郭永杰，滕 青，楊志超，劉生玉，溫全寶

(太原理工大學礦業(yè)工程學院，山西 太原 030024)

粉煤灰是煤炭燃燒的主要副產(chǎn)品，2018年中國粉煤灰年產(chǎn)量達7.3億t，產(chǎn)量和儲量均為世界第一位。山西省作為燃煤大省，清潔高效的利用粉煤灰，是建設(shè)和完善資源導向型經(jīng)濟不可或缺的一環(huán)[1]。粉煤灰主要由硅和鋁的氧化物組成，利用化學工藝脫硅和除鋁是目前主要的研究方向，但實驗流程和所用藥劑對環(huán)境污染大且成本較高[2-3]。

微生物作為生物圈中重要的分解者，其自身生命活動和酸性代謝產(chǎn)物在巖層風化中扮演重要角色。鐘嬋娟等[4]和張賢珍等[5]研究表明，微生物增殖和代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)會選擇性地與不同結(jié)構(gòu)硅酸鹽發(fā)生絡(luò)合作用或鰲合作用，使其中的離子溶出，達到元素分離和富集的目的。而微生物吸附于礦樣表面后對礦物的鉆孔、劈裂的作用也對礦樣溶蝕產(chǎn)生一定促進作用[6]。當前微生物浸礦的研究主要集中于鋁土礦等硅酸鹽化合物的生物脫硅，也有很多學者將芽孢桿菌、黑曲霉和氧化亞鐵硫桿菌等菌株應(yīng)用于對礦物中銅、鐵、鉀、鈾和稀有元素的浸出并取得良好效果[7-9]。使用微生物對礦物中有價離子進行浸出，相比于傳統(tǒng)化學方法具有流程簡單、可持續(xù)反應(yīng)、環(huán)境污染小等優(yōu)點[10-11]。粉煤灰中含有莫來石、石英和無定型玻璃體等大量硅酸鹽化合物，常用于分解硅酸鹽礦物的細菌如芽孢桿菌和曲霉廣泛存在于土壤中[12]。以芽孢桿菌對粉煤灰進行生物浸出，探究其生物脫硅的最佳條件和浸礦機理，可以實現(xiàn)降低粉煤灰中SiO2含量而提高Al、Mg、Ca、Mn等元素品位的目的，進而為這些有用元素的提取創(chuàng)造有利條件[9,13-14]，同時脫硅液可研究制備白炭黑[15]，也可為后期通過誘變育種以獲得高效脫硅菌株提供理論數(shù)據(jù)。此外，提取有用元素后的微生物脫硅液中含有離子態(tài)硅元素和豐富的有機物質(zhì)，能夠作為一種適宜的肥料[16]。

目前，國內(nèi)外鮮有對粉煤灰生物浸出的相關(guān)研究報道。本文選用一株篩選出的解淀粉芽孢桿菌，研究其最適生長和浸礦條件，以及在浸出過程中Si2+的溶出效果。并使用SEM-EDS和FTIR對礦物進行表征形態(tài)觀察，分析菌種浸礦機理，為后續(xù)生物脫硅實驗的設(shè)計和操作提供理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

用于菌種分離所需的土壤樣品取自山西省太原市太原理工大學虎峪校區(qū)。

實驗所用粉煤灰取自山西省太原市西山煤電廠，其化學成分和粒度分級分別見表1和表2。

細菌培養(yǎng)和浸礦所需培養(yǎng)基為察氏瓊脂培養(yǎng)基(Czapek’s Agar)，配方如下：蔗糖30 g/L，NaNO33 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，K2HPO41 g/L，瓊脂13 g/L，無菌水1 000 mL。其中瓊脂根據(jù)所需培養(yǎng)基性狀添加，并使用HCl和NaOH調(diào)整培養(yǎng)基初始pH值為7.2，滅菌備用。

1.1.2 浸礦菌種的篩選鑒定

將取得的土壤樣品稀釋于100 mL無菌水中，取上清液加入到無菌培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)3 d后靜置，用無菌管取上清液1 mL注入裝有9 mL無菌水的玻璃管中吹吸3次混勻。用此稀釋方法制得10-5、10-6和10-7稀釋度的菌液并涂布于無菌平板培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)。待其生長出單菌落后用接菌針挑取并接種于液體培養(yǎng)基中。重復純化操作3～4次，將得到的純化菌株編號保存。將純化菌株接種于100 mL Czapek’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，取6 mL菌液接種于100 mL濃度6%的粉煤灰礦漿中搖瓶浸出7 d，使用硅鉬藍分光光度法測定礦漿中Si2+含量，得到一株有脫硅效果的菌株。經(jīng)生理生化和16sRNA鑒定為解淀粉芽孢桿菌，其菌落SEM照片如圖1所示。將菌株命名為ZGW-12，在100 mL液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)3 d后作為浸礦菌種備用。

