盧厚新，楊清泉，郭 石

(1.南陽市中心醫(yī)院 全科醫(yī)學科，河南 南陽 473000;2.開封市兒童醫(yī)院 藥學部，河南 開封 475000)

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)是影響全世界人類生命健康的主要疾病之一[1]。低氧應激是IHD心肌細胞損傷的主要原因，其可通過促進細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)，進而激活胱天蛋白酶級聯(lián)反應，最終誘導心肌細胞凋亡[2]。心肌細胞凋亡是導致IHD的心臟功能障礙的主要原因之一[3]。因此，減少缺氧誘導的心肌細胞凋亡是預防和治療IHD的重要策略之一。

傳統(tǒng)中草藥具有多種生物活性的天然化合物，其具有良好的治療功效，且副作用極小，這為開發(fā)IHD藥物提供了重要的來源[4]。槐果堿(sophoridine，Sop)是一種從豆科植物槐、刺槐和莖槐的莖和葉中分離出來的具有抗感染、抗病毒和抗癌等多種藥理活性的喹唑烷類生物堿[5]。本研究主要探討Sop對低氧引起的心肌細胞系H9c2損傷的影響并分析其機制，其將為進一步闡明Sop在IHD預防和治療中的有益作用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與實驗試劑

大鼠心肌細胞系H9c2(myocardial cell line H9c2)和FITC-annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒(武漢普諾賽生命科技有限公司)；胎牛血清(Invitrogen公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；青霉素、鏈霉素和槐果堿(Sop，HPLC純度>98%)(Sigma-Aldrich公司)；MTT試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測定試劑盒、丙二醛(malonyldialdehyde，MDA)測定試劑盒和細胞裂解液(上海碧云天生物科技有限公司)；二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)綴合的山羊抗兔IgG(H+L)二抗(廣州賴德生物技術(shù)有限公司)；兔單克隆一抗cleaved-caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT(Cell Signaling Technology公司)和β-actin(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)和分組處理：將H9c2細胞接種在補充有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

將細胞分為對照組、低氧模型組(細胞置于含有1% O2、5% CO2和94% N2的低氧艙中48 h)和低氧+低、中、高濃度槐果堿處理組(從低氧開始時分別加入1、4和16 mmol/L的槐果堿處理細胞48 h)。

1.2.2 MTT法測定細胞活力：將各組細胞以5×103個/孔接種在96孔板中，向每個孔中添加20 μL MTT試劑(5 g/L)，再培養(yǎng)4 h，然后每孔添加100 μL二甲基亞砜溶解結(jié)晶。用自動酶標儀在波長560 nm處測量吸光度值。

1.2.3 測定LDH釋放水平：將各組細胞以5×103個/孔接種在96孔板中，收集培養(yǎng)基上清液。按照LDH測定試劑盒說明書步驟操作，用自動酶標儀在波長490 nm處測量吸光度值。

1.2.4 測定MDA的含量：收集各組細胞，用細胞裂解液裂解細胞。將裂解的細胞離心，收集上清液，并用BCA試劑盒法對蛋白定量。取裂解的上清液并根據(jù)MDA測定試劑盒說明書步驟進行MDA水平的測量。將MDA含量用蛋白含量進行歸一化處理。

1.2.5 流式細胞測量術(shù)檢測細胞凋亡：收集分組細胞，按照FITC-annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟，分別將其重懸于200 μL含有10 μL FITC-annexin V的結(jié)合緩沖液中，并在暗室中室溫孵育30 min，然后將加入300 μL 含有5 μL PI結(jié)合緩沖液并在暗室中室溫孵育10 min。用流式細胞儀分析樣品，并用FlowJo 7.2.4軟件計算細胞凋亡水平。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達量：收集分組細胞，并裂解緩沖液分離出蛋白。用BCA(英文全稱)蛋白質(zhì)定量試劑盒對各組蛋白濃度的濃度進行定量。每組樣品取30 μg蛋白進行Western blot電泳。將電泳分離的蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(polyvinyli-dene fluoride，PVDF)膜，并經(jīng)封閉后，分別室溫孵育1∶1 000稀釋比例的一抗(cleaved-caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和β-actin)2 h。洗滌膜后，再室溫孵育1∶1 000稀釋比例的HRP綴合的山羊抗兔IgG(H+L)二抗1 h。再次洗滌膜后，用ECL試劑顯影，并用ChemiDocTMXRS系統(tǒng)拍照蛋白質(zhì)條帶。使用Image LabTM軟件對條帶的吸光度值進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 槐果堿(Sop)恢復低氧誘導的H9c2細胞的細胞損傷

對照組細胞形態(tài)正常，低氧模型組中細胞稀疏并出現(xiàn)拉絲狀況，低氧+低、中、高濃度Sop處理組中低氧導致的拉絲情況明顯改善且細胞數(shù)目明顯增加(圖1A)。與對照組相比，低氧模型組細胞活性明顯降低(P<0.001)；與低氧模型組相比，Sop以濃度依賴性方式增加細胞活力(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(圖1B)。

