慢性阻塞性肺疾?。璺危┦且詺饬魇芟蕹掷m(xù)存在為特征性病變的氣道慢性炎癥疾病，隨著疾病的進展，肺功能進行性減退，急性發(fā)作事件增加，其中的一個重要原因是慢阻肺的氣道重塑。氣道重塑即氣道結(jié)構(gòu)的改變，主要病理改變是氣管壁的增厚及氣管平滑肌細胞的增殖，其主要發(fā)生機制目前認為是慢性炎癥的反復(fù)破壞。Nod樣受體蛋白-3（Nod-like receptor protein-3，NLRP3）近來認為在慢阻肺、支氣管哮喘等疾病的持續(xù)惡化中起關(guān)鍵作用，它被激活是疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因。本研究于2018年7月至2019年3月通過制備慢阻肺大鼠模型，檢測外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA相對表達量、肺泡灌洗液炎性因子水平及大鼠氣管平滑肌厚度，以探討它們間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物

24只1月齡清潔級Wistar大鼠，體質(zhì)量范圍為220～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［許可證SCXK（滬）2017-0005］。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 主要試劑

內(nèi)毒素（西格瑪公司）；SYBR

Premix Ex Taq

?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）RR420A（TAKARA公司）；TRIzol Reagent（Ambion公司）；紅梅牌香煙（紅塔集團）。

1.3 主要儀器與設(shè)備

熒光定量PCR儀（LightCycler? 96）羅氏；酶標儀（MK3）Axygen公司；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京建成）；熏煙箱（自備）。

1.4 實驗方法

1.4.1

模型的分組和復(fù)制 將大鼠以隨機數(shù)字表法均分成空白組和慢阻肺組（各12只）。依據(jù)經(jīng)典的煙熏加氣管靜滴內(nèi)毒素方法復(fù)制慢阻肺模型。方法如下：第1、14天經(jīng)氣道滴入1 g/L的內(nèi)毒素2 000μL，后2～30 d（第14天除外），將大鼠放入5%香煙煙霧中熏0.5 h/d。

1.4.2

蘇木精-伊紅（HE）染色及支氣管平滑肌測量（1）石蠟切片制備。取材與固定→水洗→脫水→透明→透臘→包埋→切片→展片→撈片→貼片→烤片。（2）HE染色步驟。先后予二甲Ⅰ、Ⅱ苯脫蠟，續(xù)予乙醇水化，再予蘇木精染液浸泡、1%鹽酸乙醇分化、1%伊紅乙醇染色，后梯度乙醇脫水，再分別予二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，封片。（3）測量支氣管平滑肌厚度。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件測定。以管壁內(nèi)周長標準化的平滑肌層面積代表平滑肌厚度。

1.4.3

實時聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）檢測大鼠外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA取大鼠外周血，分離出淋巴細胞，加入Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（cDNA）。將獲得的cDNA擴增目的基因。引物β-肌動蛋白（β-actin）正向：GGAGAAGATTTGGCACCACAC，反向：ACACAGCCTGGATGGCTACG，片段長度173 bp；NLRP3正向：AGCTCCTCTGTGAGGGACTT，反向：GAGCGTCACCACACACAGAT，片段長度179 bp。反應(yīng)條件：95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s，共40～45個循環(huán)。上機擴增檢測，應(yīng)用2法計算NLRP3 mRNA的相對表達量。

1.4.4

ELISA測定白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-18（IL-18）應(yīng)用雙抗體夾心法測定肺泡灌洗液細胞因子的濃度，依試劑盒使用說明書，用酶標儀測量吸光度，后通過標準曲線計算細胞因子濃度。

2 結(jié)果

2.1 兩組身體情況對比

空白組飲食如常，行動敏捷，活躍；慢阻肺組漸漸表現(xiàn)為體質(zhì)量下降、身懶少動、皮毛無光。

2.2 大鼠肺組織病理

光鏡下可見慢阻肺組大鼠肺組織有許多炎性細胞浸潤，以巨噬細胞為主要成分，肺泡腔內(nèi)表達為主，見圖1A。空白組大鼠肺組織小氣管黏膜上皮無破損，無炎癥細胞集聚，管腔沒有滲出物，見圖1B。

2.3 兩組大鼠NLRP3 mRNA相對表達量、肺泡灌洗液炎性因子濃度及氣管平滑肌厚度水平差異

慢阻肺組外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA相對表達量、肺泡灌洗液炎性因子濃度及氣管平滑肌厚度均高于空白組（

