陳海元 朱曉妹 張所兵 張云輝 方先文

摘要：通過甲基磺酸乙酯（EMS）誘變水稻品種南粳46，發(fā)現(xiàn)2個可以穩(wěn)定遺傳的葉片卷曲變窄的突變體rnl1-1（rolling and narrow leaf1-1）和rnl1-2。與野生型相比，突變體從苗期開始表現(xiàn)出葉片卷曲變窄的表型，一直持續(xù)到成熟期。此外，突變體抽穗期延遲，株高、穗長、劍葉長、劍葉寬、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、粒厚、每穗粒數(shù)和粒寬均顯著降低。遺傳分析表明，突變體的突變表型受1對隱性基因控制。利用rnl1-1與秈稻品種Dular雜交建立F2群體，將該基因定位在水稻第12染色體長臂上的InDel標(biāo)記HF36和HF43之間約277 kb 的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間內(nèi)NRL2基因突變引起的表型與rnl突變體相似，測序發(fā)現(xiàn)rnl1-1突變體中RNL2基因的第1708位核苷酸由C突變?yōu)門，使得編碼的氨基酸由絲氨酸突變成脯氨酸;rnl1-2突變體中RNL2基因的第2011位核苷酸由G突變?yōu)锳，使得編碼的氨基酸由精氨酸突變成甘氨酸。

關(guān)鍵詞：水稻;葉片卷曲變窄;突變體;基因定位;NRL2

中圖分類號：S511.01 文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2021）02-0037-06

收稿日期：2020-04-10

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20180309）。

作者簡介：陳海元（1988—），男，江蘇徐州人，博士，助理研究員，主要從事水稻基因功能解析及分子設(shè)計育種研究。Tel：（025）84390321;E-mail：15150530179@163.com。

通信作者：方先文，博士，研究員，主要從事水稻品種資源研究。Tel：（025）84390321;E-mail：2431240491@qq.com。

細胞壁決定了植物的株型、生長、發(fā)育以及對生物和非生物脅迫的響應(yīng)，纖維素、半纖維素和果膠是植物細胞壁的主要成分[1]。高等植物中，纖維素由β-1，4-葡聚糖鏈組成，在細胞膜上由纖維素酶復(fù)合體合成。復(fù)合體包括6個亞基，一般含有36個纖維素合成酶蛋白分子[2]。纖維素合酶（cellulose synthase，簡稱CESA）屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族2，具有8個跨膜結(jié)構(gòu)域，其中2個跨膜域靠近N端，6個跨膜域靠近C端，中間為保守的“D，D，D，QXXRW”基序和糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域[3]。纖維素合成酶類似蛋白（cellulose synthase-like，簡稱CSL）參與半纖維素骨架的合成，CSL蛋白與 CESA蛋白的序列高度同源，被分為9個亞族：CSLA～H 和 CSLJ[4]。一些CSL家族的功能已經(jīng)被闡明，CSLA家族成員編碼甘露聚糖合成酶[5]，CSLC 與木葡聚糖合成相關(guān)[6]，CSLF和CSLH家族參與多種葡聚糖的合成[7-8]。CSL亞家族中，CSLD與CESA亞族高度相似，因此認(rèn)為CSLD可能與纖維素合成酶功能相似[9]。擬南芥KOJAK/AtCSLD3是第1個被克隆的CSLD亞族成員，參與早期根毛的發(fā)育[10-11]。AtCSLD2參與晚期根毛的發(fā)育[12]。AtCSLD1和AtCSLD4參與纖維素的沉積和花粉管的生長[13]。玉米ZmCSLD1對于細胞分裂至關(guān)重要，zmcsld1突變體中細胞變小且數(shù)目減少，導(dǎo)致器官變窄[14]。水稻CSLD亞族共有5個成員，其中OsCSLD1是KOJAK/AtCSLD3的同源基因，參與水稻根毛的發(fā)育[15]。OsCSLD4參與細胞壁的形成和植株生長[16-21]。

本研究通過甲基磺酸乙酯（EMS）誘變粳稻品種南粳46，獲得2個穩(wěn)定遺傳的葉片卷曲變窄突變體，從表型、遺傳等方面明確突變體的遺傳特性，并對突變基因進行精細定位、基因測序與突變位點分析。通過對該突變體的研究，有利于進一步了解水稻株型的分子機制，為株型育種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

通過EMS誘變粳稻品種南粳46，鑒定出2份水稻葉片卷曲變窄的突變體，依據(jù)表型分別將其命名為rnl1-1和rnl1-2。經(jīng)過多代自交后，rnl1-1和rnl1-2突變體葉片卷曲變窄的性狀被穩(wěn)定遺傳。

