暢志鵬 ，孫瑩瑩 ，李佳陽 ，龔春梅

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌712100）

檸條（Caragana korshinskii）又稱毛條、白檸條，是豆科錦雞兒屬植物［1］，灌木，羽狀復(fù)葉小而密集，葉脈亦呈羽狀，廣泛分布于我國內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅等干旱和半干旱地區(qū)，生長于半固定和固定沙地，是西北地區(qū)營造防風(fēng)固沙林及水土保持林的優(yōu)良物種［2］。優(yōu)越的旱生性能使其成為研究植物抗逆生理機制的理想材料而被廣泛研究，先前主要集中在干旱脅迫下檸條的形態(tài)適應(yīng)性和生理生態(tài)機制的研究較多，近年來分子機制也有了一定研究。研究發(fā)現(xiàn)在中度和重度干旱脅迫下，檸條葉片氣孔關(guān)閉，葉片水勢顯著降低，植物保水能力增強［3］，同時葉片光合速率降低、葉綠素降解，葉片中脯氨酸、可溶性糖含量顯著增加［4］，從而提高了植物的干旱適應(yīng)性。本實驗室也發(fā)現(xiàn)檸條隨自然降水減少呈現(xiàn)葉脈密度增加，維管束的面積、個數(shù)以及葉肉細胞中葉綠體數(shù)量明顯增多的趨勢［5］；干旱脅迫下檸條CkCOV1表達降低，負調(diào)控維管發(fā)育以增強葉脈發(fā)達程度，從而有利水分輸導(dǎo)［1］。干旱條件下，檸條CkDREB表達量升高，將其轉(zhuǎn)入擬南芥（Arabidopsis thaliana）可顯著提高擬南芥的抗旱性［6］。可見檸條的抗旱基因和抗旱途徑多樣，需要更多的試驗和證據(jù)闡述和完善其抗旱機制。

苯丙烷生物合成途徑是植物體內(nèi)一條重要的次生代謝途徑，其下游主要包括木質(zhì)素合成、類黃酮合成和花青素合成途徑，產(chǎn)生參與植物發(fā)育和防御的重要次生代謝產(chǎn)物［7］。木質(zhì)素除了在植物對病原體的防御機制中起作用外，主要在植物次生壁中合成并沉積，為細胞壁提供剛性和抗壓性，使植物能承受水分運輸?shù)呢搲海?］，還可以與細胞壁蛋白連接，以增加細胞壁致密程度，使其難以滲透［9］，此外木質(zhì)素還能防止細胞分化過程中細胞壁和多糖的降解。在干旱脅迫下，甘蔗（Saccharum officinarum）木質(zhì)素合成途徑相關(guān)酶和基因表達量均提高，且木質(zhì)素沉積更多［10］。檸條中苯丙烷代謝途徑的第一個關(guān)鍵酶基因CkPAL在干旱脅迫下表達量升高［11］，當(dāng)PAL基因表達被沉默時，木質(zhì)素含量下降［12］。黃酮類化合物包括黃酮、黃酮醇、異黃酮、花色苷、原花色素等，也可以保護植物免受各種生物和非生物脅迫，作為植物抗毒素、解毒劑和抗菌化合物的作用［7］。

綜上所述，苯丙烷代謝途徑在植物的環(huán)境適應(yīng)和防御中發(fā)揮著重要作用。本研究以檸條苯丙烷代謝中木質(zhì)素合成途徑CkCAD基因為研究對象，通過克隆該基因、構(gòu)建過表達載體并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，在干旱脅迫下對轉(zhuǎn)基因擬南芥進行相關(guān)表型分析，確定抗旱功能，為深入理解植物的抗旱生理和分子機制提供試驗支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用檸條樣品為從西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗田收獲的種子后在室內(nèi)種植所獲。用于轉(zhuǎn)化的野生型擬南芥（wild typeArabidopsis thaliana）為哥倫比亞生態(tài)型（Columbia 0，Col-0）。挑選健康飽滿的檸條種子用清水沖洗干凈，包裹于濕潤紗布中，置黑暗條件下萌發(fā)3 d 左右，待種子萌發(fā)后再移栽入土和蛭石（2∶1）混勻的基質(zhì)中。Col-0 野生型擬南芥種子用清水沖洗干凈后，用75%酒精處理30 s，10%次氯酸鈉消毒15 min，無菌蒸餾水沖洗5～10 次后，用 0.5% 瓊脂將種子懸浮，均勻的點在 1/2 MS 固體培養(yǎng)基（2.2 g·L-1Murashige Skoog，10 g·L-1蔗糖，8 g·L-1瓊脂）上，于 4 ℃冰箱春化 72 h 后，放置于光照培養(yǎng)箱（16 h 光照/8 h 黑暗，22 ℃/20 ℃，光強為 7000 XL）中生長，3 d 左右便可發(fā)芽，7 d 后將擬南芥幼苗移栽入土和蛭石（2∶1）混勻的基質(zhì)中。

