馬 越，郭桂蘭，高燕程，王 楠，張 棟，李明娜

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

卵巢是雌性動(dòng)物的性腺，通常左右成對(duì)存在于母畜的腹腔內(nèi)。動(dòng)物到達(dá)初情期后，在激素的調(diào)控下進(jìn)入發(fā)情周期[1]。此后的卵巢周而復(fù)始地產(chǎn)生類固醇激素，排出卵子，形成黃體，從而使得母畜表現(xiàn)出周期性的發(fā)情狀態(tài)[2]，以便飼養(yǎng)管理人員及時(shí)配種。母畜的生產(chǎn)性能主要表現(xiàn)在產(chǎn)仔、哺乳等與繁殖相關(guān)的活動(dòng)中，然而卵巢的機(jī)能在很大程度上決定著母畜的生產(chǎn)性能[3]。具體來(lái)說(shuō)，卵巢活動(dòng)的正常與否決定著母畜性成熟的早晚、發(fā)情周期的長(zhǎng)短、排卵數(shù)目的多少、卵子受精能力的高低、妊娠、分娩及哺乳能力的高低等多環(huán)節(jié)[4]。因此卵巢在雌性動(dòng)物生產(chǎn)中扮演重要角色，研究卵巢的組織結(jié)構(gòu)對(duì)了解其生理功能至關(guān)重要。

小鼠具有個(gè)體小、生長(zhǎng)快、繁殖力強(qiáng)、飼養(yǎng)方便等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)、疾病模型等方面的研究，尤其是胚胎生物學(xué)和胚胎工程方面的研究[5]。本研究基于模式動(dòng)物小鼠，進(jìn)行幼齡和成年小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)比較，旨在深入了解不同年齡卵巢中各級(jí)卵泡、黃體的形態(tài)差異，剖析卵巢生理功能，為后續(xù)家畜繁殖性能的研究提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠

10只4周齡和10只8周齡成年SPF級(jí)KM白鼠（全雌），購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所。飼養(yǎng)于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物場(chǎng)，室溫條件，自由飲食進(jìn)水。3天無(wú)異常表現(xiàn)后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試劑耗材

實(shí)驗(yàn)所用蘇木精、伊紅染液、中性樹(shù)膠等均為索萊寶公司購(gòu)買；載玻片、蓋玻片自世泰實(shí)驗(yàn)器材公司購(gòu)買；石蠟自上海華靈康復(fù)器械廠購(gòu)買；刀片為德國(guó)萊卡；4%甲醛、無(wú)水乙醇、二甲苯等其他試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.3 常用儀器

本實(shí)驗(yàn)常用儀器有萊卡RM2235輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、科迪 KD-TS3A自動(dòng)脫水機(jī)、科迪KD-P攤片機(jī)、科迪KD-H烘片機(jī)、萊卡光學(xué)顯微鏡等。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 取材與固定 飼養(yǎng)3 d后選取體重相近的4周齡小鼠（體重24.25±2.65 g）和8周齡小鼠（體重32.42±2.75 g）各6只。將所有小鼠做好標(biāo)記，頸部脫臼處死。剪開(kāi)皮膚，用鑷子拉出小鼠左右兩側(cè)子宮和卵巢，用鑷子及手術(shù)刀將卵巢與其他組織器官分割開(kāi)并清除卵巢上的脂肪。后迅速將卵巢浸入4%甲醛溶液內(nèi)固定，防止細(xì)胞死亡后自溶或細(xì)菌分解。

1.4.2 脫水與透明 將卵巢組織從固定液中取出，放在微水流中流水沖洗12 h。后用不同濃度酒精（從低到高）作為脫水劑，逐步脫去組織中的水分，再將組織置于二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織中的酒精。具體溶液的濃度與時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 脫水與透明所用溶液濃度及時(shí)間

1.4.3 浸蠟與包埋 將自動(dòng)脫水機(jī)內(nèi)的組織取出，按合適的方位置于模具中，緩慢倒入已經(jīng)融化好的石蠟，放入熔蠟箱保溫，待石蠟完全浸入組織后進(jìn)行包埋。整個(gè)過(guò)程要求迅速穩(wěn)當(dāng)。