表1 粉煤灰化學成分分析

表2 粉煤灰粒度分析

圖1 ZGW-12解淀粉芽孢桿菌SEM圖

1.2 實驗方法

1.2.1 Si2+含量、Al3+含量和菌液濃度檢測

Si2+含量和Al3+含量測定：使用硅鉬藍分光光度法和鉻天青S分光光度法測定礦漿中Si2+含量和Al3+含量，制備標準樣測定標準曲線如圖2(a)和圖2(b)所示，求得標準液中Si2+含量和Al3+含量與吸光度的線性回歸方程[17-18]。

取培養(yǎng)2.5 d的ZGW-12菌液，將其稀釋為不同倍數(shù)通過稀釋涂布平板法確定菌液濃度，同時測定相應(yīng)的吸光度值(600 nm處)， 以低于0.7的OD600值為橫坐標，相應(yīng)菌液濃度為縱坐標作圖得線性回歸方程如圖2(c)所示[19]。

測定吸光度時如實測OD值大于0.7，需稀釋待測液至吸光度為0.7以下，測定值依稀釋比例換算為實際值。

圖2 Si2+、Al3+和細菌數(shù)目標準曲線

1.2.2 細菌培養(yǎng)和浸出條件的優(yōu)化

向250 mL錐形瓶中添加100 mL液體培養(yǎng)基，滅菌后接種菌6 mL，設(shè)置搖床(智城恒溫培養(yǎng)振蕩器ZWY-2102)轉(zhuǎn)速為150 r/min，使用比色法測定不同溫度、接菌量和轉(zhuǎn)速下的菌種生長情況，研究其最適培養(yǎng)條件。 根據(jù)所得最適培養(yǎng)條件測定ZGW-12生長曲線，取進入穩(wěn)定期的菌液作為生物浸出所用接菌液。

將粉煤灰置于干燥箱中75 ℃烘干24 h后將其中結(jié)塊物質(zhì)全部碾碎為粉末，向100 mL液體培養(yǎng)基中添加6 g礦樣并滅菌，并設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。研究ZGW-12浸礦所需最適的溫度、接菌量、轉(zhuǎn)速和礦物添加量。將粉煤灰進行粒度組成分析，并對篩分后的不同粒度粉煤灰浸礦脫硅，研究粒度對Si2+浸出的影響。

除非特殊說明，否則對細菌培養(yǎng)和浸出的各因素研究均在前期實驗所得最適培養(yǎng)條件下開展。

1.2.3 細菌對粉煤灰的浸出實驗研究

應(yīng)用實驗得到的最適浸出條件對粉煤灰浸礦脫硅31 d，測定Si2+溶出量和Al3+溶出量，研究細菌脫硅能力。通過SEM-EDS觀察礦樣表面形貌和組成成分含量變化；使用FTIR對原礦和浸礦處理后的礦樣檢測分析，比較浸礦前后吸收峰值變化，從而確定菌種脫硅效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌培養(yǎng)和浸礦條件優(yōu)化

2.1.1 溫度對細菌生長與浸礦效果的影響

圖3為培養(yǎng)2.5 d后菌液濃度和浸礦6 d后礦漿中Si2+濃度變化曲線。對比圖3(a)和圖3(b)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度低于30 ℃時菌液濃度隨培養(yǎng)溫度的升高而增大，同時礦漿中Si2+濃度逐漸升高；當環(huán)境溫度高于30 ℃時菌液濃度隨溫度升高而降低，礦漿中Si2+濃度也保持這一趨勢；表明細菌生長和Si2+濃度變化趨勢基本相同，細菌數(shù)目直接影響粉煤灰的脫硅效果。由圖3可知，ZGW-12對環(huán)境溫度較為敏感，且30 ℃為細菌繁殖和脫硅的最佳溫度。細菌在一定的溫度范圍內(nèi)繁殖和浸礦效果最佳，所以適宜的溫度是細菌生長和浸礦實驗中不可或缺的條件。低于細菌的最適溫度，會使細胞中生物酶活性降低，生命代謝和增殖速度也會降低；而溫度過高，不僅會使其蛋白質(zhì)失活，更會使細胞膜通透性發(fā)生改變，胞內(nèi)生物化學反應(yīng)停止，造成細胞死亡。同時相關(guān)研究表明芽孢桿菌屬種在生長過程中會產(chǎn)生酸性代謝物質(zhì)[20]，這些物質(zhì)可以與礦物中的成分發(fā)生反應(yīng)使其分解，使Si2+溶于礦漿中；溫度的改變會影響細菌產(chǎn)酸能力，從而影響其脫硅能力。所以將后期浸礦實驗最適溫度確定為30 ℃。

