張俊哲　賈強　陳柯宇　王駿哲

摘要：文章旨在介紹一種基于CCD的全自動循環(huán)腫瘤細胞檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要采用多路閥控制實驗進程，通過對血液中過量表達EpCAM的細胞進行分離富集，然后經(jīng)過免疫化學染色，通過CCD攝像頭來將采集到的多重熒光成像的圖像傳遞給LabView進行處理，根據(jù)圖像表征的不同來確定是否為循環(huán)腫瘤細胞以及檢測個數(shù)并對其進行相關(guān)圖像特性的分析。

關(guān)鍵詞：CCD;循環(huán)腫瘤細胞;免疫熒光染色;LabView平臺;圖像處理

中圖分類號：TP311? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1009-3044（2021）06-0186-03

Abstract： This paper is aimed to introduce an automatic detecting system for circulating tumor cells（CTCs） based on CCD. This system mainly employs multi-way valve to control the whole experimental process， with separating and enriching the overexpressed EpCAM cells in blood， then using immunohistochemical stain for cells. CCD Cameras are used to collect multiple fluorescence images of staining cells and LabView analyzes those cell image. The characterizations of images are used to determine whether the cells are CTCs and the number of CTCs， following the analysis of associated biochemical characteristics.

Key words： CCD; Circulating tumor cells; immunohistochemical staining; LabView; image process

1 背景

利用多重免疫熒光染色原理進行循環(huán)腫瘤細胞的鑒別，在目前針對循環(huán)腫瘤細胞檢測的研究中得到廣泛的應用[1]。在循環(huán)腫瘤細胞檢測研究中，利用標記了熒光素的抗體與細胞表面的抗原特異結(jié)合，使細胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)不同的熒光，進而鑒別和檢測循環(huán)腫瘤細胞并進行細胞相關(guān)的生化分析[2]。因此細胞染色成像結(jié)果的不同對于鑒別和檢測循環(huán)腫瘤細胞具有重要的作用。傳統(tǒng)的免疫熒光染色方式是人為通過細胞樣品準備、固定、封閉、一抗孵育、二抗孵育等一系列實驗過程進行操作，不但復雜煩瑣，而且耗時耗力，不能保證染色效果[3]。本系統(tǒng)利用多路閥控制樣品和試劑的注入和抽出，保證染色過程的反應時間和效果，并用攝像頭采集染色得到的多重熒光成像圖傳遞給LabView進行分析，從而達到自動鑒別循環(huán)腫瘤細胞并計數(shù)的目的。

2 三重免疫熒光染色原理

三重免疫熒光染色是建立在免疫學、生物化學和顯微鏡技術(shù)基礎(chǔ)上，結(jié)合抗原抗體反應的特異性與熒光物質(zhì)檢測的敏感性和直觀性形成的一種染色技術(shù)[4]。其主要原理是通過抗原抗體之間的特異性識別作用與熒光物質(zhì)檢測的敏感性來顯示目的細胞。通過免疫或者生物化學的方法將不同熒光素標記在特異性抗體上，使之成為熒光抗體[5]。在一定條件下熒光抗體與細胞表面的抗原特異結(jié)合，在一定波長的光照下，結(jié)合在細胞表面的不同熒光素發(fā)出不同波長的熒光[6]，通過熒光顯微鏡即可觀察到細胞多重熒光成像圖，進而鑒別循環(huán)腫瘤細胞。

三重熒光染色的步驟通常分為細胞樣品準備、固定細胞、封閉、一抗孵育、二抗孵育、三重染色[7]。人工染色不僅容易污染實驗，導致實驗成像誤差較大，難以鑒別循環(huán)腫瘤細胞，而且耗時耗力。因此，我們設(shè)計出一種基于CCD攝像頭的全自動循環(huán)腫瘤細胞檢測系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)人工操作模式，通過多路閥來控制不同熒光染色試劑的自動注入與抽出，保證細胞染色過程的反應時間和效果，并將CCD攝像頭采集到的細胞多重熒光成像圖用LabView軟件進行分析，進而達到識別、定位和計數(shù)循環(huán)腫瘤細胞的目的。

3 系統(tǒng)設(shè)計

3.1 硬件設(shè)計

本系統(tǒng)硬件設(shè)計主要包括PC、主控模塊、電機模塊、多路閥模塊、CCD攝像頭模塊五部分。如圖1所示。

PC發(fā)出指令，主控模塊得到命令驅(qū)動電機工作，進而操縱多路閥控制不同熒光染色試劑和待染色樣本的注入及抽取，并通過軟件實時控制不同試劑的反應時間，以確保三重熒光染色步驟每一步的準確性和無污染性。待染色結(jié)束后，CCD攝像頭自動采集多重熒光染色成像并傳遞給PC端的LabView進行圖像處理分析，最終鑒別是否為循環(huán)腫瘤細胞并計數(shù)，達到自動檢測循環(huán)腫瘤細胞的目的。

3.2 軟件設(shè)計

本系統(tǒng)軟件設(shè)計是利用人機交互界面的LabView程序結(jié)合STM32系列微控制器的程序來設(shè)計，軟件設(shè)計流程圖如圖2所示：