1.2農(nóng)藝性狀考察

2018年5月中旬，將野生型（WT）和rnl1-1和rnl1-2播種，1個月后移栽于大田，期間考察苗期性狀。正常水肥條件下生長至黃熟期，隨機選取野生型和rnl1-1突變體各10株，考察株高、分蘗數(shù)、劍葉長寬、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、粒長、粒寬和粒厚等農(nóng)藝性狀。

1.3遺傳分析與基因定位

2017年南京正季以rnl1-1突變體為母本，分別與野生型、粳稻品種中花11（ZH11）和秈稻品種Dular雜交獲得F1代種子，隨后在海南加代，獲得用于遺傳分析和基因定位的F2群體的種子，F(xiàn)2群體于2018年南京正季種植。rnl1-1與野生型、ZH11及Dular雜交構(gòu)建F2群體，統(tǒng)計其葉片卷曲變窄的植株和葉片正常植株的比率，并用卡方測驗分析統(tǒng)計結(jié)果。在rnl1-1與Dualr雜交構(gòu)建的F2群體中，篩選隱性極端個體687個，用于連鎖分析與基因定位。首先選取10個極端個體，用均勻分布在水稻12條染色體上的南粳46和Dular之間多態(tài)性好的簡單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記進行連鎖分析，對突變基因進行初定位。在初定位區(qū)間內(nèi)，尋找其他有多態(tài)的SSR標(biāo)記或者InDel標(biāo)記，分析其他極端個體，完成突變基因的精細定位。

1.4突變基因的鑒定與驗證

通過水稻基因組注釋計劃（Rice Genome Annotation Project，https：//rapdb.dna.affrc.go.jp）對精細定位區(qū)間內(nèi)的基因進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)區(qū)間內(nèi)存在1個已經(jīng)報道的葉片發(fā)育相關(guān)基因NRL2（Os12g0555600），因此開發(fā)了8對引物對2個rnl1突變體中Os12g0555600基因的基因組（包含啟動子和基因編碼區(qū)）進行測序，并與野生型序列進行比對，并在定位群體中隨機挑選10個隱性極端個體對突變位點進行驗證。

2結(jié)果與分析

2.1突變體的表型分析

rnl1-1和rnl1-2突變體在苗期時葉片就表現(xiàn)出卷曲變窄的表型（圖1-A、圖1-E、圖1-F），分蘗期時不同葉位的葉片也表現(xiàn)出類似的表型（圖1-B、圖1-C、圖1-D、圖1-G）。

rnl1-1突變體的抽穗期比野生型延遲約9 d（圖2-A，圖3），成熟期時的株高較野生型也明顯下降（約下降20 cm，圖2-B）。對野生型和rnl1-1突變體主莖的穗子和各個節(jié)間長度進行比較，發(fā)現(xiàn)rnl1-1突變體的穗長和各個節(jié)間的長度較野生型都顯著降低，第1節(jié)間和第2節(jié)間長度的減少是導(dǎo)致突變體株高下降的主要原因（圖2-C、圖2-D）。

對野生型和rnl1-1突變體的其他農(nóng)藝性狀進行分析，發(fā)現(xiàn)rnl1-1突變體的株高、穗長、劍葉長、劍葉寬、每穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、粒寬和粒厚較野生型都顯著下降，而粒長和結(jié)實率沒有明顯變化（圖3）。

2.2遺傳分析

將rnl1-1分別與野生型、粳稻品種ZH11和秈稻品種Dular雜交，其F1的葉片發(fā)育正常。rnl1-1/WT、rnl1-1/ZH11和rnl1-1/Dular的F2群體中，葉片卷曲變窄的植株與葉片正常發(fā)育的植株的比率符合3 ∶1的分離比（表1），表明葉片卷曲變窄的表型受1對隱性基因控制。

2.3連鎖分析與精細定位

用rnl1-1和Dular作為DNA模板，用463對SSR引物進行多態(tài)性分析，得到155對多態(tài)性較好的引物，多態(tài)性頻率為33.48%。用這些引物對rnl1-1/Dular F2群體中隨機挑選的10個與突變體表型相似的極端個體進行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)突變基因與水稻第12染色體長臂上的2個分子標(biāo)記RM519和RM6947緊密連鎖。根據(jù)已經(jīng)公布的日本晴和9311DNA序列，在此區(qū)間內(nèi)又開發(fā)了3個多態(tài)性好的標(biāo)記HF36、HF43和RM28466（表2）。