1.2 檸條總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄

取30 d 齡的檸條葉片，置于液氮速凍并研磨，采用 Trizol 法提取檸條 RNA［13］、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，中國北京）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 檸條CkCAD 基因的克隆及過表達載體的構(gòu)建

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檸條CkCAD基因的序列，用Premier Primer 5.0 設(shè)計一對引物（表1）。將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 稀釋5 倍后作為模板，進行PCR 反應(yīng)以獲得目的基因，PCR 反應(yīng)體系包括：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+plus）10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1each）4 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 模板 1 μL，PrimeSTAR HS DNA Ploymerase 0.5 μL。反應(yīng)程序為：98 ℃ 20 s，98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 65 s，72 ℃ 5 min，進行35 個循環(huán)，PCR 產(chǎn)物進行膠回收后與經(jīng)過雙酶切后的線性過表達載體pCAMBIA1302 直接連接上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布在含有卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉0.1 g·L-1）上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中生長14 h，菌落PCR 后，挑取陽性菌落送至公司測序。測序結(jié)果正確后，提取質(zhì)粒冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 檸條CkCAD 轉(zhuǎn)化和定量所用引物Table 1 Primers for C. korshinskii CkCAD conversion and quantification in this study

1.4 生物信息學(xué)分析

將測序正確的DNA 序列轉(zhuǎn)為氨基酸序列，通過Geneious R 9.0.2 軟件與大豆（Glycine max）、非洲相思豆（Abrus precatorius）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、花生（Arachis hypogaea）、紫花苜蓿（Medicago sativa）等物種的同源基因氨基酸序列進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。通過ProtParam P（https：//web.expasy.org/protparam/）分析CkCAD 的蛋白分子質(zhì)量及酸堿性，并通過ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析其親疏水性；利用TMHMM 網(wǎng)站（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）對其跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析；通過NCBI（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）分析其蛋白保守結(jié)構(gòu)域。在 Npsa-Prabi（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/）和 SWISS-MODEL（https：//swissmodel. expasy. org/）對 CkCAD 蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)進行分析；通過PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）網(wǎng)站預(yù)測該蛋白質(zhì)的亞細胞定位。

1.5 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

將測序正確的載體轉(zhuǎn)化進GV3101 農(nóng)桿菌，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，挑取菌落進行菌落PCR 驗證后，將陽性菌落接種于 Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基中，28 ℃下180 r·min-1培養(yǎng)過夜至菌液 OD600為 0.8～1.0，以 6000 r·min-1在室溫下離心收集菌液，采取蘸花法［14］，將擬南芥置于含5%蔗糖，0.05%表面活性劑Silwet-L77 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中浸染50 s，重復(fù)兩次，放于密閉紙盒過夜，第二天放回光照培養(yǎng)箱中正常生長。待擬南芥果莢成熟開裂后，收取成熟種子（T0代）于37 ℃烘箱進行48 h 休眠處理后，便可室溫儲存。取T0代種子，采取1.1 中擬南芥種子春化方法，在進行消毒處理后，將種子均勻點在含有50 μg·mL-1潮霉素的1/2 MS 固體培養(yǎng)基上，4 ℃低溫純化后，放置于正常光照條件下生長，陽性植株能夠正常生長出嫩葉和較長的根系，假陽性植株表現(xiàn)出短根，葉片發(fā)黃并逐漸枯死。7 d 后，將陽性植株移栽入土和蛭石（2∶1）混勻的基質(zhì)中，提取基因組作為模板，通過PCR 再次鑒定陽性植株。擴繁并篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株至T3代后用于后續(xù)試驗。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的熒光定量PCR（qRT-PCR）和Weatern blot 鑒定

