蔣貝格 周偉平

肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)致死率最高的惡性腫瘤之一，目前尚無(wú)針對(duì)發(fā)病機(jī)制為基礎(chǔ)的有效治療[1]。HCC對(duì)化療不敏感，且手術(shù)切除、局部射頻消融等治療效果有限[1]。雖然，目前已有不少治療肝癌的靶向藥物出現(xiàn)，譬如索拉非尼(Sorafenib)、侖伐替尼(lenvatinib)，但治療效果非常有限，也僅延長(zhǎng)了患者幾個(gè)月的生存期[2,3]。因此，隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICIs)在晚期黑色素瘤或肺癌上取得不錯(cuò)效果后，ICIs在未進(jìn)行臨床前試驗(yàn)的情況下，隨即進(jìn)入臨床試驗(yàn)治療晚期肝細(xì)胞癌。結(jié)果顯示，藥物的毒性和安全性可控，但治療效果相對(duì)有限，治療反應(yīng)率不高。因此，一個(gè)亟待解決的問(wèn)題出現(xiàn)了，那就是如何把肝臟腫瘤從“冷”向“熱”，或者說(shuō)有不錯(cuò)反應(yīng)率的腫瘤轉(zhuǎn)變，這需要深度的動(dòng)物模型機(jī)制研究和大樣本的人體試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

近年來(lái)，隨著免疫抑制共受體在T淋巴細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，通過(guò)增強(qiáng)免疫抑制腫瘤才取得真正的突破。比如，在預(yù)先皮下注射了結(jié)腸腫瘤51BLim10細(xì)胞或Sa1N纖維肉瘤細(xì)胞的小鼠腹腔內(nèi)注射抗CTLA-4抗體，而非抗CD28抗體，抑制了小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)[4]。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4 (CTLA-4)，又稱為CD152，通過(guò)與CD28的配體CD80(B7-1)和CD86(B7-2)結(jié)合，負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性[4]。程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(PD-1)通過(guò)與其特異性配體PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)相互作用，抑制T細(xì)胞的活性和增殖[5]。Honjo等在小鼠體內(nèi)證實(shí)，P815肥大細(xì)胞瘤表達(dá)程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(PD-1)后能顯著增強(qiáng)細(xì)胞的成瘤性和侵襲性[5]。這些開(kāi)創(chuàng)性的研究表明，通過(guò)阻斷免疫抑制信號(hào)可以抑制腫瘤。很快腫瘤免疫療法進(jìn)入臨床試驗(yàn)。一家創(chuàng)新型小公司Medarex研制了人源化的抗PD-1抗體(nivolumab)。2006年，被美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，2008年日本也開(kāi)展相關(guān)臨床試驗(yàn)。到2012年，人源化的抗PD-1抗體治療非小細(xì)胞型肺癌、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌的I期臨床試驗(yàn)結(jié)果被相繼報(bào)道[6]。當(dāng)這種腫瘤免疫療法成功地挽救了一些晚期轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和腎癌的患者時(shí)，全世界都為之興奮。2013年Science雜志將腫瘤免疫治療評(píng)選為當(dāng)年的十大科學(xué)突破。本文將重點(diǎn)回顧闡述動(dòng)物模型結(jié)合臨床前研究以及臨床試驗(yàn)研究在促進(jìn)HCC免疫治療中的價(jià)值。

一、ICIs在肝癌患者中的臨床試驗(yàn)