圖3 不同溫度對細菌生長和脫硅效果的影響

圖4 不同初始接菌量對細菌生長和脫硅效果的影響

2.1.2 初始接菌量對細菌生長和浸礦效果的影響

不同初始接菌量下細菌生長和浸礦脫硅結(jié)果如圖4所示。不同初始接菌量下菌液濃度見圖4(a)。隨初始接菌量增加，2.5 d后培養(yǎng)基中細菌濃度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。其中初始接菌量5 mL時生長效果達到4.3×108個/mL。初始接菌量影響著培養(yǎng)基中初始細菌含量和細菌繁殖速度，當初始接菌量過低時菌種初始繁殖速度較慢，影響其單位時間內(nèi)繁殖數(shù)量；一定轉(zhuǎn)速下溶液中氧氣溶解量相對恒定，當初始接菌量過高時細菌初始繁殖速度快，培養(yǎng)基中所含氧氣不足以維持菌體細胞完成充分的有氧呼吸，導致菌種活性降低，繁殖速率減慢。 且培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)有限，菌種在較早的時間達到環(huán)境容納量上限，接著部分發(fā)生死亡，使得細菌濃度降低。

圖4(b)為不同初始接菌量下浸礦7 d后礦漿中Si2+濃度曲線，由圖4(b)可知,ZWG-12脫硅的最佳初始接菌量為5～8 mL。與圖4(a)相比，相同初始接菌量下細菌脫硅能力與繁殖速度略有不同，因為粉煤灰是多元素聚合體，其中部分元素會對浸礦菌種的生長或細胞活性產(chǎn)生影響，如促進其分泌更多的酸性代謝產(chǎn)物或者增強其細胞中生物酶活性，使其脫硅能力增強。由此確定細菌培養(yǎng)和浸礦脫硅初始接菌量均為5 mL，菌群數(shù)約為2.1×109個。

2.1.3 轉(zhuǎn)速對細菌生長和浸礦效果的影響

圖5為不同轉(zhuǎn)速對細菌生長和脫硅效果的影響。圖5(a)為菌種培養(yǎng)2.5 d后的細菌濃度曲線，由圖可知在125 r/min條件下細菌培養(yǎng)效果最佳。浸礦7 d后Si2+濃度曲線如圖5(b)所示，當轉(zhuǎn)速大于150 r/min后，礦漿中Si2+濃度保持在185 mg/L左右，細菌脫硅效果保持相對穩(wěn)定。解淀粉芽孢桿菌為好養(yǎng)菌，主要以呼吸產(chǎn)生能量，富氧環(huán)境利于其代謝繁殖，當培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源時菌種可進行厭氧繁殖[20]，但細胞活性弱。其被認為是枯草芽孢桿菌的變種細菌之一，兩者基因序列有很高的親緣性，菌種理化性質(zhì)相似。結(jié)合圖5(a)和5(b)分析發(fā)現(xiàn)搖床轉(zhuǎn)速對于細菌培養(yǎng)和脫硅效果影響不同。通過設(shè)定不同的搖床轉(zhuǎn)速不但可以控制溶液中氧氣的溶解量，還可以影響礦物顆粒與細菌個體之間的接觸，從而影響細胞對礦物的吸附程度。當轉(zhuǎn)速過低時培養(yǎng)基中氧氣含量不足以維持細胞的好氧生長，細菌增殖緩慢；當轉(zhuǎn)速過高時，氧含量增加使細胞代謝加快，短期產(chǎn)生大量有害代謝廢物，抑制細胞增殖。 而在礦漿中因為有粉煤灰顆粒的存在，細菌代謝產(chǎn)生的物質(zhì)會吸附于粉煤灰或與其中成分發(fā)生生物化學反應(yīng)而有所消耗，使得在更高的轉(zhuǎn)速下菌種有較好的生物脫硅能力。 另外粉煤灰的存在也可能會影響礦漿中溶解氧氣的能力。 根據(jù)實驗結(jié)果，確定細菌培養(yǎng)和后續(xù)浸礦實驗所用轉(zhuǎn)速分別為125 r/min和150 r/min。

