譚蘭芳，許文珍，楊躍歌，孟繁欽(牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

0 引言

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)為茜草科耳草屬的一年生披散草本植物，化學(xué)成分主要含有黃酮類、蒽醌類、萜類、甾醇類、多糖類、有機(jī)酸類等。其中的多糖成分具有抗突變的作用，能夠預(yù)防腫瘤的出現(xiàn)和抑制其生長繁殖，而且還能夠增強(qiáng)免疫力和抵抗衰老延長壽命。本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)法，考察超臨界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖工藝中的萃取壓力、萃取溫度、攜帶劑(乙醇)濃度和料液比對粗多糖萃取率的影響，優(yōu)選出最佳萃取工藝，并利用苯酚—硫酸比色法測定最佳工藝條件下萃取所得白花蛇舌草粗多糖的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

白花蛇舌草，安徽漢楓中藥飲片有限公司；CO2氣體，牡丹江市金瑞氣體有限公司；無水乙醇(分析純)，哈爾濱試劑化工廠；葡萄糖(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；苯酚(分析純)，沈陽試劑一廠；硫酸(分析純)，淄博庫侖分析儀器有限公司；HA220-50-60型超臨界萃取裝置，江蘇南通市華安超臨界萃取有限公司；R205B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申勝生物技術(shù)有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超臨界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖

稱量50 g過100目標(biāo)準(zhǔn)藥篩的白花蛇舌草粉末，裝入料筒后，將其置于1 L萃取釜中借助壓環(huán)和上堵頭進(jìn)行密封，通入攜帶劑乙醇，待萃取溫度及萃取壓力至設(shè)定值后，進(jìn)行循環(huán)萃取并開始計(jì)時(shí)，達(dá)到萃取時(shí)間后，依次收集分離釜Ⅰ、Ⅱ內(nèi)的萃取物，備用。

取出旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的收集瓶，裝入收集得到的萃取物。當(dāng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，啟動(dòng)真空泵，開始減壓蒸餾，待萃取物呈現(xiàn)糊狀后停止并取出。將糊狀物置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥4 h，得到粗多糖，精確稱量其質(zhì)量并計(jì)算萃取率。白花蛇舌草粗多糖萃取率計(jì)算公式為：

1.2.2 白花蛇舌草粗多糖萃取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

為給正交實(shí)驗(yàn)水平選取提供依據(jù)，在固定分離壓力及分離溫度的前提下，借助單因素實(shí)驗(yàn)法，分別考察不同萃取壓力(10、20、30、40、50 MPa)、萃取溫度(20、30、40、50、60 ℃)、乙醇濃度(10%、30%、50%、70%、90%)及料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)對粗多糖萃取率的變化影響。

1.2.3 正交優(yōu)化超臨界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以白花蛇舌草粗多糖萃取率為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，各因素與水平情況，見表1。綜合文獻(xiàn)報(bào)道，正交實(shí)驗(yàn)的萃取時(shí)間設(shè)置為1 h。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表

1.2.4 白花蛇舌草粗多糖的含量測定

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。將無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品干燥至恒重，精確稱取0.02 g置于容量瓶中，加適量蒸餾水溶解后定容至100 mL，制得0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10 mL容量瓶5個(gè)，分別精密吸取2、2.5、3、3.5、4 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液加入其中，蒸餾水定容至刻度。精確吸取各種溶液1 mL置于5個(gè)試管中，再向各試管精確添加1 mL的5%苯酚溶液后，迅速滴加98%的濃硫酸，混勻，沸水浴10 min后，冷卻20 min，用紫外分光光度計(jì)在490 nm最大吸收波長處測定其吸光度值，縱坐標(biāo)為吸光度值，橫坐標(biāo)為樣品濃度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：

式中：A為吸光度值；C為樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)。

(2)白花蛇舌草粗多糖的含量測定。精確稱取一定量的干燥粗多糖，適量蒸餾水溶解后，定容至150 mL容量瓶中，作為供試品溶液。按照苯酚-硫酸法測定其吸光度，代入回歸方程計(jì)算多糖的含量，計(jì)算公式如下：

式中：C為白花蛇舌草多糖濃度；D為分取的倍數(shù)；W為白花蛇舌草稱取量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取壓力對白花蛇舌草粗多糖萃取率的影響

萃取溫度40 ℃，攜帶劑濃度40%，料液比1∶3的條件下，白花蛇舌草粗多糖萃取率在萃取壓力30 MPa時(shí)出現(xiàn)最大值。萃取壓力在20～30 MPa之間萃取率值變化趨勢平緩，所以選定萃取壓力在20～30 MPa間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 萃取溫度對白花蛇舌草粗多糖萃取率的影響

萃取壓力20 MPa，攜帶劑濃度40%，料液比1∶3的條件下，當(dāng)萃取溫度控制在40～50 ℃之間，粗多糖萃取率值變化平緩，且萃取溫度高于50 ℃后，萃取率值不斷降低，故選定萃取溫度在50 ℃左右進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。

2.1.3 攜帶劑濃度對白花蛇舌草粗多糖萃取率的影響

萃取壓力20 MPa，萃取溫度40 ℃，料液比1∶3的條件下，攜帶劑濃度為30%時(shí)粗多糖萃取率最大，故選定攜帶劑濃度在30～50%之間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 料液比對白花蛇舌草粗多糖萃取率的影響

萃取壓力20 MPa，萃取溫度40 ℃，攜帶劑濃度40%的條件下，料液比在1∶6時(shí)萃取率值最高，故選定料液比為1∶6左右進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共進(jìn)行9組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，極差最大的為因素C，其次為因素B，再次為因素A，最小的為因素D，即超臨界CO2萃取工藝中對白花蛇舌草粗多糖萃取率的因素影響主次順序?yàn)镃(乙醇濃度)＞B(萃取溫度)＞A(萃取壓力)＞D(料液比)。按照平均值大小選取最優(yōu)水平為A2B1C3D3，即在料液比是1∶8和使用40%的乙醇，并設(shè)定萃取壓力為25 MPa和萃取溫度為40 ℃。

3 最優(yōu)萃取工藝的驗(yàn)證

上述優(yōu)化結(jié)果為理論分析得到，需進(jìn)一步驗(yàn)證。按優(yōu)化方案A2B1C3D3進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行重復(fù)3次，計(jì)算平均值。結(jié)果得出白花蛇舌草粗多糖的平均萃取率為0.364%，優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)中各次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明此次的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)合理可行。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

4 多糖純度的測定

利用苯酚—硫酸比色法測定最佳工藝條件下萃取所得白花蛇舌草粗多糖的純度為66%，含量較高。

5 結(jié)語

本研究對超臨界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖萃取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，即在萃取時(shí)長為1 h，使用40%乙醇為攜帶劑，料液比控制為1∶8，萃取壓力25 MPa，萃取溫度30 ℃的條件下，粗多糖的得率最高。為今后超臨界CO2萃取技術(shù)應(yīng)用于多糖萃取提供了有益的參考，同時(shí)為白花蛇舌草資源利用提供部分依據(jù)，具有一定實(shí)用和推廣價(jià)值。