利用Premier Primer 5.0 設(shè)計擬南芥AtCAD和檸條CkCAD特異性定量引物，并選取擬南芥β-actin 作為內(nèi)參（表 1）。實時 PCR 反應(yīng)使用 SYBR Green（TaKaRa，Shiga，Japan）PCR 測定法［15］的 Bio-Rad CFX96 實時檢測系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，美國）進行。每個反應(yīng)混合物（20 μL）均包含稀釋的第一鏈 cDNA，引物，10 μL TransStart Tip Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech，中國北京）和雙蒸餾水。實時PCR 條件如下：95 ℃持續(xù)30 s，然后在95 ℃持續(xù)5 s，39 ℃持續(xù)30 s，進行39 個循環(huán)，然后進行熔解曲線，使用CT 值確定參考基因的表達水平，并使用2-ΔΔCt方法進行計算［16］。每個樣品設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)和3 個技術(shù)重復(fù)。

采用蛋白質(zhì)粗提法［13］提取總蛋白，分別采集 0.1 g 野生型和 T3代過表達CkCAD擬南芥#1，#3 和#4 株系葉片樣品于預(yù)冷的研缽中，加入1.5 mL 蛋白質(zhì)提取液（Tris 6.8 100 mmol·L-1；SDS 2%；甘油10%；巰基乙醇0.5%；PMSF 0.1 mmol·L-1）和液氮進行充分研磨，置于冰上靜置 15 min，12000 r·min-1，4 ℃離心 10 min，去除底部沉淀獲得總蛋白溶液，使用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒（PA115，TIANGEN，中國北京）測定濃度，-20 ℃保存。將等量的蛋白質(zhì)樣品通過電泳儀（Bio-Rad，Hercules，CA，美國）進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移至 0.45 μm 的聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用 5%（wt·vol-1）的脫脂奶粉封閉 2～4 h，與 GFP 特異性一抗（1∶5000 稀釋）4 ℃孵育過夜，與相應(yīng)二抗（1∶8000 稀釋）室溫孵育 2 h，使用 ECL 發(fā)光液（A 液∶B 液=1∶1 混合均勻），利用 GeneGnome XRQ 化學(xué)發(fā)光檢測器（Syngene，Cambridge，英國）捕獲圖像，并用 GeneSys（Vilber Lourmat，Paris，法國）軟件分析蛋白表達量。

1.7 野生型與過表達擬南芥的干旱處理

選擇光照培養(yǎng)箱內(nèi)生長狀態(tài)良好且生長周期一致的野生型和T3代過表達擬南芥幼苗停止?jié)菜?0 d，同時觀察野生型擬南芥和過表達株系的表型變化，為進一步觀察擬南芥對干旱的響應(yīng)，干旱處理20 d 后進行復(fù)水處理2 d 并觀察植株恢復(fù)情況［17］。野生型和過表達CkCAD擬南芥株系#1、#3 和#4 均設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.8 擬南芥葉脈的觀察及木質(zhì)素含量的測定

選取相同生長位置和發(fā)育階段的野生型和T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片，用75%乙醇在65 ℃水浴中處理至綠色脫盡（期間不斷更換75%乙醇溶液），再用5%NaOH 溶液室溫下去除葉肉組織，便可儲存于75%乙醇溶液中以便觀察［18］。使用體式顯微鏡（Olympus Corporation SZX2-ILLT，Tokyo，日本）在暗場下觀察葉脈發(fā)育狀況并拍攝照片，用Image J 2x 統(tǒng)計葉片的密度。葉脈觀察時每個株系選擇5 個樣本進行重復(fù)性觀察。

采用乙酰溴法［19］測定木質(zhì)素含量，設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)。準(zhǔn)確稱取0.1 g 植物葉片，105 ℃干燥2 h，并研磨至粉末于試管中，加入5 mL 30%乙酰溴的冰醋酸溶液和0.69 mol·L-1的高氯酸，70 ℃水浴60 min，將反應(yīng)液移入裝有5 mL 2 mol·L-1氫氧化鈉和5 mL 冰醋酸溶液的容量瓶中終止反應(yīng)，充分混勻，用冰醋酸稀釋至50 mL，以冰醋酸為空白溶液，測定280 nm 處的紫外吸收值。

