宮頸癌是一種發(fā)于子宮頸部的婦科常見惡性腫瘤，多發(fā)于40～60歲女性群體，其病死率高居?jì)D科腫瘤第二。由于病毒感染、生活習(xí)慣、性行為、妊娠、分娩、經(jīng)濟(jì)條件等影響，我國(guó)宮頸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。雖然近年來(lái)關(guān)于宮頸癌相關(guān)研究較多，但病人病死率仍處于較高水平，早期有效診斷有助于提高宮頸癌治療效果和改善病人預(yù)后。人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染與宮頸癌密切相關(guān)，經(jīng)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV之一的人乳頭瘤病毒16型（HPV16）感染是我國(guó)宮頸癌發(fā)生的主要影響因素。Hong等研究表明，高水平的HPV16載量預(yù)示宮頸癌惡性程度加深。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著HPV16陽(yáng)性率升高，宮頸癌病人的國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期升高、病死率增大。有研究報(bào)道，微小RNA-145（Micro ribonucleic acid-145，miR-145）在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-145可能通過(guò)抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程抑制癌細(xì)胞遷移和入侵，發(fā)揮抑癌作用。段亞男等研究報(bào)道，肺腺癌病人血清miR-145表達(dá)水平明顯降低，與TNM分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。由于宮頸癌血清中miR-145與宮頸脫落細(xì)胞HPV關(guān)系未見報(bào)道，本研究通過(guò)檢測(cè)宮頸癌病人血清miR-145表達(dá)水平，分析與病人臨床病理特征及HPV感染關(guān)系，探究其對(duì)宮頸癌診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年5月至2019年5月三亞市中醫(yī)院收治的宮頸癌病人83例，年齡范圍為37～78歲，年齡（51.34±16.18）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理切片及臨床診斷，確診為宮頸癌。②均為首次患癌，且臨床及病理資料完整。③入組前未進(jìn)行放、化療及藥物治療。④病人及其近親屬同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并患有其他部位腫瘤。②患有其他生殖系統(tǒng)疾病。③合并患有高血壓、糖尿病者。④妊娠期或哺乳期病人。根據(jù)FIGO分期系統(tǒng)，將入組病人分為：鱗癌47例，腺癌36例；根據(jù)腫瘤直徑分為：＜4 cm 34例，≥4 cm 49例；根據(jù)分化程度分為：高、中分化40例，低分化43例；根據(jù)間質(zhì)浸潤(rùn)深度分為＜1/2 45例，≥1/2 38例；根據(jù)是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為：無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例。另選取同期在該院體檢顯示健康者83例為對(duì)照組，對(duì)照組對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 主要儀器和試劑

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRTPCR）儀（型號(hào)7900，美國(guó)Applied Biosystems公司）、普通PCR儀（型號(hào)GT9612，無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司）、電泳儀（型號(hào)1658001，美國(guó)伯樂公司）、qRT-PCR試劑盒（批號(hào)RR820A，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）、多重PCR試劑盒（批號(hào)N555-KIT，美國(guó)Amresco公司）、RNA提取試劑盒（批號(hào)R1200-100，北京索萊寶科技有限公司）、DNA提取試劑盒（批號(hào)D3892-02，美國(guó)Omega公司）。

1.3 方法

1.3.1

樣本采集 所有入組者于入院時(shí)清晨（7：00—9：00）空腹采集外周靜脈血5 mL，4℃、3 000 r/min條件下離心20 min后收集上清液，分裝于無(wú)菌EP管中，保存于-80℃超低溫冰箱備用。

所有入組者于宮頸脫落細(xì)胞檢查時(shí)，使用宮頸刷采集宮頸脫落細(xì)胞，置于pH 7.0的PBS緩沖液中靜置后，在4℃、3 000 r/min條件下離心20 min富集細(xì)胞，保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3.2

miR-145、人乳頭瘤病毒16型E6蛋白（HPV16 E6）mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR檢測(cè)所有入組者血清miR-145及宮頸脫落細(xì)胞HPV16 E6 mRNA表達(dá)水平。使用RNA提取試劑盒（Trizol法）提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得互補(bǔ)DNA（cDNA）用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR反應(yīng)體系（20μL）如下：cDNA 2μL，正、反向引物各0.8μL，反應(yīng)混合物（Mix）10μL，熒光基團(tuán)（ROX）0.4μL，無(wú)酶水6.0μL。具體反應(yīng)步驟如下：95℃、36 s，1循環(huán)；95℃、5 s；62℃、34 s，40循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，用2法計(jì)算血清miR-145和宮頸脫落細(xì)胞HPV16 E6 mRNA表達(dá)水平。qRTPCR實(shí)驗(yàn)所用引物如表1所示。

