終末期腎臟?。‥nd-stage renal disease，ESRD）是各種慢性腎臟疾病的終末階段，可引起尿毒癥的各種癥狀，臨床只能采用腎臟替代療法治療。腹膜透析是目前ESRD病人常用的替代治療方法之一，具有良好的治療效果。隨著腹膜透析的長期進行，腹膜透析病人易并發(fā)腹膜纖維化（Peritoneal fibrosis，PF），引起腹膜結構和功能的改變，出現(xiàn)超濾衰竭，導致腹膜透析治療失敗。分析腹膜透析病人發(fā)生PF的機制，尋找特異性的分子標志物，對于臨床治療具有重要意義。α-平滑肌肌動蛋白（asmooth muscle actin，α-SMA）是成纖維細胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞的標志，參與肺臟、肝臟、腎臟等多組織的纖維化。上皮鈣黏素（E-cadherin）是一類鈣依賴性跨膜糖蛋白，對維持細胞形態(tài)及細胞間的粘附具有重要作用。已有研究顯示，α-SMA和E-cadherin在腹膜纖維化大鼠中出現(xiàn)差異表達，但其在腹膜透析大鼠中的表達及其與腹膜組織病變之間的關系尚不清楚。因此，本課題組于2018年10月至2019年3月建立了腹膜透析大鼠模型，探討α-SMA和E-cadherin在腹膜透析大鼠中的表達及意義，旨在為臨床ESRD的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與動物

光學顯微鏡（BX50）購自日本Olympus公司；4.25%腹膜透析液購自上海長征富民金山制藥有限公司，國藥準字H31020945；SP免疫組化試劑盒購自上海經(jīng)科化學科技有限公司；RT-PCR試劑盒、引物均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；小鼠抗α-SMA抗體和E-cadherin抗體、生物素標記羊抗兔IgG購自武漢華美生物工程有限公司。

SPF級SD大鼠雄性45只，周齡范圍為12～15周，體質(zhì)量范圍為180～220 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2017-0001，飼養(yǎng)于河南科技大學第一附屬醫(yī)院動物中心實驗室，保持室溫恒定為25℃，模擬晝夜，自由攝食與飲水。

1.2 動物造模及給藥

抽簽選取26只大鼠預飼養(yǎng)7 d后，采用5/6腎切除法制備大鼠尿毒癥模型，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，常規(guī)消毒皮膚，取側(cè)臥位，逐層切開皮膚以及肌肉，游離腎臟，剝除腎包膜，切除左腎的上下極約全腎的2/3，電凝刀電凝止血，術后一周行右側(cè)切口，進行右腎全切，術后第5周，采集大鼠尾靜脈血液，采用生化分析儀測定腎功能，若腎功能異常則造模成功。26只大鼠死亡5只，21只造模成功，抽簽選取造模成功的20只大鼠將其分為模型組和腹膜透析組。剩余的19只大鼠抽簽選取10只大鼠為假手術組，僅切開皮膚，游離腎臟，剝除左、右腎包膜，不進行切除。術后第5周行腹透植管術，在下腹中線右側(cè)0.2 cm處植入自制腹透管，植管2周以后假手術組和模型組每日腹腔灌注生理鹽水20 mL，腹膜透析組每日腹腔灌注4.25%腹膜透析液20 mL，共持續(xù)6周。

1.3 腹膜平衡試驗

大鼠停止透析24 h后行腹膜平衡試驗，通過腹透導管腹腔灌注20 mL 4.25%腹膜透析液，90 min后處死大鼠，采用注射器收集大鼠腹腔內(nèi)液體，計算腹膜超濾量，并測定透出液肌酐（D-Scr）、血肌酐（P-Scr）、初始腹透液葡萄糖（D0）及透出液中葡萄糖（D1）的濃度，計算D/P-Scr和D1/D0值。

1.4 腹膜組織病理學檢查

無菌條件下，取大鼠腹部壁層腹膜組織，用4%多聚甲醛溶液固定24 h后，進行常規(guī)的脫水、透明、浸蠟及包埋，切片（約4μm厚），一份進行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察腹膜組織的病理學變化；一份切片采用Masson染色，測量腹膜厚度，每張切片盲法隨機測量12個高倍鏡視野，平均值作為腹膜組織厚度。