1.9 干旱脅迫下植物抗旱相關(guān)生理指標(biāo)及植株生長速率的測定

丙二醛含量的測定：準(zhǔn)確稱取0.1 g 干旱處理后的野生型和過表達擬南芥葉片，剪碎并放于研缽中，加入0.5 mL 20%的三氯乙酸溶液研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移至5 mL 離心管中，4000 r·min-1離心10 min，吸取上清液加入0.5%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）溶液，上下顛倒混勻后在水浴鍋中煮沸，冷卻至室溫，4000 r·min-1離心10 min，吸取上清液作為試驗組，使用 0.5% TBA 溶液作為對照組，分別測量 450、532、600 nm 下的吸光值［20］。

相對含水量的測定：分別采取一定量的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片并立即記錄葉片鮮重（fresh weight，F(xiàn)W），轉(zhuǎn)移葉片至去離子水中在恒定光照下水化4 h，獲得葉片的飽和鮮重（saturated fresh weight，SFW），將葉片在 80 ℃烘箱中干燥至恒重（dry weight，DW），相對含水量（relative water content，RWC）=［（FW-DW）/（SFW-DW）］×100%［21］。

相對電導(dǎo)率的測定：準(zhǔn)確稱取0.1 g 干旱處理后的野生型和過表達擬南芥葉片，將葉片在15 mL 去離子水中抽真空1 h，室溫孵育3 h 后用電導(dǎo)儀測定初始電導(dǎo)率，將葉片在水浴鍋中煮沸15 min，冷卻后測定溶液的總電導(dǎo)率。相對電導(dǎo)率（%）=（初始電導(dǎo)率/總電導(dǎo)率）×100%［21］。

游離脯氨酸含量的測定：準(zhǔn)確稱取0.1 g 干旱處理后的野生型和過表達擬南芥葉片于15 mL 試管中并加入3 mL 磺基水楊酸溶液，在沸水浴中加熱15 min，室溫靜置冷卻，吸取2 mL 提取液至新的試管中，依次加入2 mL 冰醋酸和2 mL 酸性茚三酮，沸水浴中加熱25 min，取出冷卻至室溫后，加入4 mL 甲苯并振蕩混勻，吸取上清液在520 nm 處測定吸光度值，用甲苯溶液做空白對照［22］。

干旱過程中植株高度（株高）變化的測定：從野生型和T3代過表達擬南芥移栽至土中15 d 后進行干旱處理，每天用量尺測量并記錄擬南芥幼苗的株高，待植株萎蔫導(dǎo)致莖干倒伏不再測定。每個株系選擇3 株幼苗作為生物學(xué)重復(fù)進行測定。

干旱處理過程中葉面積變化速率的測定：在擬南芥干旱處理過程中，每天用相機對擬南芥右面進行俯拍，待干旱處理結(jié)束后，用Image J 軟件對葉片面積進行統(tǒng)計并記錄。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本研究所有試驗均設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)。使用Geneious R 9.0.2 軟件進行氨基酸序列比對和系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建；使用Image J 2x 軟件統(tǒng)計葉脈密度；使用IBM SPSS Statistics 23.0 進行單因素ANOVA檢驗，使用GraphPad Prism 7.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸條CkCAD 基因的克隆及生信分析

圖1 檸條CkCAD 序列擴增條帶Fig.1 Amplified bands of C. korshinskii CkCAD sequence

圖2 檸條CkCAD 與其他物種系統(tǒng)發(fā)育進化樹及氨基酸序列比對結(jié)果Fig.2 Phylogenetic tree and amino acid sequence comparison of C. korshinskii CkCAD and other species

以檸條葉片cDNA 為模板，擴增得到大小為1000左右的DNA 片段（圖1），切膠回收并送往生物公司測序，發(fā)現(xiàn)檸條CkCAD全長1074 bp，編碼357 個氨基酸。進行氨基酸序列比對和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹發(fā)現(xiàn)檸條CkCAD 與非洲相思豆、蒺藜苜蓿（Medicago truncata?la）、大豆和花生的親緣關(guān)系較近（圖2A），相似度均在80%以上，其中檸條CkCAD 與非洲相思豆ApCAD 最為相似（圖2B）。ProtParam 在線工具分析顯示CkCAD 蛋白分子質(zhì)量為38.75 kDa，蛋白質(zhì)偏酸性且為親水性蛋白，富含甘氨酸（Gly，10.6%）、纈氨酸（Val，10.1%）、亮氨酸（Leu，9.5%）、賴氨酸（Lys，7.3%）、絲氨酸（Ser，7.0%）；TMHMM 在線工具分析顯示其不包含跨膜結(jié)構(gòu)域；圖3A 的CkCAD 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析顯示其屬于PLN02514亞家族；Npsa-Prabi 網(wǎng)站分析顯示CkCAD 蛋白的二級結(jié)構(gòu)（圖3B）和三級結(jié)構(gòu)（圖3C）主要是由43.1%的無規(guī)則卷曲和22.97%的α 螺旋組成，其中無規(guī)則卷曲主要集中在N 端，而α 螺旋主要集中在C 端。預(yù)測該蛋白質(zhì)亞細胞定位在細胞質(zhì)中（圖3D）。