2.2 槐果堿(Sop)減少低氧誘導的H9c2細胞的LDH釋放和MDA含量

與對照組相比，低氧模型組LDH的釋放和MDA含量均明顯增加(P<0.001)，而Sop處理則濃度依賴性抑制低氧導致的LDH的釋放和MDA含量(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(圖2)。

A.representative phase contrast microscope images of cells in each group;scale bar=50 μm;B.statistical results of cell viability in each group;#P<0.001 compared with the control group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with the hypoxia model group (Hyp)圖1 各組H9c2細胞形態(tài)與活力Fig 1 Cell morphology and cell viability of H9c2 cells in each n=4)

A.statistical results of LDH release in each group;B.statistical results of MDA content in each group;#P<0.001 compared with the control group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with the hypoxia model group(Hyp)圖2 各組H9c2細胞LDH釋放量和MDA含量Fig 2 LDH release and MDA content of H9c2 cells in each n=4)

2.3 槐果堿(Sop)減少低氧誘導的H9c2細胞凋亡

與對照組相比，低氧模型組細胞凋亡明顯增加(P<0.001)，而槐果堿處理則濃度依賴性地抑制低氧導致的細胞凋亡(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(圖3)。

2.4 槐果堿(Sop)降低低氧導致的H9c2細胞cleaved-caspase-3表達和增強PI3K/AKT信號活性

與對照組相比，低氧模型組cleaved-caspase-3表達明顯增加(P<0.001)，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比率均明顯降低(P<0.001)，而Sop處理則濃度依賴性地緩解上述指標變化(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(圖4)。

3 討論

氧氣供應不足是造成IHD中心肌細胞受損的最重要的病理生理機制之一[2,6]。此項研究證實了槐果堿能緩解低氧引起的大鼠心肌細胞系H9c2損傷，提示，槐果堿是潛在的抗IHD的藥物。

低氧引起的氧化還原能力過強是由于ROS生成過多和抗氧化系統(tǒng)受損所致[7]。MDA含量可間接反映細胞過氧化損傷程度[7]，LDH是細胞損傷的重要標志[8]。本研究提供的證據(jù)表明：Sop可通過抗氧化作用抑制了低氧誘導的H9c2細胞損傷，主要體現(xiàn)在其減少低氧導致的MDA蓄積和LDH生成所實現(xiàn)的。過度的氧化應激可導致細胞活性降低和細胞凋亡的發(fā)生[7-9]。本研究結(jié)果顯示：低氧環(huán)境顯著抑制了心肌細胞的活力并誘導了細胞凋亡，而Sop治療可逆轉(zhuǎn)上述指標。為進一步證實Sop對低氧誘導的H9c2細胞的抗凋亡活性，在本研究中檢測了凋亡標志蛋白cleaved-caspase-3[9]，結(jié)果表明：Sop在低氧環(huán)境中呈劑量依賴性降低H9c2細胞中cleaved-caspase-3的表達。

PI3K/AKT通路在細胞存活中起著關(guān)鍵作用，尤其是在低氧環(huán)境下[10-11]。低氧可通過降低PI3K/AKT信號活性，從而導致使心肌細胞凋亡[11]。有研究顯示，Sop通過抑制氧化應激、炎性反應和細胞凋亡來減輕LPS引起的肝損傷[12]。本研究發(fā)現(xiàn)：低氧可顯著滅活H9c2細胞中的PI3K/AKT信號活性，而Sop治療可緩解H9c2細胞中低氧引起的PI3K/AKT信號的失活。這些結(jié)果表明，Sop可能通過激活PI3K/AKT信號活性來緩解低氧引起的心肌細胞損傷。

A.representative flow cytometry scatter images in each group;B.statistical results of apoptosis in each group;#P<0.001 compared with the control group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with the hypoxia model group(Hyp)圖3 Sop對各組H9c2細胞凋亡的影響Fig 3 Effects of Sop on the apoptosis of H9c2 cells in each n=4)

A.the bands representing the protein expressions of cleaved-caspase-3,PI3K,p-PI3K,AKT,and p-AKT in each group;B.relative gray value of cleaved-caspase-3;C.statistical results of the expression of cleaved-caspase-3,and the ratios of p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT in each group;#P<0.001 compared with the control group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with the hypoxia model group (Hyp)圖4 各組H9c2細胞中cleaved-caspase-3、p-PI3K和p-AKT蛋白表達情況Fig 4 Expressions of cleaved-caspase-3,p-PI3K and p-AKT of H9c2 cells in each n=4)

綜上所述，本研究驗證了Sop能減輕低氧引起的心肌細胞損傷，其作用可能與Sop抗氧化作用以及激活PI3K/AKT通路信號活性相關(guān)。本研究結(jié)果為明確Sop在IHD中的有益作用提供了理論和實驗依據(jù)。