宋智煜，陳雙臣，白小軍，董鈞鋒，宋月芹*

(1.河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南洛陽471000；2.宜陽縣林業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站，河南洛陽471600)

昆蟲的化學(xué)感受系統(tǒng)在其生存和繁殖過程中起著極其重要的作用(Kaupp，2010；Sunetal.，2014；Zhangetal.，2015)。研究者對(duì)昆蟲觸角嗅覺信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制研究有了突出的進(jìn)步：在昆蟲嗅覺識(shí)別時(shí)，氣味分子從觸角感器孔滲入，然后被氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)或化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)識(shí)別和轉(zhuǎn)移，最后激活位于嗅覺感覺神經(jīng)元(olfactory sensory neurons，OSNs)樹突膜上的嗅覺受體(odorant receptors，ORs)或離子型受體(ionotropic receptors，IRs)，產(chǎn)生電位，指導(dǎo)昆蟲做出相應(yīng)的行為反應(yīng)(Bentonetal.，2009；Leal，2013；Britoetal.，2016；de Fouchieretal.，2017；Yangetal.，2017)。此外，還有一些蛋白如感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins，SNMPs)在昆蟲氣味識(shí)別過程中也扮演著至關(guān)重要的角色(Leal，2013)。

昆蟲SNMPs是一種膜蛋白，與脊椎動(dòng)物CD36家族為同源基因，具有2個(gè)跨膜區(qū)域，其功能主要是識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)親脂性氣味分子如脂肪酸和脂類化合物等(Rogersetal.，1997，2001a；Febbraio & Silverstein，2007；Levyetal.，2007；Vogtetal.，2009；Martinetal.，2011)。昆蟲第一個(gè)SNMP基因被鑒定在多音蠶蛾Antheraeapolyphemus中，命名為ApolSNMP1。隨后SNMP的第二個(gè)亞類型在煙草天蛾Mauducasexta中被發(fā)現(xiàn)，命名為MsexSNMP2(Rogersetal.，1997，2001a，2001b)。緊接著SNMP的同源基因在鱗翅目Lepidoptera(Rogersetal.，2001a，2001b；Forstneretal.，2008)、雙翅目Diptera(Jinetal.，2008)、鞘翅目Coleoptera(Nichols & Vogt，2008)、直翅目Orthoptera(Vogtetal.，2009)和膜翅目Hymenoptera(Huetal.，2013)等昆蟲中都有發(fā)現(xiàn)。SNMP基因家族一直以來被認(rèn)為只有2個(gè)成員，即SNMP1和SNMP2。而昆蟲SNMP家族的第三個(gè)成員SNMP3在鱗翅目中被鑒定(Zhangetal.，2018)，被認(rèn)為主要與昆蟲的免疫反應(yīng)有關(guān)，這還需要進(jìn)一步證明。

雙委夜蛾Athetisdissimilis屬鱗翅目夜蛾科Noctuidae委夜蛾屬Athetis，近年逐漸成為小麥Triticumaestivum和玉米Zeamays地的主要害蟲。外形類似于二點(diǎn)委夜蛾A.lepigone，食量極大，對(duì)小麥和玉米產(chǎn)量造成極大的威脅(王振營等，2012；郭婷婷等，2016a,2016b)，發(fā)展新型友好的殺蟲劑迫在眉睫。本研究鑒定了雙委夜蛾的2個(gè)SNMP基因，即AdisSNMP1和AdisSNMP2，并通過熒光定量PCR技術(shù)對(duì)雙委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。以期為進(jìn)一步探索雙委夜蛾SNMPs的化學(xué)通訊功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲的準(zhǔn)備

雙委夜蛾來自河南科技大學(xué)林學(xué)院昆蟲實(shí)驗(yàn)室，該群體為自2012年7月在河南省洛陽市周邊玉米田誘集的成蟲，在室內(nèi)繼代飼養(yǎng)至今(宋月芹等，2015)。室內(nèi)飼養(yǎng)條件為：溫度27 ℃±1 ℃，相對(duì)濕度80%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 總RNA的提取與第一鏈cDNA的合成