1.3.3

HPV16感染水平檢測(cè) 采用多重PCR技術(shù)檢測(cè)HPV16 E6 DNA表達(dá)水平。使用DNA提取試劑盒和PCR試劑盒提取宮頸脫落細(xì)胞DNA并進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，所得產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳成像。若HPV16 E6 DNA為陽(yáng)性則判定HPV16為陽(yáng)性。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料對(duì)比

兩組年齡、已婚比例、懷孕次數(shù)＞2比例、絕經(jīng)比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。宮頸癌組病人流產(chǎn)次數(shù)＞1比例顯著高于對(duì)照組（

P

＜0.05）。見表2。

2.2 兩組血清miR

-

145及宮頸脫落細(xì)胞HPV16感染水平比較

宮頸癌組血清miR-145水平顯著低于對(duì)照組（

P

＜0.05），宮頸脫落細(xì)胞HPV16陽(yáng)性率及HPV16 E6 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（

P

＜0.05），見表3。

表3 健康體檢者與宮頸癌血清miR-145水平及人乳頭瘤病毒16型（HPV16）感染水平比較

2.3 血清miR

-

145水平與宮頸癌病人臨床病理特征關(guān)系

年齡、病理類型、腫瘤直徑、間質(zhì)浸潤(rùn)深度與病人血清miR-145水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。不同分化程度病人血清miR-145水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。FIGO分期Ⅲ/Ⅵ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HPV16陽(yáng)性病人血清miR-145水平明顯低于FIGO分期Ⅰ/Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HPV16陰性病人（

P

＜0.05）。見表4。

表4 宮頸癌83例血清miR-145水平與臨床病理特征關(guān)系/±s

2.4 宮頸癌病人血清miR

-

145與HPV16 E6 mRNA表達(dá)水平相關(guān)性

如圖1所示，宮頸癌病人血清miR-145與宮頸脫落細(xì)胞中HPV16 E6 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（

r

=-0.372，

P

=0.001）。

2.5 影響宮頸癌發(fā)生危險(xiǎn)因素分析

以年齡、絕經(jīng)、懷孕次數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)、HPV16水平、miR-145水平為自變量，以宮頸癌是否發(fā)生為因變量建立非條件logistic回歸模型，賦值1=發(fā)生，0=未發(fā)生，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為

α

=0.05。logistic回歸分析結(jié)果顯示，年齡≥51、絕經(jīng)、懷孕次數(shù)＞2與宮頸癌發(fā)生無(wú)關(guān)（

P

＞0.05）。流產(chǎn)次數(shù)＞1、HPV16陽(yáng)性、miR-145低表達(dá)是影響宮頸癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（

P

＜0.05）。見表5。

表2 健康體檢者與宮頸癌一般資料對(duì)比

圖1 宮頸癌83例miR-145與人乳頭瘤病毒16型E6蛋白（HPV16 E6）mRNA表達(dá)水平相關(guān)性

2.6 miR

-

145對(duì)宮頸癌診斷價(jià)值

ROC曲線分析顯示，miR-145預(yù)測(cè)宮頸癌發(fā)生的曲線下面積為0.887，靈敏度為85.50%，特異度為86.70%，見圖2。

圖2 miR-145對(duì)宮頸癌83例診斷效能

3 討論

宮頸癌病人早期無(wú)明顯癥狀，可能出現(xiàn)輕微陰道出血、陰道排液和性交痛等，只能通過(guò)臨床檢測(cè)診出。但多數(shù)病人由于篩查不及時(shí)而使病情進(jìn)展至中晚期，主要癥狀有不規(guī)則陰道出血、排液、下肢腫痛，引起其他器官病變?nèi)缒蚨景Y等，生存率極低。早期診斷可使病人進(jìn)行及時(shí)有效治療，提高生存率和生活質(zhì)量。有研究報(bào)道，吸煙、被動(dòng)吸煙、人工流產(chǎn)次數(shù)增加、過(guò)早生育等因素可能增加宮頸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組病人流產(chǎn)次數(shù)＞1比例顯著高于對(duì)照組，提示流產(chǎn)次數(shù)增加可能影響宮頸癌發(fā)生。

