呂竑建 ，郭香 ，陳德奎 ，陳曉陽 *，張慶 *

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州510642；2. 華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院，廣東木本飼料工程技術研究中心，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東廣州510642）

辣木（Moringa oleifera）起源于喜馬拉雅，現(xiàn)廣泛種植于世界各地。辣木不僅可以適應多種環(huán)境，且能在較惡劣的環(huán)境下生長，年均生物量可以達到43～115 t·hm-2［1］。辣木作為功能性食品和飼料，不僅富含多種必需氨基酸，同時有高含量的維生素A、B、C 和E，更有黃酮和多酚類生物活性物質(zhì)，能對動物健康產(chǎn)生積極影響［2］。不僅如此，辣木含有較高含量的粗蛋白和較低的纖維含量，使辣木可以開發(fā)成高質(zhì)量的植物性蛋白質(zhì)飼料［1，3］。近年來，有很多研究表明，在飼料中添加辣木可以提高動物生產(chǎn)性能或改善動物健康。Kholif 等［4］發(fā)現(xiàn)用辣木替代部分苜蓿（Medicago sativa），可以提高哺乳期山羊的飼料消化率和產(chǎn)奶量，改善瘤胃發(fā)酵。Sebola 等［5］報道在肉雞飼料中添加辣木葉粉可以提高肉雞生長性能和胴體品質(zhì)。Babiker 等［6］報道辣木葉可以作為飼料蛋白源補充和提高生長期的綿羊和山羊的生長性能。此外，用辣木粉替代豆粕可以減少CH4的產(chǎn)生，以減少溫室氣體的排放［7］。然而，這些報道多為辣木葉粉的使用，較少出現(xiàn)辣木葉青貯的研究。辣木葉粉的制作增添了工序，且由于南方天氣常潮濕悶熱，不易于保存，辣木葉粉容易出現(xiàn)霉變。青貯的制作工藝簡便，直接使用原料制作大大降低了難度，且封裝后受環(huán)境因素影響小，還能降低植物性飼料中的抗營養(yǎng)因子［8］。眾所周知，乳酸菌在青貯發(fā)酵中具有極其重要的意義，青貯發(fā)酵質(zhì)量往往受青貯中乳酸菌數(shù)量和活性影響。乳酸菌作為一種發(fā)酵促進劑，能夠促進青貯初期盡快進入乳酸發(fā)酵階段，促進單糖物質(zhì)轉化為乳酸，使pH 迅速降低，同時抑制蛋白質(zhì)的水解作用，降低氨態(tài)氮，減少酵母菌和霉菌的滋生［9］。乳酸菌添加劑的有效性常被某些環(huán)境因素影響，環(huán)境溫度就是一個重要影響因素，同時發(fā)酵品質(zhì)也受環(huán)境溫度影響［10］。

由于中國南方常年高溫濕熱的天氣，對青貯飼料的制作與保存造成了一定的影響。因此，本試驗利用了辣木葉青貯里有潛力的優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株，重新添加到辣木葉青貯的制作中，并將青貯分別置于15 和30 ℃的環(huán)境中保存，以探究環(huán)境溫度和不同植物乳酸菌菌株對辣木葉青貯的發(fā)酵品質(zhì)與營養(yǎng)成分的影響，希望對辣木葉的青貯技術提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌的制備

試驗所用的辣木品種為PKM-1，來源于云南辣木種子資源庫，2019 年5 月于華南農(nóng)業(yè)大學試驗田人工采摘辣木葉。采葉后用鍘刀進行切割，長度約2 cm，將切碎的辣木葉混合均勻，按照試驗設計分裝至聚乙烯塑料袋（20 cm×30 cm）中，每袋約200 g，真空封口機抽真空并密封保存。參照Zhang 等［11］的研究，經(jīng)過60 d 青貯發(fā)酵后，分離出96 株乳酸菌菌株，并鑒定和篩選出4 個菌株，分別是Lactobacillus plantarum（LP），Lactobacillus far?ciminis（LF），Weissella thailandensis（W）和Lactococcus lactis（E）。緊接著進行第二部分的青貯試驗。