選取雙委夜蛾羽化后第3天的雌雄成蟲，收集觸角各50頭、頭部各30頭、胸部各20頭、腹部各3頭、足各30頭、翅各50頭，每個(gè)樣品收集重復(fù) 3次。將雙委夜蛾各部分組織解剖后立即放入浸在液氮中的1.5 mL離心管內(nèi)，-80 ℃保存。

總RNA的提取采用RNAiso Plus Kit(TaKaRa，北京)試劑盒進(jìn)行，并使用RNase-free DNase I(TaKaRa，北京)對(duì)提取的RNA進(jìn)行除DNA處理。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000c分光光度計(jì)(Thermo Scientific)進(jìn)行質(zhì)量檢測。采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，北京)試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3 雙委夜蛾SNMPs基因的克隆

從本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)雙委夜蛾觸角轉(zhuǎn)錄組測序注釋結(jié)果中(Dongetal.，2016)搜索到2個(gè)SNMP基因。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異性引物，AdisSNMP1-F：5’-ATGGCGCTTCCTAAGGAGATA-3’，AdisSNMP1-R：5’-AATGTACAACTAGAACCGACC-3’；AdisSNMP2-F：5’-ATGTTGGGAAAACATTCGAAAATG-3’，AdisSNMP2-R：5’-AGTTAAGGGAAATAATTGCACTC-3’。PCR反應(yīng)體系為20 μL：雌蛾觸角cDNA模板1 μL，上、下游引物各1.5 μL(10 μmol·L-1)，dNTPs混合液 1.6 μL(2.5 μmol·L-1)，Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL(TaKaRa，大連)，10×Ex Taq buffer 2 μL，ddH2O 12.2 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。膠回收目的片段，將目的片段克隆到pMDTM19-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆培養(yǎng)過夜，送去測序。

1.4 雙委夜蛾SNMPs基因的序列分析

核酸序列采用在線工具(http://www.bio-soft.net/sms/)翻譯；采用在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進(jìn)行跨膜區(qū)域預(yù)測；利用在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)蛋白序列特性進(jìn)行分析；采用在線工具(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白親疏水性；采用線下DNAMAN進(jìn)行多重序列比對(duì)；采用線下MEGA 6.0構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.5 熒光定量PCR

通過熒光定量PCR檢測雙委夜蛾SNMPs基因在不同組織中的表達(dá)情況。根據(jù)雙委夜蛾SNMPs基因的開放閱讀框和熒光定量引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)特異性引物(5’-3’)，AdisSNMP1-F：TCCTGTTCCCTGTCATACTCAA，AdisSNMP1-R：GTGCCCTCTCCTTTAGTAACAG，AdisSNMP2-F：CTGCTCTACTAACGGTCCACGA，AdisSNMP2-R：ACGAAACCCTGACCACACGCCT。內(nèi)參基因?yàn)殡p委夜蛾GADPH基因，引物為：AdisGADPH-F：CTGCTCATTTAGAGGGTGGTGC；AdisGADPH-R：TCTTCTGGGTAGCGGTGGTAG。

熒光定量PCR在ABI 7500 PCR儀(ABI，Carlsbad，CA，USA)上進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)體系20 μL，包括10 μL的2×SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa，大連)、0.8 μL的正反向引物(10 μmol·L-1)、2 μL的cDNA模板(200 ng)和6.4 μL的DEPC水。PCR程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有SNMPs基因在雙委夜蛾不同組織中的相對(duì)表達(dá)量為ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因。利用SPSS 17.0中的ANOVA方法對(duì)AdisSNMPs基因在雙委夜蛾不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行差異比較(新復(fù)極差法檢驗(yàn)，P≤0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙委夜蛾SNMPs基因克隆及序列特征