1.5 RT

-

PCR測定腹膜組織α

-

SMA和E

-

cadherin mRNA的表達

取大鼠腹部壁層腹膜組織約50 mg，勻漿，用Trizol法提取組織的總mRNA，采用紫外分光光度計確定其濃度，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補DNA（cDNA），進行RT-PCR反應，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，α-SMA正向引物：5"-TTACGAGTTGCCTGATGG-3"，反向引物：5"-TGCTGTTGTAGGTGGTTTC-3"，E-cadherin正向引物：5"-AGTGAACAACGATGGCATTT-3"，反向引物：5"-CTCAGCCCGAGTGGAAAT-3"，反應體系參考已有文獻報道。

1.6 免疫組化檢測腹膜組織種

α-

SMA和E

-

cadherin蛋白的表達

另一份切片進行免疫組化檢測，將切片置于65℃烤箱脫蠟水化2 h，依次經(jīng)二甲苯透明，梯度乙醇脫水，加入EDTA（乙二胺四乙酸）緩沖液修復抗原10 min，加入3%過氧化氫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加入BSA（牛血清白蛋白）封閉20 min，加入50μL一抗（1∶200），4℃下孵育過夜，加入50μL生物素標記的二抗（1∶500）孵育1 h，加入DAB（二氨基聯(lián)苯胺）顯色，蘇木素復染，氨水返藍，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察蛋白表達，隨機選取5個視野，測定其平均光密度值。

2 結果

2.1 腹膜組織的超濾量和轉(zhuǎn)運能力

與假手術組相比，模型組和腹膜透析組大鼠的腹膜超濾量和D1/D0明顯下降（

P

＜0.05），D/P-Scr明顯升高（

P

＜0.05）；模型組相比，腹膜透析組大鼠的腹膜超濾量和D1/D0明顯下降（

P

＜0.05），D/P-Scr明顯升高（

P

＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腹膜組織的超濾量和轉(zhuǎn)運能力/±s

2.2 腹膜組織的病理組織學變化

HE染色顯示，假手術組大鼠腹膜組織有一層連續(xù)的扁平間皮細胞覆蓋，細胞排列完整有序；模型組大鼠腹膜組織有部分間皮細胞層脫落，炎癥細胞增多；腹膜透析組大鼠腹膜表面有部分甚至全部間皮細胞層脫落，炎癥細胞明顯增多；Masson染色顯示，假手術組大鼠腹膜組織薄且完整；模型組大鼠腹膜組織厚度增加；腹膜透析組大鼠腹膜厚度增加，基質(zhì)增厚明顯，可見纖維細胞增生，見圖1。與假手術組（12.14±1.53）μm相比，模型組（20.51±2.72）μm和腹膜透析組（36.74±4.83）μm大鼠的腹膜厚度明顯增加（

P

＜0.05）；模型組相比，腹膜透析組大鼠的腹膜厚度明顯增加（

P

＜0.05），

F

=141.923，

P

＜0.001。

2.3 腹膜組織中α

-

SMA和E

-

cadherin的mRNA水平

與假手術組相比，模型組和腹膜透析組大鼠α-SMA的mRNA水平明顯上調(diào)（

P

＜0.05），E-cadherin的mRNA水平明顯下調(diào)（

P

＜0.05）；模型組相比，腹膜透析組大鼠α-SMA的mRNA水平明顯上調(diào)，E-cadherin的mRNA水平明顯下調(diào)（

P

＜0.05），各組大鼠α-SMA和E-cadherin的mRNA水平呈負相關關系（

P

＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠腹膜組織中α-SMA和E-cadherin的mRNA水平比較/±s

2.4 腹膜組織中α

-

SMA和E

-

cadherin蛋白的表達

與假手術組相比，模型組和腹膜透析組大鼠α-SMA的蛋白表達明顯上調(diào)，E-cadherin的蛋白表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）；模型組相比，腹膜透析組大鼠α-SMA的蛋白表達明顯上調(diào)，E-cadherin的蛋白表達明顯下調(diào)，均差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05），各組大鼠α-SMA和E-cadherin的蛋白表達呈負相關關系，差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05），見圖2、表3。