1.2 試驗設計

本試驗采用雙因素完全隨機設計，因素一為不同貯藏溫度，分別為15（T1）和30 ℃（T2）。因素二為添加不同的乳酸菌，添加量為 1×106cfu·g-1鮮樣（fresh matter，F(xiàn)M），分別為CK，LP，LF，W，E，將乳酸菌添加劑噴灑在切碎辣木葉上并混合均勻后裝袋，每組6 個重復，總共30 袋青貯。CK 為空白對照組，添加等量的蒸餾水并均勻混合后裝袋。青貯方法同上所述，每組隨機選取3 袋青貯辣木，分別放進溫度為15 和30 ℃的培養(yǎng)箱進行貯藏。在60 d 后進行開袋，對其化學成分和青貯品質(zhì)進行測定分析。各個試驗指標的測定方法均參照王成等［12］的研究，并在其方法上做適當?shù)难a充和修改。

1.3 試驗指標測定

1.3.1 發(fā)酵品質(zhì)及微生物計數(shù)測定方法 pH 值的測定方法：開袋時，取混勻后的青貯樣品20 g，加入180 mL蒸餾水，混合均勻，用榨汁機榨汁1 min，4 層紗布過濾后再用中速定性濾紙過濾，得到浸提液，采用pH 計測量pH 值［13］。

干物質(zhì)（dry matter，DM）測定方法：將辣木葉片混合均勻后，隨機取樣稱重置于65 ℃恒溫烘箱中，烘至絕干后再稱重，干物質(zhì)含量=絕干樣重量/鮮樣重量。

乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌和霉菌的數(shù)量測定方法：隨機取混勻后葉片樣品20 g，加入180 mL 無菌的生理鹽水，充分振蕩均勻后逐級稀釋。以平板計數(shù)法測定各微生物數(shù)量，乳酸菌采用MRS 瓊脂培養(yǎng)基［每升配方：蛋白胨 10.0 g；牛肉浸粉5.0 g；酵母提取物 4.0 g；葡萄糖20.0 g；吐溫-80，1.0 mL；磷酸氫二鉀2.0 g；乙酸鈉 5.0 g；檸檬酸三銨2.0 g；七水合硫酸鎂0.2 g；四水合硫酸錳0.05 g；瓊脂15.0 g；最終pH（6.2±0.2）］，大腸桿菌采用結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基［每升配方：蛋白胨7.0 g；酵母提取物3.0 g；乳糖10.0 g；氯化鈉5.0 g；膽汁鹽3 號1.5 g；中性紅0.03 g；結晶紫0.002 g；瓊脂15.0 g；最終pH 值（7.4±0.2）］，酵母菌和霉菌采用孟加拉紅（虎紅）培養(yǎng)基（每升配方：蛋白胨5.0 g；葡萄糖10.0 g；磷酸氫二鉀1.0 g；七水合硫酸鎂0.5 g；瓊脂15.0 g；孟加拉玫瑰紅0.033 g；氯霉素0.1 g）。培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

有機酸的測定方法：采用島津GC-14 型高效液相色譜儀（色譜柱：Shodex Rspak KC-811 s-DVB gel column，日本；檢測器：SPD-M10AVP）測定乳酸（lactic acid，LA），乙酸（acetic acid，AA）含量［14］。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量與纖維含量的測定 粗蛋白質(zhì)（crude protein，CP）測定方法：按照凱氏定氮法［15］，稱量0.5 g 辣木葉干粉，加入濃硫酸和催化劑（硫酸鉀和硫酸銅）消煮完成后，用凱氏定氮儀（FOSS，Kjeltec 8400，丹麥）測定粗蛋白質(zhì)含量。

非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）測定方法：三氯乙酸沉淀法。稱取0.5 g 發(fā)酵前后樣品的辣木葉干粉，用15%三氯乙酸溶液充分浸泡，用定量濾紙過濾，無損地取得過濾后的殘渣，殘渣連同濾紙烘干后，按照粗蛋白質(zhì)測定方法，用凱氏定氮儀測定含氮量，即非蛋白氮的含量［16］，真蛋白質(zhì)（true protein，TP）的含量經(jīng)公式計算得出：TP=CP-NPN。