P

＜0.05）。如表1所示。

表1 兩組大鼠Nod樣受體蛋白-3（NLRP3）mRNA相對表達量、肺泡灌洗液炎性因子濃度及氣管平滑肌厚度水平差異/±s

2.4 兩組大鼠支氣管平滑肌厚度與NLRP3 mRNA相對表達量、肺泡灌洗液炎性因子的Pearson相關(guān)性分析

氣管平滑肌厚度與外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA相對表達量的

r

值為0.799；與肺泡灌洗液IL-18的

r

值為0.938；與肺泡灌洗液IL-1β水平的

r

值為0.970。均

P

＜0.001。

3 討論

慢阻肺為呼吸系統(tǒng)的常見疾病，防治重點就是延緩氣道重塑的發(fā)生，減少急性加重事件的發(fā)生，改善生存質(zhì)量。氣道重塑是氣流受限持續(xù)存在的病理學基礎(chǔ)，其基本病變?yōu)闅夤芷交〉脑鲋?，造成氣管管腔狹窄，肺動態(tài)及過度充氣，極大影響慢阻肺的預(yù)后。氣道重塑的機制目前尚未明確，目前主流的觀點認為是慢性氣道炎癥所致。炎性小體為一種蛋白復(fù)合物，其分布于細胞質(zhì)內(nèi)，可以被多種內(nèi)外源性分子激活。其中NLRP3炎性小體當前探討比較深入，多種外源性異物及內(nèi)源性分子均可激活它，其可誘導多種成分進行組合，其中包括NLRP3，就構(gòu)成了NLRP3炎性小體。NLRP3炎性小體在多種與慢性炎癥相關(guān)的疾病進程里發(fā)揮了重要的作用，如呼吸系統(tǒng)疾病中的慢阻肺、哮喘。目前還有學者認為，慢阻肺的發(fā)生發(fā)展，炎性小體持續(xù)被激活起了關(guān)鍵的影響。

慢阻肺是暴露于有害氣體后引起氣道的異常炎癥反應(yīng)。本研究通過煙熏大鼠模擬慢阻肺的發(fā)生，并氣管內(nèi)滴入內(nèi)毒素刺激炎癥反應(yīng)，模型大鼠的肺組織病理提示造模成功。謝圓媛等研究認為，持續(xù)存在的氣道與肺部的炎癥是導致慢阻肺病情持續(xù)惡化的重要機制，但導致炎癥發(fā)生并持續(xù)擴散的機制尚不明確。NLRP3炎性小體是機體固有免疫系統(tǒng)的識別受體，可通過引起炎癥細胞浸潤及炎性因子分泌參與慢阻肺的疾病進程。同時，有研究指出，慢阻肺病人病情惡化的一個重要因素，就是IL-1β、IL-18濃度升高。IL-1β是可在機體內(nèi)起重要作用的炎性因子，屬IL-1亞家族成員，多種細胞如淋巴細胞、單核細胞等均能夠分泌。既往研究指出，IL-1β能激活免疫應(yīng)答，使多種炎性介質(zhì)及炎性細胞浸潤到支氣管黏膜。IL-18可由多種組織細胞分泌，是一種作用強大的細胞因子，可調(diào)控多種細胞的增殖及細胞因子的合成分泌。宋素莉研究指出，IL-18通過誘導多種炎性介質(zhì)從而引起氣道重塑。還有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肺氣腫程度與肺組織內(nèi)IL-18的表達呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于空白組，慢阻肺組外周血淋巴細胞的NLRP3 mRNA相對表達量水平升高；同時肺泡灌洗液里的IL-18、IL-1β在慢阻肺組里的濃度高于空白組。這表明，外源性信號活化NLRP3炎性小體后，有激活下游肺泡中炎性因子可能，引起氣道炎癥，促進了慢阻肺的進展，這與既往的研究相符合。本研究也表明了慢阻肺的氣管平滑肌厚度高于空白組，隨著慢阻肺疾病的發(fā)生及進展，氣管平滑肌進行性增厚，使氣道發(fā)生重塑；而氣道重塑可使肺功能的進行性下降。因此，對氣道重塑的有效干預(yù)，是防治慢阻肺及延緩其疾病進展的重要步驟。

同時，本研究采用Pearson相關(guān)分析還發(fā)現(xiàn)氣管平滑肌厚度與NLRP3 mRNA相對表達量及肺泡炎性因子水平有正相關(guān)，說明隨著炎癥反應(yīng)的增強，慢阻肺氣道重構(gòu)也隨之增強。這與既往研究一致。目前觀點認為，NLRP3炎性小體及產(chǎn)物，可引起慢阻肺氣道的炎性介質(zhì)及細胞浸潤，并刺激氣道分泌及合成細胞外基質(zhì)，促進氣管平滑肌的增殖。因此，NLRP3炎性小體可作為防治氣道重塑的一個位點。

本研究通過制備慢阻肺大鼠模型，通過檢測氣管平滑肌厚度及外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA相對表達量及肺泡灌洗液里炎性因子濃度，初步表明了NLRP3炎性小體在慢阻肺氣道重塑中的作用，為我們防治及延緩慢阻肺的發(fā)生提供了新的思路。