圖5 不同轉(zhuǎn)速對細菌生長和脫硅效果的影響

2.1.4 礦漿濃度對浸礦效果的影響

圖6為接菌5 mL對不同濃度礦漿浸礦7 d的脫硅結(jié)果。 由圖6可知，礦漿濃度為7.5%以下時，隨著礦漿濃度的增加，浸礦后Si2+濃度隨之增加；當?shù)V漿濃度為7.5%～12.5%時，Si2+濃度基本保持不變；當?shù)V漿濃度大于12.5%時Si2+濃度有所降低。微生物浸礦脫硅過程中，接菌量與礦漿濃度需保持一定比例，使得微生物及其代謝產(chǎn)物可以與礦物充分接觸并發(fā)生反應(yīng)。當粉煤灰添加不足時，實驗前期粉煤灰中活性物質(zhì)即被微生物分解完畢；當粉煤灰添加量過高時，在搖瓶浸礦過程中礦物顆粒間相對距離不足，更易發(fā)生碰撞和摩擦，不僅使細菌難以吸附于礦物顆粒表面，也會使得細胞受到損傷無法達到最佳的浸礦效果。所以，從細菌和礦物充分反應(yīng)的角度考慮，選擇最適礦漿濃度為7.5%。

圖6 礦漿濃度對細菌浸出的影響

2.2 最適條件下細菌生長曲線和脫硅實驗

在前期實驗所得最適溫度、轉(zhuǎn)速、初始接菌量和礦漿濃度的條件下測定菌種生長曲線和Si2+濃度、Al3+濃度如圖7所示。 由圖7(a)可知，ZGW-12增殖呈現(xiàn)前期緩慢，進入指數(shù)增長期(1.5～4 d)后快速繁殖，之后菌液濃度呈現(xiàn)相對穩(wěn)定的整體趨勢。 菌液中細菌最大數(shù)值可達到8.9×108個/mL，培養(yǎng)4 d時細菌濃度可達到8.5×108個/mL，接近于培養(yǎng)基能容納的最大菌液濃度，所以將浸礦所需接菌液的培養(yǎng)天數(shù)確定為4 d。

將100 mL濃度為7.5 %的粉煤灰礦漿滅菌并接種5 mL菌液，菌群數(shù)約為4.2×109個，在30 ℃和150 r/min條件下?lián)u瓶浸出31 d，測定Si2+濃度曲線和Al3+濃度曲線如圖7(b)所示。由圖7(b)可知，隨浸礦時間增加，礦漿中Si2+濃度逐漸增加，到19 d時達到306 mg/L，之后略有下降；而Al3+濃度基本保持在0.5 mg/L，ZGW-12在實驗中對粉煤灰表現(xiàn)出良好的脫硅提鋁效果。實驗前期礦漿中含有充足的營養(yǎng)物質(zhì)，隨著浸礦時間增長細菌大量繁殖并產(chǎn)生多種酸性代謝物對粉煤灰顆粒進行溶蝕，使得Si2+濃度持續(xù)升高。浸礦后期(19 d以后)礦漿中營養(yǎng)物質(zhì)隨著細菌生長和脫硅反應(yīng)消耗殆盡，細菌開始利用前期溶出的Si2+作為維持自身生命活動的替代物質(zhì)，使得礦漿中Si2+濃度逐漸降低，并隨著細菌的逐漸死亡最終濃度保持相對穩(wěn)定[6]。浸礦過程中微生物通過自身生命活動破壞礦物結(jié)構(gòu)構(gòu)造，并且其酸性代謝物會解離成H+和有絡(luò)合能力的有機配位體。不斷析出的H+與礦物中硅酸鹽成分發(fā)生酸解反應(yīng)，有絡(luò)合能力的有機配位體與礦樣中析出的Si2+形成絡(luò)合物溶于礦漿，而這些配位體與Al3+形成的有機酸-Al多聚物則形成沉淀附著于粉煤灰顆粒表面，形成浸出后礦樣中Si2+含量降低而Al3+含量升高的現(xiàn)象[21]。

圖7 最適條件下菌種生長和浸礦31 d Si2+濃度、Al3+濃度曲線

2.3 粒度對浸礦效果的影響

圖8為不同粒度粉煤灰脫硅結(jié)果。由篩分分析可知實驗所用粉煤灰包含不同粒度，其中粒度小于38 μm的粉煤灰占比最多。不同粒度粉煤灰各取7.5 g浸礦7 d，發(fā)現(xiàn)粒度小于75 μm的脫硅效果優(yōu)于粒度大于75 μm的粉煤灰。 其中粒度為38～45 μm的粉煤灰脫硅效果最好，可以達到200 mg/L。由此可知在浸礦脫硅過程中，溶出的Si2+主要來源為粒度小于75 μm的粉煤灰。 原因是當?shù)V樣顆粒變小，能與礦漿中細菌酸性產(chǎn)物反應(yīng)的比表面積增大，其中的硅酸鹽化合物更易被酸性物質(zhì)分解而溶于礦漿中。