氨態(tài)氮（ammonium nitrogen，NH3-N）測定方法：苯酚-次氯酸鈉比色法［17］。配制以絕干（NH4）2SO4為標準品的標準銨溶液，并制作標準曲線，經(jīng)預試驗后，向適量樣品浸提液加入5 mL 苯酚溶液和4 mL 次氯酸鈉溶液，置于95 ℃恒溫水浴鍋反應5 min，冷卻后于630 nm 波長下測OD 值，計算得出含量。

游離氨基酸氮（free amino acid，F(xiàn)AA）測定方法：茚三酮-硫酸肼比色法［18］。

纖維含量的測定：按照范氏纖維法［19］測定，計算得出酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）和中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）的含量。

1.3.3 單寧含量的測定 水解單寧測定方法：用70%丙酮充分混勻浸泡辣木葉樣品干粉，并用超聲波處理1 h，使其充分浸提，將渾濁液用高速離心機8000 r·min-1離心10 min 并收集上清液，制作以沒食子酸為標準品的標準曲線，采用Folin-Ciocalteu 試劑比色法［20］測定總酚和簡單酚含量，水解單寧含量=總酚含量-簡單酚含量。

縮合單寧測定方法：稱取20 mg 辣木葉干粉樣品加10 mL 丙酮-丁醇-氯化氫試劑，充分振蕩混勻，置于70 ℃恒溫水浴鍋中反應2.5 h，冷卻后用高速離心機8000 r·min-1離心5 min，在554 nm 波長下測OD 值，制作以原花青素為標準品的標準曲線，計算縮合單寧含量［20］。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 19.0 進行雙因素方差分析（Two-way ANOVA），兩個因素互作時用Duncan 氏對各組進行多重比較，P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 辣木葉原料

表1 展示了辣木葉原料的特性。辣木葉原料的干物質(zhì)含量為21.59%，CP 含量為25.31%DM，NDF 和ADF的含量分別為24.91%DM 和16.66%DM。WSC 含量為7.53%DM。水解單寧與縮合單寧的含量分別為1.62%DM 和2.48%DM。原料中微生物含量較豐富，乳酸菌、大腸桿菌和霉菌的數(shù)量分別為4.45，5.99 和2.80 log10cfu·g-1FM。

2.2 辣木葉青貯60 d 的青貯品質(zhì)

由表2 可知，辣木葉青貯60 d，T2溫度組的干物質(zhì)含量顯著高于T1溫度組（P＜0.05）。T1、T2溫度組添加植物乳酸菌后，pH 值均顯著下降（P＜0.05），但T1和T2溫度組的pH 值無顯著差異。T1溫度組的乳酸和乙酸含量，在添加植物乳酸菌后均有顯著升高（P＜0.05）；而T2溫度組的乳酸和乙酸含量僅在添加W 和E 時顯著提升（P＜0.05）。T2溫度組乳酸和乙酸含量均顯著高于 T1溫度組（P＜0.05）。T1溫度組乳酸菌數(shù)量在添加植物乳酸菌W 和E 后顯著降低（P＜0.05）。T1溫度組的乳酸菌數(shù)量顯著高于T2溫度組（P＜0.05）。方差分析結果表明，溫度對除pH 外的指標均有極顯著影響（P＜0.01），乳酸菌添加劑對除DM 外各個指標均有極顯著影響（P＜0.01），二者的交互作用對pH 值和乳酸、乙酸含量均有顯著影響（P＜0.05）。

表1 辣木葉原料的特點Table 1 The characteristic of raw M. oleifera leaves material（n=3）

表2 植物乳酸菌和貯藏溫度對60 d 青貯辣木葉品質(zhì)的影響Table 2 Effect of temperature and inoculants on character of M.oleifera leaves silage in 60 days（n=3）