反轉(zhuǎn)錄及PCR結(jié)果(圖1)顯示，在1 000～2 000 bp之間有1條明顯的單一條帶，結(jié)果與預(yù)期大小相符。測序結(jié)果在NCBI上的同源性搜索結(jié)果表明，所測序列與多種昆蟲的SNMP基因序列高度同源，證明這2個(gè)基因就是雙委夜蛾的SNMP基因，分別命名為AdisSNMP1和AdisSNMP2，GenBank登錄號(hào)分別為MT954936和MT954937。

M. DNA Marker DL2000, 1.AdisSNMP1, 2.AdisSNMP2

這2個(gè)SNMPs基因都具有全長的開放閱讀框，AdisSNMP1長度為1 572 bp，編碼523個(gè)氨基酸(圖2)；而AdisSNMP2長度為1 563 bp，編碼520個(gè)氨基酸(圖3)。這2個(gè)基因編碼蛋白質(zhì)都是酸性，AdisSNMP1的等電點(diǎn)是5.96，蛋白分子量是59.09 kD；AdisSNMP2的等電點(diǎn)是5.69，蛋白分子量是58.72 kD。

雙委夜蛾2個(gè)SNMPs基因的親水性和疏水性預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AdisSNMP1和AdisSNMP2在氨基酸序列的C-端和N-端跨膜區(qū)域有2個(gè)明顯的疏水位點(diǎn)(圖5)。

2.2 雙委夜蛾SNMPs與其他昆蟲SNMP基因的同源性及進(jìn)化樹分析

將雙委夜蛾AdisSNMP基因與已報(bào)道的其他昆蟲SNMP基因的氨基酸序列在NCBI中的Blastp在線搜索工具進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)AdisSNMP基因與不同種類昆蟲SNMP基因差別較大。與同目昆蟲SNMP基因一致性較高，如AdisSNMP1與小地老虎AgrotisipsilonAipsSNMP1序列一致性為85.69%；與斜紋夜蛾SpodopteralituraSlitSNMP1序列一致性為86.64%。AdisSNMP2與小地老虎AipsSNMP2序列一致性為86.54%；與斜紋夜蛾SlitSNMP2序列一致性為85.38%。與不同目昆蟲SNMP基因一致性較低，如AdisSNMP1與煙飛虱BemisiatabaciBtabSNMP1序列一致性為33.84%；與茶翅蝽HalyomorphahalysHhalSNMP1序列一致性為37.45%。AdisSNMP2與煙飛虱BtabSNMP2序列一致性為27.27%；與茶翅蝽HhalSNMP2序列一致性為25.52%。雙委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2序列一致性為27.05%。

使用MEGA 6.0對(duì)11種昆蟲的SNMP同源基因進(jìn)行進(jìn)化樹比較。SNMPs基因被分成2個(gè)亞組，即SNMP1和SNMP2(圖6)。雙委夜蛾的AdisSNMP1和AdisSNMP2基因分別被聚集到這2個(gè)亞組，并且與同為鱗翅目昆蟲的小地老虎和斜紋夜蛾SNMP基因進(jìn)化關(guān)系最近，與其他目昆蟲SNMP關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 雙委夜蛾SNMPs基因表達(dá)譜分析

使用熒光定量PCR對(duì)雙委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：AdisSNMP1和AdisSNMP2在雌雄蛾觸角中高度表達(dá)，雄蛾的表達(dá)量普遍比雌蛾高。除觸角外，AdisSNMP1幾乎不在其他組織中表達(dá)或表達(dá)量甚微。AdisSNMP2除在觸角中表達(dá)量豐富外，在足中也有少量表達(dá)(圖7)。