圖8 不同粒度粉煤灰脫硅效果

2.4 礦樣SEM-EDS分析

圖9(a)和圖9(b)分別為浸礦前和浸礦5 d時粉煤灰SEM圖。從圖9(a)可以看出，粉煤灰原礦大部分為顆粒狀且表面平整的玻璃微珠，少量為不規(guī)則塊狀，大小從幾微米到上百微米不等。玻璃微珠粒徑和密度不同，其化學特征和礦物學特性也有一定差別，一般粒度越小越易于與酸性物質(zhì)反應(yīng)[22]，這與圖8中不同粒度粉煤灰的浸出結(jié)果相符。由圖7(a)可知，菌種培養(yǎng)4 d后達生長穩(wěn)定期，為盡可能清晰觀察細菌在礦物表面的吸附狀態(tài)，選取浸礦5 d的粉煤灰通過SEM觀測見圖9(b)。圖9(b)為生物脫硅過程中形成的細菌-礦物復合體。微生物在浸礦過程中存在細菌本身的直接吸附和分泌酸性產(chǎn)物的間接溶蝕作用[23]；在浸礦過程中，細胞分泌大量的多糖類物質(zhì)促進其吸附于礦物表面[24]。對于細菌吸附性研究，孫德四等[25]認為細菌個體通過對礦物的吸附而獲取生長所需的營養(yǎng)元素；鈕因健等[26]認為是細胞產(chǎn)生大量多糖使其粘附于礦物表面；也有研究者認為不同菌種細胞表面電負性不同，與特定礦物作用時會發(fā)生靜電吸附作用[27]。

圖10為粉煤灰原礦和浸礦31 d后礦物EDS分析結(jié)果。由圖10可以看出，經(jīng)生物浸礦處理后粉煤灰中Si、Al占比分別從25%和20.53%變?yōu)?2.93%和21.81%，Si含量占比降低而Al含量占比增高，說明ZGW-12對粉煤灰有脫硅提鋁的作用，與圖7(b)中浸礦脫硅31 d的實驗結(jié)果相符。同時，粉煤灰中Fe含量和K含量也略微降低，說明菌種對這兩種元素也有一定的浸出作用。

圖9 浸礦前后粉煤灰SEM圖

圖10 粉煤灰原礦和浸礦31 d粉煤灰EDS分析結(jié)果

2.5 粉煤灰紅外光譜分析

圖11 粉煤灰原礦與浸礦31 d的粉煤灰FTIR圖

將粉煤灰原礦和浸礦處理31 d的粉煤灰50 ℃烘干后經(jīng)FTIR分析如圖11所示。峰值3 450 cm-1處附近O—H伸縮振動峰(—OH和—NH帶的組合)強度有所增強，有文獻報道微生物分泌的有機酸會與硅酸鹽礦物發(fā)生羥基化反應(yīng)[28-29]。在浸礦實驗中，細菌在礦漿中快速繁殖，并吸附于礦物表面。經(jīng)烘干處理后微生物細胞膜和細胞質(zhì)等蛋白類物質(zhì)(含有氨基)殘留于礦物表面造成3 450 cm-1峰值上升，說明在浸礦過程中有細菌個體吸附于礦物表面[23]。峰值為1 100 cm-1左右的O—Si—O伸縮振動峰強度較浸礦前明顯減弱，說明礦物中有大量Si—O鍵在浸礦過程中被破壞。

3 結(jié) 論

1) 經(jīng)分離鑒定，浸礦所用菌種為解淀粉芽孢桿菌。經(jīng)實驗確定菌種最適培養(yǎng)條件為：100 mL液體培養(yǎng)基中接菌5 mL，在30 ℃和125 r/min下培養(yǎng)4 d達到生長穩(wěn)定期。

2) 實驗確定粉煤灰浸礦條件為：100 mL濃度為7.5%的礦漿中接菌5 mL，在30 ℃、150 r/min下?lián)u瓶浸礦。礦漿中Si2+濃度在19 d時達到306 mg/L，而Al3+濃度基本保持在0.5 mg/L。

3) 浸礦過程中細菌會與粉煤灰顆粒形成復合體；同時礦樣Si—O振動峰降低，說明菌種及其代謝產(chǎn)物會分解礦樣中硅酸鹽化合物使Si2+溶于礦漿中。實驗結(jié)果表明ZGW-12可以將粉煤灰中硅元素浸出的同時保留鋁元素，降低礦樣硅鋁比。