2.3 辣木葉青貯60 d 的營養(yǎng)成分

由表3 可知，T1溫度組在添加植物乳酸菌LP 和LF 時CP 含量顯著降低（P＜0.05）。T2溫度組在添加植物乳酸菌LF 和E 時CP 含量顯著降低（P＜0.05）。T1、T2溫度組的NH3-N 含量在添加植物乳酸菌后顯著下降（P＜0.05）。TI溫度組的FAA 含量在添加植物乳酸菌后顯著上升（P＜0.05）。T1溫度組的TP 含量顯著高于T2溫度組（P＜0.05）。T1溫度組的NPN、NH3-N 和FAA 含量均顯著低于T2溫度組（P＜0.05）。方差分析結果表明，溫度對TP、NPN、NH3-N 和FAA 含量均有極顯著影響（P＜0.01），乳酸菌添加劑對CP 和NH3-N 的含量有極顯著影響（P＜0.01），二者的交互作用對 CP、NH3-N 和 FAA 均有極顯著影響（P＜0.01），對 NPN 有顯著影響（P＜0.05）。

表3 植物乳酸菌和貯藏溫度對60 d 青貯辣木葉纖維和蛋白含量的影響Table 3 Effect of temperature and inoculants on protein and fibre content of M.oleifera leaves silage in 60 days（n=3）

2.4 辣木葉青貯60 d 的單寧含量

由表4 可知，T2溫度組在添加植物乳酸菌E 后，總酚含量顯著下降（P＜0.05）。T1溫度組在添加植物乳酸菌E 后，水解單寧含量顯著升高（P＜0.05）。通過方差分析，植物乳酸菌對簡單酚和縮合單寧的含量有顯著影響（P＜0.05），溫度與植物乳桿菌的交互作用對總酚和水解單寧的含量有顯著影響（P＜0.05）。

3 討論

3.1 辣木葉原料的特點

本試驗中辣木葉原料的CP 含量較高，為25.31%DM，高于王成等［12］報道的16.72%，略低于劉昌芬等［21］研究中的 27.5%DM。NDF 和 ADF 含量分別為 24.91%DM 和 16.66%DM，均低于 Wang 等［22］的報道。原料營養(yǎng)成分含量的不同，可能是由于不同的地理位置、氣溫、品種和作物生長期等因素［12］。辣木原料的WSC 含量較高（7.53%DM），達到了張慶［23］報道的制作優(yōu)質(zhì)青貯飼料并良好保存的標準。但是原料中的乳酸菌數(shù)量沒達到Cai等［24］報道的良好青貯飼料的標準（＞5.0 log10cfu·g-1），而且較高數(shù)量的大腸桿菌（5.99 log10cfu·g-1）可能會影響青貯辣木葉的品質(zhì)。

表4 植物乳酸菌和貯藏溫度對60 d 青貯辣木葉單寧含量的影響Table 4 Effect of temperature and inoculants on tannins content of M.oleifera leaves silage in 60 days（n=3）

3.2 辣木葉青貯60 d 品質(zhì)

青貯飼料的pH 值是用來衡量青貯品質(zhì)的一個重要指標，尤其是對于高水分含量的青貯。當青貯飼料pH 值低于4.2 時，往往認為青貯飼料能得到良好的發(fā)酵效果，而pH 值高于4.2 時，常出現(xiàn)更多的腐敗現(xiàn)象［25］。在本試驗中，所有青貯辣木葉的組別的pH 值均低于4.2，由此可見辣木是一種易于達到良好青貯品質(zhì)的木本飼料。