圖3 檸條CkCAD 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及亞細胞定位預(yù)測Fig.3 CkCAD protein structure and subcellular localization prediction of C. korshinskii

2.2 植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)CkCAD 擬南芥植株的篩選

選擇NcoI 和SpeI 作為雙酶切位點，將已擴增的CkCAD目的序列與切開的pCAMBIA1302 載體進行連接，PCR 鑒定并測序正確后便獲得過表達載體（圖4）。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的過表達載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥后，用50 μg·mL-1的潮霉素篩選獲得T1代陽性過表達CkCAD植株（圖5），并將過表達擬南芥陽性株系擴繁至T3代。

圖4 pCAMBIA1302-35S：：CkCAD 過表達載體的構(gòu)建Fig.4 Construction of pCAMBIA1302-35S：：CkCAD overexpression vector

2.3 T3代陽性植株qRT-PCR 測定及Western blot 驗證

選取了生長階段一致且發(fā)育健壯的野生型和T3代過表達擬南芥，對野生型和過表達株系中的AtCAD、CkCAD進行qRT-PCR 定量分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥#1、#3 和#4 中檸條CkCAD表達量較高，而野生型擬南芥和過表達株系中擬南芥AtCAD表達量相對穩(wěn)定，沒有顯著變化（圖6A）。通過對野生型和過表達株系擬南芥葉片提取總蛋白，進行Western blot 后分析發(fā)現(xiàn)，在過表達株系#1、#3 和#4 中檸條 CkCAD 蛋白能夠穩(wěn)定表達（圖6B）。說明檸條CkCAD基因不僅穩(wěn)定地整合進了擬南芥基因組中，而且能夠穩(wěn)定表達。

圖5 轉(zhuǎn)CkCAD 擬南芥陽性植株的篩選Fig. 5 Screening of CkCAD transgenic Arabidopsis positive plants

圖6 檸條CkCAD 能夠在轉(zhuǎn)基因擬南芥中穩(wěn)定表達Fig.6 C. korshinskii CkCAD can be stably expressed in transgenic Arabidopsis

2.4 過表達CkCAD 的擬南芥株系具有抗旱性

以生長10 d 且正常澆水的野生型擬南芥為對照，對野生型和移栽至苗基質(zhì)中T3代過表達擬南芥進行為期20 d 的干旱處理（圖7）。相較于野生型對照組擬南芥，干旱處理組野生型擬南芥逐漸枯死，且在復(fù)水處理2 d 后未能恢復(fù)，而過表達CkCAD擬南芥株系在干旱處理20 d 過程中雖然有一定的萎蔫，但是植株生長依然茁壯，且在復(fù)水處理2 d 后能夠迅速恢復(fù)。對干旱處理過程中野生型和轉(zhuǎn)CkCAD擬南芥植株株高和葉片面積變化進行了統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CkCAD擬南芥株系#1、#3、#4 的株高和葉面積生長速率更高（圖8），綜合植株生長表型和生長速率說明相較于野生型，過表達CkCAD株系擬南芥具有較強的抗旱性。

2.5 過表達CkCAD 的擬南芥葉脈更加發(fā)達

采集野生型和過表達擬南芥株系的葉片，經(jīng)過透明化并去除葉肉，在體視鏡下觀察葉脈發(fā)育情況，相較于野生型擬南芥，過表達株系葉脈更為發(fā)達致密，葉脈密度更大（圖9）。

圖7 干旱脅迫下轉(zhuǎn)CkCAD 擬南芥植株的生長表型Fig. 7 Growth phenotypes of CkCAD transformed Arabidop?sis plants under drought stress