HPV是一種環(huán)狀DNA病毒，有8個(gè)開放閱讀框，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)。HPV與多種人類生殖系統(tǒng)感染類疾病有關(guān)。HPV16屬于高危型HPV，參與宮頸炎、子宮肌瘤、宮頸癌等疾病進(jìn)展。有研究表明，宮頸脫落細(xì)胞中HPV16檢出率隨病變程度提高而升高。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌病人宮頸脫落細(xì)胞HPV16陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，提示HPV16可能與宮頸癌發(fā)生有關(guān)。Baedyananda等研究報(bào)道，HPV16靶蛋白E1在宮頸癌組織中表達(dá)水平升高，與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，可能作為宮頸癌預(yù)后標(biāo)志物。有研究證實(shí)，HPV E6在人宮頸角化細(xì)胞致瘤轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌病人宮頸脫落細(xì)胞HPV16 E6 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，提示HPV16可能通過(guò)影響癌細(xì)胞增殖，影響宮頸癌發(fā)展。

微小RNA是一類具有調(diào)控功能的短鏈非編碼RNA，與疾病進(jìn)展有關(guān)。Zhong等研究發(fā)現(xiàn)，miR-1225在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，miR-1225過(guò)表達(dá)增加了胰腺癌細(xì)胞凋亡。Tan等研究報(bào)道，乳腺癌細(xì)胞中miR-708表達(dá)水平降低，與病人化療反應(yīng)和預(yù)后不良有關(guān)，在癌細(xì)胞自我更新和耐藥中發(fā)揮抑癌作用。提示miRNA參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。有研究報(bào)道，miR-145在宮頸癌中表達(dá)水平低于正常組織，與FIGO分期晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病人生存率低有關(guān)，可能是宮頸癌潛在預(yù)后標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，miR-145在宮頸癌病人血清中表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，且與腫瘤分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與Azizmohammadi等研究結(jié)果一致，提示miR-145可能與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Yin等研究證實(shí)，miR-145可能通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）蛋白表達(dá)，抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，減少非小細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲，抑制腫瘤形成。提示miR-145可能通過(guò)影響TGF-β誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，參與宮頸癌進(jìn)展。

表5 宮頸癌發(fā)生危險(xiǎn)因素的166例logistic回歸分析

Tao等研究報(bào)道，口咽鱗狀細(xì)胞癌中TGF-β可能通過(guò)調(diào)控HPV16水平，影響癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Liu等在非小細(xì)胞肺癌研究中表明，HPV16 E6蛋白在癌細(xì)胞中通過(guò)上調(diào)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化水平，促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，HPV16陽(yáng)性病人血清miR-145水平明顯低于HPV16陰性病人，且宮頸癌病人血清miR-145與宮頸脫落細(xì)胞HPV16 E6 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示miR-145可能通過(guò)TGF-β調(diào)控HPV16水平，影響上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展。

本研究還發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)次數(shù)＞1、HPV16陽(yáng)性、miR-145低表達(dá)是影響宮頸癌發(fā)生獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且miR-145預(yù)測(cè)宮頸癌發(fā)生的曲線下面積為0.887，靈敏度為85.50%，特異度為86.70%，診斷價(jià)值較高。進(jìn)一步提示miR-145低表達(dá)可能作為早期宮頸癌診斷標(biāo)志物，為臨床診治宮頸癌提供一定幫助。

綜上所述，與對(duì)照組相比，宮頸癌組血清miR-145水平顯著降低，宮頸脫落細(xì)胞HPV16陽(yáng)性率及HPV16 E6 mRNA表達(dá)水平顯著升高，miR-145可能與HPV16相互作用，共同影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展。但由于本研究樣本量較少，研究較為基礎(chǔ)，具體機(jī)制尚需進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。