3 討論

本研究根據(jù)前期雙委夜蛾觸角轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，通過BLASTX在線搜索和同源性比較鑒定出2個(gè)SNMPs基因，即AdisSNMP1和AdisSNMP2。這2個(gè)基因與其他昆蟲SNMPs具有類似的特征，如在氨基酸序列N端和C端附近有2個(gè)保守的跨膜區(qū)域，并且由6個(gè)保守的半胱氨酸殘基形成二硫鍵組成一個(gè)大的胞外環(huán)，此結(jié)構(gòu)也與CD36基因家族極其相似(Huangetal.，2016；Sunetal.，2019；Yangetal.，2020)。根據(jù)對(duì)這2個(gè)跨膜蛋白結(jié)構(gòu)投影預(yù)測，這部分的功能是轉(zhuǎn)運(yùn)和結(jié)合脂類分子(Herbosoetal.，2011；Pregitzeretal.，2014)，推測雙委夜蛾SNMPs的2個(gè)跨膜區(qū)具有同樣的功能。

雙委夜蛾AdisSNMP基因同源性搜索發(fā)現(xiàn)AdisSNMP基因與不同種類昆蟲SNMP基因差別較大。與同目昆蟲SNMP基因一致性較高，與不同目昆蟲SNMP基因一致性較低。雙委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2之間序列一致性也比較低。進(jìn)化樹結(jié)果也顯示，雙委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2分別被聚集到SNMP1和SNMP2，在同一組內(nèi)，同為鱗翅目昆蟲的SNMP基因進(jìn)化關(guān)系最近，與其他目昆蟲SNMP關(guān)系較遠(yuǎn)。此結(jié)果與大多數(shù)昆蟲SNMP基因特性相同(Guetal.，2013；胡穎穎等，2013；Yangetal.，2020)。在鱗翅目中曾經(jīng)鑒定出SNMP3亞家族基因(Zhangetal.，2018)，而在雙委夜蛾觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中沒有發(fā)現(xiàn)該基因，可能是這個(gè)基因在幼蟲腸中高度表達(dá)的原因。

組織特異性表達(dá)可以為功能預(yù)測提供可靠性的參考。本研究發(fā)現(xiàn)雙委夜蛾SNMP1主要表達(dá)在雌雄蛾的觸角中，此結(jié)果與多音蠶蛾(Rogersetal.，1997)、臍橙螟Amyeloistransitella(Lealetal.，2009)和甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Liuetal.，2014)等多種昆蟲SNMP1的表達(dá)模式相同。Benton等(2007)在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中發(fā)現(xiàn)，DmelSNMP1能夠識(shí)別集合信息素cVA，激活受體HR13。Pregitzer等(2014)在煙芽夜蛾Heliothisvirescens中也發(fā)現(xiàn)，HvirSNMP1能明顯增強(qiáng)HR13對(duì)信息素Z11-16:Ald的結(jié)合力。以上研究都暗示昆蟲SNMP1的功能是調(diào)節(jié)信息素的識(shí)別和通過SNMP-OR互作轉(zhuǎn)運(yùn)信息素。相對(duì)于AdisSNMP1，AdisSNMP2的表達(dá)相對(duì)廣泛，除嗅覺感器觸角外，在非嗅覺感器足中也有少量表達(dá)，此結(jié)果與小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(Li & Qin，2011)、二化螟Chilosuppressalis(Liuetal.，2013a)、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis(Liuetal.，2013b)和甜菜夜蛾(Liuetal.，2014)一致。昆蟲身體上分布有大量的味覺感器(Montell，2009)，而CD36蛋白的主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)脂類化合物，因此可推測AdisSNMP2和GRs在這些組織中共同表達(dá)，識(shí)別脂類分子完成味覺過程。

本研究通過前期雙委夜蛾觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定出 2個(gè)SNMPs基因，并且研究了這些基因在雙委夜蛾不同組織中的表達(dá)情況，不僅豐富了昆蟲SNMPs基因的數(shù)量，也為今后對(duì)雙委夜蛾SNMPs基因功能的研究提供參考。