圖8 干旱脅迫下野生型及轉(zhuǎn)CkCAD 擬南芥植株株高和葉面積的變化趨勢Fig.8 Variation trend of plant height and leaf area of wild-type and CkCAD transformed Arabidopsis plants under drought stress

圖9 野生型和轉(zhuǎn)CkCAD 擬南芥植株葉脈表型比較Fig.9 Comparison of leaf vein phenotype between wild-type and CkCAD transgenic Arabidopsis plants

利用Image J 軟件進一步統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，T3代轉(zhuǎn)CkCAD擬南芥植株的平均脈島長徑比野生型低33%，平均脈島短徑比野生型低35%，平均脈島密度比野生型高26%（圖10）。對葉脈長度進行分析后發(fā)現(xiàn)，T3代轉(zhuǎn)CkCAD擬南芥植株的平均葉脈長度比野生型長13%，平均葉脈密度比野生型大20%，T3代轉(zhuǎn)CkCAD植株葉脈更為發(fā)達（圖10）。

2.6 干旱脅迫下木質(zhì)素含量和抗旱生理指標(biāo)的測定

木質(zhì)素含量測定發(fā)現(xiàn)，過表達CkCAD的擬南芥株系木質(zhì)素含量是野生型擬南芥木質(zhì)素含量的2.15 倍（圖11）。

在干旱處理15 d 后，采集擬南芥葉片測定相關(guān)抗旱生理指標(biāo)及木質(zhì)素含量。發(fā)現(xiàn)過表達擬南芥株系丙二醛含量低于野生型約23%；相對電導(dǎo)率低于野生型約27%；而相對含水量高于野生型約32%（圖11）。以上結(jié)果說明，過表達CkCAD擬南芥較野生型擬南芥膜脂過氧化程度更低，膜完整性較高，保水能力較高而具有較強的抗旱性。

圖11 干旱脅迫下野生型和轉(zhuǎn)CkCAD 擬南芥抗旱性比較分析Fig.11 Comparison of drought resistance between wild-type and CkCAD-transformed Arabidopsis under drought stress

3 討論

苯丙烷代謝途徑是植物體內(nèi)一條重要的代謝途徑，包括木質(zhì)素合成途徑、異黃酮合成途徑和花青素合成途徑等，能夠產(chǎn)生木質(zhì)素、異黃酮、黃酮醇、花青素等參與植物生長發(fā)育和相應(yīng)非生物脅迫的重要次生代謝產(chǎn)物［7］。關(guān)于木質(zhì)素的研究多集中于木質(zhì)素生物合成途徑的改善［23］及木質(zhì)素資源開發(fā)和利用等方面［24］，研究人員通過對苯丙烷生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因進行突變和RNA 干擾，使其下游代謝物產(chǎn)物更適合用于生物燃料［25-26］。木質(zhì)素合成途徑的主要酶大多都已被克隆，并通過正向和反向遺傳學(xué)結(jié)合來研究它們的作用［27］。通過用苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）抑制劑 L-α-aminooxy-β-phenylpropanoic acid（AOPP）處理綠豆（Vigna ra?diata）苗時，明確了植物體內(nèi)木質(zhì)素含量降低會導(dǎo)致木質(zhì)部維管塌陷且植株生長遲緩［28-29］。且近年來研究表明，植物苯丙烷合成途徑關(guān)鍵酶基因及蛋白在干旱脅迫下表達量升高［10-11］且木質(zhì)素沉積增多。植物在干旱脅迫下體內(nèi)木質(zhì)素合成相關(guān)基因及木質(zhì)素合成途徑積極響應(yīng)干旱脅迫［30］。