1.4.4 切片與貼片 將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成厚度為5 um薄片。切下的薄片往往過(guò)于皺褶，需放在加熱至25 ℃攤片機(jī)上攤平，再貼到載玻片上（注意不要產(chǎn)生氣泡），后置于45℃的烘片機(jī)上烘干。

1.4.5 脫蠟與染色 本實(shí)驗(yàn)采用HE染色，先經(jīng)2次二甲苯將切片上的石蠟脫盡，用吸水紙吸干液體。脫蠟后經(jīng)不同梯度乙醇下行至流水；蘇木精染液染色，后用蒸餾水洗掉多余的染料；入分化液（1%鹽酸+99%乙醇）分色，分色后用蒸餾水洗；入0.5%伊紅染液染色，后用80%酒精對(duì)伊紅進(jìn)行分色；再以梯度酒精脫水，二甲苯透明。其溶液的濃度與時(shí)間見(jiàn)表2。

表2 脫蠟與染色所用溶液濃度與時(shí)間

1.4.6 封片 用玻璃棒蘸取適量中性樹(shù)膠于載玻片上，蓋上蓋玻片待凝固后觀察結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用CaseViewer軟件測(cè)量每個(gè)卵泡面積、數(shù)量、直徑、含膜面積（三級(jí)至成熟卵泡）、膜厚（三級(jí)至成熟卵泡），及黃體面積、數(shù)量和直徑。SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。GraphPad Prism 8作圖。每組5個(gè)個(gè)體，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”方式表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠卵巢的組織結(jié)構(gòu)觀察

在生物顯微鏡可以觀察到細(xì)胞核為藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)、透明帶、卵泡液、基膜、膠原纖維等被伊紅染成不同程度的紅色，卵巢的原始、初級(jí)、次級(jí)、三級(jí)、成熟等各期卵泡結(jié)構(gòu)能清楚地觀察到。

如圖1A所示，原始卵泡排列在卵巢皮質(zhì)外周，呈卵圓形，由中央的卵母細(xì)胞和外周呈扁平狀的卵泡細(xì)胞構(gòu)成；卵母細(xì)胞呈卵圓形，HE染色胞質(zhì)呈紅色，胞核呈藍(lán)色，胞核大而圓位于卵母細(xì)胞中央。

如圖1B所示，初級(jí)卵泡排列在卵巢皮質(zhì)外周，體積略大于原始卵泡，外周卵泡細(xì)胞由扁平狀發(fā)育為單層立方狀細(xì)胞，此時(shí)卵泡膜尚未形成，同時(shí)也無(wú)卵泡腔。

隨著卵泡的發(fā)育，初級(jí)卵泡移向卵巢皮質(zhì)中央，形成次級(jí)卵泡（圖1C）。單層立方狀卵泡細(xì)胞增殖形成多層柱狀細(xì)胞，此時(shí)的卵泡細(xì)胞稱之為顆粒細(xì)胞；當(dāng)卵母細(xì)胞被2～3層顆粒細(xì)胞包圍時(shí)，于卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞之間出現(xiàn)透明帶，HE染色呈淡紅色。

隨著卵泡的進(jìn)一步發(fā)育，顆粒細(xì)胞層數(shù)進(jìn)一步增加，層數(shù)達(dá)到4～5層時(shí)，形成完整的透明帶，HE染色呈紅色；同時(shí)顆粒細(xì)胞層出現(xiàn)分離而形成不規(guī)則的腔隙，其間充滿著由顆粒細(xì)胞分泌的卵泡液，各小腔隙進(jìn)一步合并形成月牙形的卵泡腔，此時(shí)的卵泡稱為三級(jí)卵泡（圖1D）。此時(shí)卵泡直徑增加明顯，卵母細(xì)胞移位于卵泡的一側(cè)，與周圍的顆粒細(xì)胞共同形成卵丘，靠近透明帶的顆粒細(xì)胞形成放射冠，卵泡膜分化為內(nèi)外兩層。隨著三級(jí)卵泡的繼續(xù)生長(zhǎng)，卵泡腔增大，卵泡液增多，卵泡擴(kuò)展到整個(gè)卵巢皮質(zhì)部而突出于卵巢的表面，形成成熟卵泡。