3.2.1 樣本三重熒光染色編程模塊

樣本三重熒光染色的程序主要實現(xiàn)不同試劑的注入與抽出及相應反應時間的控制，其主要程序中的部分代碼如圖3所示：

3.2.2 圖像采集編程

PC端控制CCD攝像頭采集三重熒光染色圖像的程序模塊如圖4所示，主要有以下幾個步驟：

1）使用IMAQ Create.vi來創(chuàng)建采集的圖形存儲空間;

2）使用IMAQdx Open Camera.vi來打開CCD攝像頭;

3）使用IMAQdx Snap.vi來獲取CCD攝像頭采集的圖像;

4）使用IMAQdx Close Camera.vi來關(guān)閉CCD攝像頭。

3.2.3 圖像處理編程

LabView對循環(huán)腫瘤細胞三重熒光染色成像進行圖像處理的模塊如圖5所示，對采集到的熒光圖像進行的處理主要包括以下幾個步驟：

1）圖像濾波處理， 圖像濾波主要是針對采集到的圖像亮暗對比度不夠明顯的情況，主要使用IMAQ Convolute.VI來實現(xiàn);

2）圖像區(qū)域閾值處理，圖像區(qū)域閾值處理主要是對區(qū)域中的閾值進行計算。主要使用IMAQ AutoBThreshold 2. VI來實現(xiàn);

3）圖像形態(tài)轉(zhuǎn)換處理，圖像形態(tài)轉(zhuǎn)換處理主要借由改變圖素價值在圖像中修正特征的形狀。主要使用IMAQ Morphology.VI 來實現(xiàn);

4）圖像填充處理，圖像填充主要是針對粒子中不規(guī)則的部分進行填充處理，主要使用IMAQ FillHole.VI來實現(xiàn);

5）圖像邊緣去除處理，圖像邊緣去除處理主要是針對圖像邊緣粒子的清理。主要使用IMAQ RejectBorder.VI來實現(xiàn);

6）圖像粒子過濾處理，圖像粒子過濾主要是針對根據(jù)過濾器標準除去圖像中的粒子，主要利用IMAQ Particle Filter3.VI來實現(xiàn);

7）圖像計數(shù)功能處理。圖像計數(shù)功能主要是對二進位圖像中檢測到的粒子進行計數(shù)和分析，主要利用IMAQ Particle Analysis.VI來實現(xiàn)。

3.2.4 圖像結(jié)果檢測

關(guān)聯(lián)對比選定區(qū)域中經(jīng)過LabView圖像處理之后的三個階段的細胞熒光圖像后，得出結(jié)論并顯示相應的結(jié)果[8]。其模塊如圖6所示。主要有以下三個步驟：

1）區(qū)域坐標定位，區(qū)域坐標定位主要是針對圖像中特定區(qū)域內(nèi)的細胞進行定位，主要采用自定義模塊IMAQ RegionCoordinatePosition.vi來實現(xiàn);

2）顏色匹配，顏色匹配主要是針對圖像中特定區(qū)域內(nèi)的粒子顏色進行匹配，主要采用IMAQ MatchColorPattern.vi來實現(xiàn);

3）區(qū)域?qū)Ρ扰卸ǎ瑓^(qū)域?qū)Ρ炔⑴卸ㄖ饕轻槍D像中特定區(qū)域進行對比并判定結(jié)果，主要采用自定義模塊IMAQ RegionComparisonDetermination.vi來實現(xiàn)。

3.2.5 串口通信編程

串口通信的程序模塊如圖7所示，對于三重熒光染色操作、染色圖像采集操作，所需的相關(guān)數(shù)據(jù)傳輸至下位機中，而下位機相關(guān)反饋數(shù)據(jù)則會被傳輸?shù)缴衔粰CPC端[9]，主要有以下三個步驟：

1）使用VISA Configuration Serial Port.vi來對串口進行初始化操作;

2）使用VISA Read.vi和VISA Write.vi來對串口數(shù)據(jù)的讀取和寫入;

3）使用VISA Close.vi關(guān)閉串口。

4 實驗結(jié)果

系統(tǒng)完成后，將需要進行鑒別和計數(shù)的腫瘤細胞樣本放入系統(tǒng)平臺上進行三重免疫熒光染色處理。系統(tǒng)運行結(jié)果如下圖8、圖9所示，其中圖8第一行為循環(huán)腫瘤細胞三重免疫熒光成像圖，第二行是LabView進行圖像處理過程后的圖，第三行是經(jīng)過LabView處理完成之后的計數(shù)及定位圖，圖9是CTCs全自動檢測平臺界面圖。

5 結(jié)束語

本文利用循環(huán)腫瘤細胞三重免疫熒光染色原理，采用CCD攝像頭結(jié)合LabView平臺設(shè)計出循環(huán)腫瘤細胞染色及圖像檢測處理自動化系統(tǒng)，實驗結(jié)果表明系統(tǒng)可以實現(xiàn)方便快捷以及準確無污染的染色檢測分析平臺。整個系統(tǒng)操作便捷，工作穩(wěn)定，精確無污染，可節(jié)省大量人力成本以及人工操作導致的誤差，具有極大的實用價值。

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【通聯(lián)編輯：謝媛媛】