本研究以檸條木質(zhì)素合成途徑下游關(guān)鍵酶基因CkCAD為研究對象，克隆得到1074 bp 的序列（圖1），編碼357 個氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為38.75 kDa，蛋白質(zhì)偏酸性且為親水性蛋白，氨基酸序列與其他物種相比高度保守（圖2）。構(gòu)建了35S：：CkCAD過表達載體（圖4），通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得過表達株系并進行干旱脅迫處理驗證CkCAD的抗旱功能。過表達CkCAD的擬南芥株系在干旱處理下生長狀態(tài)較野生型更好，同時轉(zhuǎn)CkCAD擬南芥株系#1、#3、#4 的株高和葉面積生長速率更高（圖7 和圖8），這表明CkCAD表達升高導(dǎo)致的木質(zhì)素含量增加有助于擬南芥抵御干旱環(huán)境。作為苯丙烷代謝途徑的主要分支之一，木質(zhì)素合成途徑能夠生成3 種不同的木質(zhì)素單體，在過氧化物酶和漆酶的作用下聚合成木質(zhì)素［31］，在植物中木質(zhì)素主要沉積在次級細胞壁中，不僅能夠增強植物體機械強度［32］，還能為導(dǎo)管的次級細胞壁提供剛性和疏水性，使它們能夠承受水分運輸所產(chǎn)生的負壓［8］。植物受到干旱脅迫時木質(zhì)部導(dǎo)管中形成栓塞而導(dǎo)致水分運輸中斷［33］，這已被認為是導(dǎo)致植物死亡的主要原因之一［34-35］，植物的抗栓塞性強弱與木質(zhì)化程度呈正相關(guān)［36-39］，植物木質(zhì)化程度越高，對栓塞的抵抗力越強［40］。在本研究中，采用乙酰溴法測定了野生型和過表達CkCAD擬南芥株系木質(zhì)素含量后發(fā)現(xiàn)，過表達CkCAD株系木質(zhì)素含量是野生型擬南芥木質(zhì)素含量的2.15 倍（圖10）。同時在經(jīng)過干旱脅迫處理后過表達CkCAD擬南芥株系表現(xiàn)出對干旱脅迫較強的耐受性，說明植物體通過提高木質(zhì)素合成，增加木質(zhì)化程度，從而提高對栓塞的抗性以更好地適應(yīng)干旱，這很可能是植物響應(yīng)干旱的一種策略。同樣在干旱脅迫下植物可通過促進葉脈發(fā)育，提高葉脈密度以增強對水分的吸收，提高水分運輸效率［41-43］。在本試驗中相較于野生型擬南芥，過表達CkCAD株系葉脈密度顯著提高，T3代轉(zhuǎn)CkCAD擬南芥植株的平均脈島長徑比野生型低33%，平均脈島短徑比野生型低35%，平均脈島密度比野生型高26%，平均葉脈長度比野生型高13%，平均葉脈密度比野生型高20%（圖8 和圖9），這可能是植物受到干旱脅迫的另一種響應(yīng)策略。

此外，結(jié)果表明過表達CkCAD株系具有更高的相對含水量和相對較低的丙二醛和相對電導(dǎo)率（圖10）。相對含水量可用于評估干旱脅迫下植物的水分狀況；膜的完整性和穩(wěn)定性對于植物的存活和抗逆性至關(guān)重要，丙二醛作為細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，是反映植物細胞膜脂過氧化的指標(biāo)；同時細胞膜遭到破壞，膜透性增大，導(dǎo)致細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，細胞提取液電導(dǎo)率增大，通過測定逆境脅迫下的相對電導(dǎo)率來評估細胞膜的完整性［21］。以上結(jié)果表明過表達CkCAD擬南芥具有更高的膜穩(wěn)定能力和滲透調(diào)節(jié)能力，從而增加對干旱脅迫的抗性。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得檸條CkCAD基因全長1074 bp，編碼357 個氨基酸，蛋白質(zhì)大小為38.75 kDa，與非洲相思豆、蒺藜苜蓿、大豆和花生的親緣關(guān)系較近，其中與非洲相思豆ApCAD 最為相似，蛋白質(zhì)偏酸性且為親水性蛋白，富含甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸、絲氨酸，不包含跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位于細胞質(zhì)中，蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和α 螺旋組成。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot 發(fā)現(xiàn)CkCAD及其酶蛋白在擬南芥中呈現(xiàn)穩(wěn)定表達。相較于Col-0 野生型擬南芥，過表達CkCAD擬南芥葉脈更為發(fā)達，脈島長徑、短徑、脈島密度更高，葉脈長度和葉脈密度更大、木質(zhì)素含量更高。干旱處理發(fā)現(xiàn)過表達植株的葉片萎蔫程度、丙二醛含量、相對電導(dǎo)率均低于野生型植株，而相對含水量則高于野生型植株。通過干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株抗旱能力的提高，證實檸條木質(zhì)素合成酶基因CkCAD過表達可以促進木質(zhì)素合成進而提高葉脈發(fā)達程度并提高膜穩(wěn)定性從而增強植物的抗旱性。