(

P

<0.05)；而與模型組比較，RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組、格列本脲組大鼠體質(zhì)量均上升(

P

<0.05)，腎臟指數(shù)下降(

P

<0.05)；RA高劑量組體質(zhì)量高于RA中劑量組、RA低劑量組(

P

<0.05)，腎臟指數(shù)低于RA中劑量組、RA低劑量組(

P

<0.05)。各組體質(zhì)量變化差值也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，與正常對(duì)照組比較，模型組體質(zhì)量變化差值更低(

P

<0.05)；與模型組比較，格列本脲組、RA低劑量組、RA中劑量組、RA高劑量組體質(zhì)量變化差值上升(

P

<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)比較(n=10)

續(xù)表1

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白含量、尿排泄量比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠24 h蛋白尿含量、尿排泄量均上升(

P

<0.05)；與模型組比較，RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組、格列本脲組24 h蛋白尿含量、尿排泄量均下降(

P

<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠24 h尿蛋白含量、尿排泄量比較(n=10)

2.3 各組大鼠BUN、Scr、FBG水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠BUN、Scr、FBG均上升(

P

<0.05)；而與模型組比較，RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組、格列本脲組BUN、Scr、FBG均下降(

P

<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠BUN、Scr、FBG水平比較(n=10)

2.4 各組大鼠腎臟病理變化情況 HE染色可見正常對(duì)照組大鼠腎小球系膜未見增生現(xiàn)象，腎小管亦未見萎縮，腎間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤(見圖1A)；模型組大鼠則明顯可見腎小球系膜基質(zhì)增多，部分腎小管有萎縮且存在管腔擴(kuò)張，近端小管上皮細(xì)胞有糖原空泡，且腎間質(zhì)可見灶狀慢性炎性細(xì)胞浸潤(見圖1B)；但格列本脲組和RA高、中、低劑量組大鼠腎小球基質(zhì)均未見明顯增生，萎縮腎小管明顯減少(見圖1C-F)。

圖1 各組大鼠腎臟病理變化情況

2.5 各組大鼠腎組織TGF-β1 通路及相關(guān)下游調(diào)控蛋白表達(dá)水平比較 各組大鼠p38MAPK、Smad2/3表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)；與正常組比較，模型組大鼠Nephrin、Podocin下降，p-p38MAPK、TGF-β1、Caspase-3、p-Smad2/3均上升；與模型組比較，RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組的Nephrin、Podocin上升，p-p38MAPK、TGF-β1、Caspase-3、p-Smad2/3則下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；其中RA高劑量組Nephrin、Podocin高于RA中劑量組、RA低劑量組(

P

<0.05),p-p38MAPK、TGF-β1、Caspase-3、p-Smad2/3則低于RA中劑量組、RA低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表5、圖2。

表5 各組大鼠腎組織TGF-β1 通路及相關(guān)下游調(diào)控蛋白表達(dá)水平比較(n=10)

圖2 各組大鼠腎組織TGF-β1 通路及相關(guān)下游調(diào)控蛋白表達(dá)水平(Western blotting實(shí)驗(yàn))

3 討論

DN的發(fā)病機(jī)制繁雜，當(dāng)前研究指出，DN是長期高血糖與多種致病因素共同參與所致，以持續(xù)增加的尿蛋白排泄為典型臨床表現(xiàn)，并伴腎功能進(jìn)行性下降,這在本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也有體現(xiàn)。本研究中，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著下降，而腎臟指數(shù)、24 h蛋白尿含量、尿排泄量、BUN、Scr、FBG則顯著上升；提示STZ可誘導(dǎo)腎臟腫脹、尿蛋白排泄增加及腎功能損傷，這與鐘艷花等的報(bào)道結(jié)論相似。但與模型組比較，本研究中RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組、格列本脲組大鼠體質(zhì)量均顯著上升(

P

<0.05)，腎臟指數(shù)、24 h蛋白尿含量、尿排泄量、BUN、Scr、FBG顯著下降(

P

<0.05)。提示RA可改善STZ誘導(dǎo)的腎臟腫脹，并降低DN大鼠尿排泄量及尿蛋白，下調(diào)FBG，改善STZ誘導(dǎo)的腎功能損傷。同時(shí)，DN的典型病理表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚、系膜區(qū)大量基質(zhì)增生。本研究中，HE染色同樣可見正常對(duì)照組大鼠腎小球系膜未見增生現(xiàn)象，腎小管亦未見萎縮，腎間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤；而模型組大鼠則明顯可見腎小球系膜基質(zhì)增多，部分腎小管有萎縮且存在管腔擴(kuò)張，近端小管上皮細(xì)胞有糖原空泡，且腎間質(zhì)可見灶狀慢性炎性細(xì)胞浸潤；這與既往報(bào)道結(jié)論相符。但格列本脲組及RA高、中、低劑量組大鼠腎小球基質(zhì)均未見明顯增生，萎縮腎小管明顯減少，這也在進(jìn)一步印證RA可對(duì)DN大鼠發(fā)揮一定腎保護(hù)作用，并呈一定劑量依賴性。

Nephrin、Podocin均是敏感的足細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白，其表達(dá)是維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的關(guān)鍵蛋白。Wu等實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，DN存在Nephrin、Podocin異常表達(dá)，并促進(jìn)蛋白尿發(fā)生、發(fā)展及腎小球硬化。同時(shí)，臨床研究還指出，TGF-β通過TGF-β1型受體進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，激活Smad2、Smad3并磷酸化，與Smad4形成異源三聚體復(fù)合物易位入核，將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因功能；在激活Smad通路的同時(shí)，也激活p38MAPK通路，進(jìn)一步活化Caspase -3引起足細(xì)胞凋亡。且TGF -β1、Caspase -3所介導(dǎo)腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)也可進(jìn)一步促進(jìn)足細(xì)胞凋亡[18]。因此，抑制TGF -β1/Smads/p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路于DN防治至關(guān)重要。為探究RA的腎保護(hù)機(jī)制，本研究比較各組腎組織TGF-β1 通路及相關(guān)下游調(diào)控蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，各組大鼠p38MAPK、Smad2/3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與正常組比較，模型組大鼠Nephrin、Podocin顯著下降，p -p38MAPK、TGF -β1、 Caspase -3、 Smad2/3均顯著上升；但與模型組比較，RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組的Nephrin、Podocin顯著上升，p -p38MAPK、TGF -β1、 Caspase -3、 Smad2/3則顯著下降。提示RA可有效提升DN大鼠腎組織足細(xì)胞蛋白Nephrin、Podocin表達(dá)，降低TGF -β1、Caspase -3蛋白表達(dá)，并抑制p38MAPK磷酸化及Smad2/3活性，從而抑制足細(xì)胞凋亡、改善腎小球硬化，最終改善DN大鼠腎功能及腎組織病理變化，發(fā)揮腎保護(hù)作用。

綜上所述，RA可通過抑制TGF -β1/Smads/p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改善DN大鼠腎臟腫脹，降低其排尿量及尿蛋白，改善腎功能，發(fā)揮腎保護(hù)作用，并呈一定劑量依賴性。但本研究也存在一定局限性，著重探究了RA對(duì)DN大鼠腎功能的影響及機(jī)制，其對(duì)DN大鼠血糖的改善機(jī)制尚不明確，擬作為下階段研究目標(biāo)，持續(xù)補(bǔ)充及完善。