結(jié)腸癌是起源于大腸的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率在女性腫瘤中排名第2，在男性腫瘤中排名第3。全球每年新診斷病人約13萬例，并可導(dǎo)致約6萬例病人死亡。盡管各種治療方法取得了一定進(jìn)展，但是我國病人的5年生存率仍然較低，僅為31%，主要與診斷時(shí)間晚、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等因素有關(guān)。因此，探索結(jié)腸癌生長、轉(zhuǎn)移有關(guān)的關(guān)鍵分子標(biāo)志物，發(fā)展特異性的診斷、治療方法，將對(duì)結(jié)腸癌病人預(yù)后的改善具有重要價(jià)值。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種內(nèi)源性的、單鏈的、小的非編碼RNA，可與靶信使RNA的3"端非編碼區(qū)結(jié)合，從而負(fù)性調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生物學(xué)行為有關(guān)，其異常表達(dá)在腫瘤的血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，也是一種有效的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-503在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的病理作用，包括卵巢癌、前列腺癌等。然而，miRNA-503在結(jié)腸癌中的表達(dá)及作用尚不清楚，因此本研究旨在探討miRNA-503在結(jié)腸癌病人血清中的表達(dá)情況，分析其與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，評(píng)價(jià)其在診斷與預(yù)后中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年3月至2013年5月在四川大學(xué)華西醫(yī)院就診的結(jié)腸癌病人作為研究對(duì)象。根據(jù)下述納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，共選取了72例結(jié)腸癌病人作為觀察組，其中年齡（61.8±2.7）歲，范圍為43～71歲；男性40例，女性32例。手術(shù)后核實(shí)并完善病人的其他信息，包括腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。選取同期該院的50例健康體檢者作為對(duì)照組，將可能患有腫瘤者排除，其中年齡（59.6±2.3）歲，范圍為45～70歲；男性28例，女性22例。觀察組與對(duì)照組在年齡、性別等一般資料方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。所有入選者均簽署了知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)確診為結(jié)腸癌；（2）術(shù)前均未進(jìn)行放化療；（3）均擬行手術(shù)治療；（4）均知情同意，且愿意接受長期隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）除結(jié)腸癌導(dǎo)致的腫瘤轉(zhuǎn)移外，仍伴有其他部位的腫瘤；（2）肝腎功能障礙、嚴(yán)重的精神疾病及慢性病等。

1.2 主要試劑與儀器

miRNAeasy Mini Kit試劑盒購自德國Qiagen公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；引物合成于蘇州金唯智生物科技有限公司，具體序列見表1。

表1 引物序列

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT

-

PCR）檢測血清中miRNA

-

503水平

使用qRT-PCR檢測血清中miRNA-503水平，具體步驟為：觀察組病人在確診后立即留取靜脈血，觀察組和對(duì)照組均取5 mL外周靜脈血，放于4℃冰箱至自然凝固，3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清。根據(jù)miRNAeasy Mini Kit試劑盒說明書提取血清中的總miRNA，使用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），使用SYBR Green PCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃15s，60℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。在熒光定量PCR儀中進(jìn)行檢測，記錄熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)，即Ct值，2法計(jì)算miRNA-503的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 受試者工作特征曲線評(píng)價(jià)miRNA

-

503的診斷價(jià)值

根據(jù)觀察組和對(duì)照組血清中miRNA-503水平，作受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic curve，ROC曲線），計(jì)算曲線下面積，根據(jù)ROC曲線上各坐標(biāo)點(diǎn)的靈敏度與特異度計(jì)算約登指數(shù)，約登指數(shù)=靈敏度-（1-特異度），取約登指數(shù)最大的坐標(biāo)點(diǎn)，該坐標(biāo)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的miRNA-503表達(dá)量為截?cái)嘀担醋罴雅R界點(diǎn)。

1.5 生存分析評(píng)價(jià)病人的預(yù)后情況

根據(jù)觀察組病人血清中miRNA-503水平的中位數(shù)，將所有病人分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，各36例。所有病人均于手術(shù)后進(jìn)行隨訪，記錄病人的死亡時(shí)間和失訪時(shí)間，截止時(shí)間為術(shù)后72個(gè)月。對(duì)高表達(dá)組和低表達(dá)組病人進(jìn)行生存分析，比較其生存率的差異。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌病人血清中miRNA

-

503的水平

對(duì)血清中miRNA-503水平進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示觀察組血清中miRNA-503水平（0.49±0.02）顯著低于對(duì)照組（0.77±0.03）（

t

=8.447，

P

＜0.001）。

2.2 不同臨床病理特征的病人血清中miRNA

-

503水平的比較

結(jié)腸癌病人血清中miRNA-503水平與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)，而與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤大小≥5 cm、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人血清中miRNA-503水平顯著低于腫瘤大?。? cm、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人（

P

＜0.05）。見表2。

2.3 miRNA

-

503水平對(duì)結(jié)腸癌的診斷價(jià)值

繪制ROC曲線評(píng)價(jià)miRNA-503水平對(duì)結(jié)腸癌的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示ROC曲線下面積為0.859（