由于辣木的原料有較多有害微生物，且原料的乳酸菌數(shù)量較少，添加乳酸菌可使青貯飼料快速積累乳酸且降低pH 值，并在青貯早期抑制有害微生物的生長［24，26］。本試驗中，添加乳酸菌后，pH 值顯著下降，LA 含量顯著提高，且有害微生物僅在個別組出現(xiàn)。與此同時，添加乳酸菌使NH3-N 含量顯著降低。NH3-N 含量一般反映著青貯飼料蛋白質(zhì)降解的水平，含量降低說明蛋白質(zhì)組分得到了較好的保存，原因可能是加菌處理組相對較低的pH值。乳酸菌數(shù)量在添加乳酸菌添加劑后出現(xiàn)下降。根據(jù)Ohmomo 等［27］的報道，很多乳酸菌菌株在pH 值低于4.0的環(huán)境下有較弱的耐受性，本試驗中處理組的pH 值全部低于4.0，可能是乳酸菌數(shù)量減少的原因。值得一提的是，添加乳酸菌后AA 含量顯著提升，提升量不大，雖然AA 常由LA 的分解產(chǎn)生，但因為添加乳酸菌后，LA 的大量積累，所以能解釋AA 含量的少量提高，且青貯飼料里含有適量的AA，可以抑制酵母菌生長，提高有氧穩(wěn)定性。然而，T2組的有機酸含量顯著高于T1組，兩組的pH 值卻沒有顯著差異，一般來說，有機酸含量直接影響pH 值高低，這可能是由于蛋白降解在T2組比較多，造成T2組有較強的緩沖能力，所以更多的有機酸卻不能得到更低的pH 值?？偟膩碚f，添加乳酸菌后能改善青貯辣木的發(fā)酵品質(zhì)，減少有害菌產(chǎn)生，并有利于乳酸等有機酸積累，這些結果與玉柱等［28］和田瑞霞等［29］的研究報道一致。

貯藏溫度是影響青貯品質(zhì)的一個重要因素，同時也影響著乳酸菌添加劑的活性和效果［10，30］。T2溫度組的乳酸菌數(shù)量顯著低于T1溫度組，且降低了TP 含量。同時，T2溫度組的NPN、NH3-N 和FAA 含量均顯著高于T1溫度組。說明較高的環(huán)境溫度容易導致比較明顯的蛋白質(zhì)降解。Liu 等［30］也報道了相似的結果，在15 ℃的貯藏溫度下，青貯飼料擁有更好的發(fā)酵品質(zhì)，包括更低的NH3-N 含量。青貯飼料中NH3-N 的積累常由植物蛋白酶的合成活性影響［31］?？赡苤参锏鞍酌冈谳^高溫度時的水解活性更高，導致了青貯飼料里NH3-N 含量更高［32］。

綜上所述，添加植物乳酸菌和較低的貯藏溫度顯然能帶來更好的辣木葉青貯品質(zhì)和良好的營養(yǎng)成分的保存。

3.3 辣木葉青貯60 d 單寧含量

植物單寧又稱植物多酚或者鞣酸，根據(jù)結構可以分為縮合單寧和水解單寧，味苦澀，適口性差，可與蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生反應，降低動物消化率，甚至還存在毒害動物的風險［33］。降低單寧的抗營養(yǎng)作用，可通過多種手法解決，而通過微生物分解木本飼料中的單寧則是常用手段之一［34］。本試驗中，通過青貯發(fā)酵，無論是否加菌，都發(fā)現(xiàn)單寧含量相比原料下降，在T1溫度組下更為明顯。這可能是由于青貯飼料中的微生物產(chǎn)生了單寧酶［35］，對辣木中的單寧產(chǎn)生了一定程度降解。單寧酶活性受pH 影響很大，最適pH 為6.0～6.5，本試驗pH 值相對較低，可能影響了單寧酶的活性，導致單寧含量的變化不顯著［12，19］。

4 結論

辣木葉營養(yǎng)價值較高，適合作為動物飼料蛋白源的補充。青貯時添加植物乳酸菌，可以改善青貯品質(zhì)，并對營養(yǎng)成分有更好的保留。結果顯示乳酸菌幫助辣木葉青貯降低pH 值，提升乳酸含量，而較低的貯藏溫度可以減少蛋白質(zhì)分解，降低了非蛋白氮，氨態(tài)氮和游離氨基酸等含量。通過添加乳酸菌青貯，可以降低辣木葉中的單寧含量，但影響不顯著。