表3 各組大鼠腹膜組織中α-SMA和E-cadherin蛋白的表達比較/±s

2.5α

-

SMA和E

-

cadherin的mRNA水平與腹膜結構和功能之間的相關性

大鼠腹膜組織中α-SMA的mRNA水平與腹膜厚度和D/P-Scr呈正相關關系（

P

＜0.05），與腹膜超濾量和D1/D0呈負相關關系（

P

＜0.05）；E-cadherin的mRNA水平與腹膜厚度和D/PScr呈負相關關系（

P

＜0.05），與腹膜超濾量和D1/D0呈正相關關系（

P

＜0.05），見表4。

表4 α-SMA和E-cadherin的mRNA水平與腹膜結構和功能之間的Pearson相關性分析

3 討論

腹膜透析是ESRD病人最主要的治療手段之一，利用腹膜作為半滲透膜，通過注入腹腔的腹膜透析液與腹膜血管中的血液進行水分和溶質(zhì)的交換，清除機體的代謝產(chǎn)物和毒性物質(zhì)，糾正電解質(zhì)和酸堿平衡。臨床研究顯示，隨著腹膜透析時間的延長，長期腹膜透析病人可出現(xiàn)腹膜結構和功能的改變，出現(xiàn)PF，導致臨床治療失敗。分析腹膜透析病人并發(fā)PF的機制，對于臨床治療具有重要意義。因此，本研究建立了大鼠尿毒癥模型和腹膜透析模型，模擬臨床腹膜透析ESRD病人，來分析腹膜透析病人并發(fā)PF的機制。本研究中，模型組大鼠的腹膜超濾量、D1/D0明顯下降，D/P-Scr明顯升高，可能是由于尿毒癥大鼠體內(nèi)代謝廢物、毒性物質(zhì)的蓄積，引起水、電解質(zhì)平衡紊亂，在一定程度上影響了腹膜的功能。本研究中，相比于模型組大鼠，腹膜透析大鼠的腹膜超濾量、D1/D0明顯下降，D/P-Scr明顯升高。腹膜超濾量是透出身體內(nèi)毒素及小分子，D1/D0和D/P-Scr主要反映了腹膜轉(zhuǎn)運小分子溶質(zhì)的能力，提示腹膜透析大鼠腹膜組織清除小分子的能力下降。吳煒飛等的研究顯示，腹膜轉(zhuǎn)運能力是評價ESRD病人腹膜透析治療后死亡率的關鍵因子，腹膜形態(tài)結構和功能的改變，引起小分子溶質(zhì)轉(zhuǎn)運的增加，腹膜超濾量的減少，最終引起超濾衰竭，迫使ESRD病人退出腹膜透析治療，提示腹膜透析大鼠在長期接受腹膜透析治療的過程中，可能發(fā)生了腹膜組織結構和功能的改變，引起腹膜超濾量下降，轉(zhuǎn)運能力下降。

腹膜主要由腹膜間皮細胞層和間皮下的間皮組織構成，腹膜間皮細胞結構和功能的完整性是保證腹膜功能的重要因素。本研究中，腹膜透析大鼠的腹膜厚度增加，可見纖維細胞增生，提示腹膜透析大鼠發(fā)生了PF，引起了腹膜間皮細胞結構和功能的改變。本研究中，腹膜透析大鼠的α-SMA的表達明顯上調(diào)，E-cadherin的表達明顯下調(diào)。α-SMA是成纖維細胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞的標志，活化的成纖維細胞可以分泌大量的α-SMA，促進細胞外基質(zhì)的分泌和沉積，可以促進PF的發(fā)生。E-cadherin是一種鈣依賴性的跨膜糖蛋白，對維持細胞形態(tài)和調(diào)節(jié)細胞粘附具有重要作用。臨床研究顯示，E-Cadherin蛋白表達下調(diào)，可以導致細胞間黏附作用下降，出現(xiàn)肌成纖維細胞的表型，促進成纖維細胞分泌大量的α-SMA，最終導致PF發(fā)生，提示腹膜透析大鼠的腹膜間皮細胞在長期接受腹膜透析的過程中，E-Cadherin蛋白表達下調(diào)，發(fā)生了表型轉(zhuǎn)變，呈現(xiàn)為肌成纖維細胞，使得α-SMA表達上調(diào)，促進PF的發(fā)生。本研究中，α-SMA和E-Cadherin的表達呈負相關關系，提示E-Cadherin表達下調(diào)可能通過促進腹膜間皮細胞向肌成纖維的表型轉(zhuǎn)變，促進α-SMA的分泌增加。本研究中，α-SMA和E-Cadherin的表達與腹膜厚度、腹膜超慮量、D1/D0和D/P-Scr具有相關性，提示α-SMA和E-Cadherin的表達與腹膜的功能密切相關，進一步證實α-SMA和E-Cadherin參與了PF的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，腹膜透析大鼠的α-SMA的表達明顯上調(diào)，E-Cadherin的表達明顯下調(diào)，α-SMA和E-Cadherin的表達與腹膜厚度、腹膜超慮量、D1/D0和D/PScr具有相關性，有望應用于臨床腹膜透析病人的治療。但腹膜透析病人腹膜組織中α-SMA和E-Cadherin的表達是否與腹膜透析大鼠一致尚不清楚，有待于進一步的臨床研究。