2.4候選基因分析

對定位區(qū)間內(nèi)的基因進行分析，發(fā)現(xiàn)NRL2基因的突變表型與rnl1-1相似，因此對rnl1-1突變體中的NRL2基因進行測序，結(jié)果顯示，rnl1-1突變體中RNL2基因的第1 708位核苷酸由C突變?yōu)門，使得編碼的氨基酸由絲氨酸突變成脯氨酸;rnl1-1 突變體中RNL2基因的第2011位核苷酸由G突變?yōu)锳，使得編碼的氨基酸由精氨酸突變成甘氨酸。從rnl1-1/Dular F2群體中隨機挑選的10個極端個體進行混池測序，結(jié)果表明10個極端個體的RNL2基因具有與rnl1-1相同的突變位點。

利用這些標(biāo)記對rnl1-1/Dular F2群體中的576個極端個體進行分析，最終將突變基因限定在分子標(biāo)記HF36和HF43之間，物理距離約為277 kb（圖4-A）。

3討論與結(jié)論

水稻OsCSLD4/NRL1基因是CSLD家族的一員，主要在快速生長的器官（如根、葉和穗）中高度表達[17-18]。進一步研究表明，OsCSLD4正在分裂細胞的M期特異表達[20]，其蛋白定位于高爾基體中[16]。OsCSLD4/NRL1SLE1基因在細胞壁的生物合成及植株的生長發(fā)育中起關(guān)鍵作用。通過不同的方法已經(jīng)鑒定出了一些該基因的突變體，這些突變體的共同特征是植株矮化，葉片卷曲變窄。此外，由于誘變材料背景或者基因突變位點的不同（表3），不同突變體的表型也有一定的差異。nd1突變體中，2 894位點核苷酸C-T的突變使編碼的氨基酸發(fā)生 Ala-Val 的替換，導(dǎo)致莖和根的初生細胞壁結(jié)構(gòu)均異常，株高降低，葉片卷曲變窄[16]。nrl1突變體中，2 431～2 489位點缺失59 bp核苷酸，使得編碼的蛋白質(zhì)部分氨基酸移碼突變和提前終止，除了株高降低和葉片卷曲變窄外，突變體還表現(xiàn)出葉片夾角增大、根系發(fā)育異常和結(jié)實率顯著下降[17]。nrl1-1變體中，592位點核苷酸T-C的突變使編碼的氨基酸發(fā)生Leu-Ser的替換;nrl1-2變體中，1 314位點核苷酸G-A的突變使編碼的氨基酸發(fā)生Ala-Thr的替換;nrl1-3突變體中，3 360位點核苷酸 G-A 的突變使翻譯提前終止，3個突變體的葉片都卷曲變窄，株高有不同程度的下降[18]。cd1突變體中，396～397位點核苷酸之間插入了8 bp核苷酸，使部分氨基酸移碼突變，翻譯提前終止，由于灌漿不充分導(dǎo)致突變體種子細小、皺縮[19]。sle1-1突變體中，887～930位點缺失了 44 bp 核苷酸，961位點核苷酸發(fā)生G-A的突變，使翻譯提前終止;sle1-2突變體中，2 960位點核苷酸C-A的突變引起編碼氨基酸Ser-Tyr的替換，sle-2突變體還具有花粉發(fā)育異常和花藥開裂障礙等表型[20]。這些突變體的表型特征提示，OsCSLD4在水稻生長發(fā)育的調(diào)解中具有多效性作用。

與野生型相比，本研究獲得的rnl1-1突變體抽穗期延遲9 d，株高是野生型的77.58%，葉片卷曲變窄，株高、穗長、每穗粒數(shù)、劍葉長、劍葉寬、一次枝梗數(shù)和二次枝梗數(shù)、粒寬、粒厚顯著減少，但是結(jié)實率正常（圖3）。此外突變體的粒寬顯著下降，粒長和粒厚沒有顯著差異（圖3）。已經(jīng)報道的OsCSLD4基因的突變體中，rnl1-1的表型與nrl1-1、nrl1-2和nrl1-3突變體的表型相似，雖然突變體的各個器官變小或變窄，但是植株的結(jié)實率并未受到影響，而nrl和sle突變體的結(jié)實率顯著下降，cd1突變體種子皺縮，表明OsCSLD4基因的完整結(jié)構(gòu)對水稻正常生長發(fā)育是必需的，單個氨基酸的突變會導(dǎo)致株高下降，葉片卷曲變窄，氨基酸序列的截短會使植株生長受到嚴(yán)重影響，因此該基因不同結(jié)構(gòu)域功能的研究對于株型育種具有重要意義。

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