P

＜0.001，95%

CI

：0.790～0.928），以miRNA-503表達(dá)量為0.685為截?cái)嘀禃r(shí)，對(duì)結(jié)腸癌的診斷靈敏度為0.875，特異度為0.740，見圖2。

表2 不同臨床病理特征結(jié)腸癌72例血清微小RNA-503（miRNA-503）水平的比較/±s

圖2 微小RNA-503（miRNA-503）水平診斷結(jié)腸癌72例的ROC曲線

2.4 miRNA

-

503水平對(duì)結(jié)腸癌預(yù)后的影響

對(duì)不同miRNA-503水平的結(jié)腸癌病人進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示低表達(dá)組病人的生存率顯著低于高表達(dá)組（

χ

=5.376，

P

=0.020），見圖3。

圖3 結(jié)腸癌72例中不同微小RNA-503（miRNA-503）水平生存率的比較

3 討論

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)中發(fā)病率排名第三的惡性腫瘤，其發(fā)病原因尚未明確，可能與遺傳、膳食（高脂肪及低纖維素飲食）、息肉、炎癥等多種因素有關(guān)，易感人群包括慢性結(jié)腸炎、結(jié)腸息肉等病人。結(jié)腸癌的治療以手術(shù)為主，但是術(shù)后復(fù)發(fā)率高、生存率低等問題仍未改善，其主要原因在于早期診斷及預(yù)后判斷較為落后。癌胚抗原是一種腫瘤相關(guān)抗原，最早從結(jié)腸癌和胚胎中提取得到，可從血清、腹水、胃液等多種標(biāo)本中檢出，以往曾將癌胚抗原作為結(jié)腸癌的特異性標(biāo)志物。隨后研究發(fā)現(xiàn)，癌胚抗原是一種廣譜的腫瘤標(biāo)志物，在肺癌、乳腺癌等其他腫瘤病人中也呈高表達(dá)。因此，尋找到與結(jié)腸癌臨床病理特征密切相關(guān)、具有較好診斷及預(yù)后價(jià)值的標(biāo)志物成為結(jié)腸癌研究的主要任務(wù)之一。

miRNA是一種單鏈非編碼RNA，主要調(diào)控靶基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。血清中一系列不同類型的miRNA已在多種腫瘤中證實(shí)呈差異性表達(dá)，對(duì)高熱、反復(fù)凍融、不適宜的pH值等惡劣環(huán)境能夠保持較好的穩(wěn)定性，在早期診斷、病情及療效評(píng)估、預(yù)后判斷等一系列診療過程中具有潛在的應(yīng)用前景。miRNA-503是miRNA-16家族的成員，可以負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，發(fā)揮腫瘤抑制效應(yīng)，例如Xiao等發(fā)現(xiàn)miRNA-503在肝癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)降低，其低水平的表達(dá)與門靜脈腫瘤血栓、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、甲胎蛋白水平、預(yù)后不良等惡性潛能增強(qiáng)有關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA-503通過視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白-轉(zhuǎn)錄因子E2F信號(hào)通路誘導(dǎo)G1期阻滯，細(xì)胞周期蛋白D3和E2F轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子3可能是miRNA-503的直接靶點(diǎn)。本研究在探討miRNA-503在結(jié)腸癌病人血清中的表達(dá)情況時(shí)也發(fā)現(xiàn)了相同的趨勢，結(jié)腸癌病人血清中miRNA-503水平顯著低于健康體檢者，在腫瘤體積大、臨床分期差、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人血清中miRNA-503水平顯著降低，但是其水平與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。上述結(jié)果提示miRNA-503與結(jié)腸癌的不良病理特征密切相關(guān)，可能是關(guān)鍵的病理及治療靶點(diǎn)。

ROC曲線廣泛用于評(píng)價(jià)指標(biāo)在臨床診斷中的效果，ROC曲線下面積為0.5～0.7代表診斷價(jià)值較低，＞0.7～0.9代表診斷價(jià)值較好，＞0.9代表診斷價(jià)值高。本研究根據(jù)觀察組和對(duì)照組血清中miRNA-503水平作ROC曲線，結(jié)果顯示ROC曲線下面積為0.859，表明miRNA-503水平具有一定的診斷價(jià)值，但是仍有很大的提升空間，未來可以考慮多種指標(biāo)的聯(lián)合監(jiān)測，以提高診斷效果。為了進(jìn)一步增強(qiáng)miRNA-503在未來診斷試驗(yàn)中的應(yīng)用性，本研究分析了其診斷臨界值，即以0.685為截?cái)嘀禃r(shí)，對(duì)結(jié)腸癌的診斷靈敏度為0.875，特異度為0.740。生存率是判斷病人預(yù)后的重要指標(biāo)，為了方便比較不同miRNA-503水平病人的生存率，本研究將所有病人分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，通過隨訪和生存分析發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)組病人的生存率顯著低于高表達(dá)組，提示監(jiān)測miRNA-503水平并采取針對(duì)性的治療可能是改善病人預(yù)后的關(guān)鍵。

綜上所述，miRNA-503在結(jié)腸癌病人血清中低表達(dá)，與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)，具有較好的診斷價(jià)值，可能成為潛在的診斷、治療與預(yù)后靶點(diǎn)。