圖1E為黃體。卵泡排卵后，卵泡內(nèi)膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞先形成紅體，之后二者逐步黃體化形成顆粒黃體細(xì)胞和膜黃體細(xì)胞，隨著黃體的進(jìn)一步發(fā)育，顆粒黃體細(xì)胞體積增大呈橢圓形HE染色胞質(zhì)呈紅色，胞核呈淺藍(lán)色；膜黃體細(xì)胞主要分布黃體的外周部。

圖1F為閉鎖卵泡。哺乳動(dòng)物出生后，99%原始卵泡在發(fā)育過(guò)程中自發(fā)性退化，稱為卵泡閉鎖。

圖1 各級(jí)卵泡形態(tài)

表3 各組小鼠卵巢中卵泡及黃體數(shù)量比較

2.2 幼鼠與成鼠卵泡與黃體數(shù)量、直徑和面積比較

如表3所示，成鼠黃體數(shù)量極顯著高于幼鼠，這是因?yàn)橛资筮€沒(méi)有進(jìn)入發(fā)情周期，沒(méi)有黃體存在。有腔卵泡數(shù)，成鼠與幼鼠差異不顯著。無(wú)腔卵泡數(shù)，成鼠極顯著高于幼鼠組。

3 討論

幼鼠與成鼠卵巢切片比較，結(jié)果顯示幼鼠卵巢中沒(méi)有黃體，但存在處于生長(zhǎng)發(fā)育階段的各級(jí)卵泡。成年卵巢中各級(jí)卵泡、黃體均存在，且無(wú)腔卵泡數(shù)量顯著高于幼鼠。表明動(dòng)物達(dá)到成年后，在完善的發(fā)情周期調(diào)控下，卵巢中的各級(jí)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育較幼鼠快，數(shù)量多，并且有正常排卵現(xiàn)象。切片中觀察到，成年卵巢和幼年卵巢中成熟卵泡較少，表明所有小鼠沒(méi)有處于將要排卵的階段。另外，因成熟卵泡與三級(jí)卵泡沒(méi)有明顯的界線，因此在文章中沒(méi)有分開(kāi)做統(tǒng)計(jì)，綜合統(tǒng)計(jì)為有腔卵泡的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)成鼠組和幼鼠組有腔卵泡數(shù)差異不顯著，這可能與實(shí)驗(yàn)樣本量較少有關(guān)。今后的實(shí)驗(yàn)中有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

哺乳動(dòng)物出生后，99%原始卵泡在發(fā)育過(guò)程中自發(fā)性退化稱為卵泡閉鎖[6],卵泡閉鎖是毛細(xì)血管、上皮細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞以及卵泡液中激素等組分系列變化的結(jié)果[7]。生長(zhǎng)卵泡的閉鎖存在兩種不同形態(tài)，分別是實(shí)心卵泡和囊狀卵泡，實(shí)心卵泡的顆粒層和卵泡膜都向內(nèi)增生而占據(jù)整個(gè)卵泡腔；囊狀卵泡的顆粒層和卵泡膜會(huì)萎縮，而卵泡腔內(nèi)不發(fā)生變化。與健康卵泡相比，閉鎖卵泡孕酮（P4）濃度較高而雌二醇（E2）濃度較低[8]；卵泡閉鎖時(shí)，近腔顆粒細(xì)胞凋亡急劇增多并落入卵泡腔內(nèi)，甚至卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體也逐漸脫落［6,9］。卵泡閉鎖影響哺乳動(dòng)物的繁殖性能，近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者從分子遺傳學(xué)角度來(lái)研究卵泡閉鎖的原因。

4 結(jié)論

本研究初步對(duì)卵巢進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析，區(qū)分了不同發(fā)育階段的卵泡和黃體，并明確了各自特征。比較發(fā)現(xiàn)幼鼠卵巢中沒(méi)有黃體存在，成熟無(wú)腔卵泡數(shù)量顯著高于幼鼠，有腔卵泡數(shù)量差異不明顯。下一步將從各級(jí)卵泡面積、占卵巢總面積之比及各級(jí)卵泡超微結(jié)構(gòu)入手深入挖掘幼齡和成年小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)差異，為今后家畜繁殖性能的提高提供理論參考。