2013年，Sangro等報(bào)道了CTLA-4抗體(tremelimumab)治療HCC的無(wú)對(duì)照、開(kāi)放標(biāo)簽、多中心的II期臨床試驗(yàn)[7]。該臨床試驗(yàn)在20例由丙型肝炎引起肝硬化最終發(fā)展成為HCC患者身上進(jìn)行，結(jié)果顯示CTLA-4抗體有抗腫瘤和抗病毒效應(yīng)，且藥物的不良反應(yīng)可控。2017年，El-Khoveiry[8]報(bào)道了其與多名全球合作者共同開(kāi)展了一項(xiàng)抗PD-1抗體(nivolumab)治療晚期HCC(CheckMate040)的開(kāi)放標(biāo)簽，非比較性的I/II期臨床試驗(yàn)(NCT01658878)。該臨床研究共招募262例多病因?qū)е碌耐砥贖CC患者。結(jié)果表明，無(wú)論是否接受過(guò)索拉非尼治療，nivolumab都有不錯(cuò)反應(yīng)率和總體生存時(shí)間，且藥物安全可控。

一項(xiàng)非隨機(jī)，開(kāi)放標(biāo)簽的II期臨床試驗(yàn)(Keynote-224)評(píng)估了抗PD-1藥物pembrolizumab治療104例接受過(guò)索拉非尼治療的晚期HCC患者的安全性和有效性，結(jié)果表明，Pembrolizumab也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的安全性和毒性的事件[9]。對(duì)這些HBV或HCV感染史且索拉非尼治療后發(fā)生病情進(jìn)展的HCC患者的客觀反應(yīng)率為17%。最常見(jiàn)的免疫相關(guān)不良反應(yīng)有甲狀腺功能減退，腎上腺功能不足，以及甲狀腺炎，這些不良反應(yīng)與Pembrolizumab治療其他腫瘤出現(xiàn)的一樣。PD-L1在腫瘤和免疫細(xì)胞中的聯(lián)合表達(dá)可預(yù)測(cè)pembrolizumab的反應(yīng)性。20%(6/30)低表達(dá)的PD-L1的患者，也對(duì)抗PD-1治療有效。全球，仍有很多ICIs治療HCC的臨床試驗(yàn)正在開(kāi)展中，每年都有新的臨床試驗(yàn)結(jié)果出來(lái)。其中包括兩個(gè)二線治療晚期肝癌的III期臨床試驗(yàn)(KEYNOTE-240和KEYNOTE-394)。不少臨床試驗(yàn)旨在評(píng)估抗CTLA-4和PD-1或PD-L1聯(lián)合其他藥物或者物理治療的聯(lián)合治療策略[10]。

二、肝臟中的特殊免疫微環(huán)境

最初的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫治療在HCC中展現(xiàn)出較低的反應(yīng)率和有限的治療益處[8, 9]。因此，在探討可能影響臨床結(jié)果的分子、細(xì)胞因素時(shí)，不能忽視肝臟免疫耐受。肝臟在免疫調(diào)節(jié)中起著重要的作用。從腸道，除了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，肝臟還獲得能被肝臟獨(dú)特的“肝竇”結(jié)構(gòu)有效識(shí)別、加工或清除的物質(zhì)，包括微生物、微生物相關(guān)分子模式(MAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)。相應(yīng)地，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)表達(dá)一系列模式識(shí)別受體(PRRs)，負(fù)責(zé)清除血液中的可溶性大分子和膠狀廢物[11]。另外，肝臟里常駐著數(shù)量最多的庫(kù)普弗細(xì)胞，它們也表達(dá)多種類型的PRRs，通過(guò)吞噬作用識(shí)別和清除不溶性的廢物。肝臟的另外一個(gè)顯著特征是富含NK，NKT和TCRγδT細(xì)胞，以及相對(duì)外周血CD8+/CD4+T細(xì)胞比例更高。

肝臟最重要的免疫特性之一是誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受導(dǎo)致肝臟免疫耐受，從而防止對(duì)從腸子吸收的抗原的過(guò)激免疫反應(yīng)。雖然，潛在的機(jī)制仍有待闡明。肝臟的免疫抑制環(huán)境顯然是由原始T細(xì)胞、LESCs、樹(shù)突狀細(xì)胞，枯否氏細(xì)胞和肝細(xì)胞通過(guò)促炎和抑炎細(xì)胞因子的相互協(xié)調(diào)維持的[12]。肝臟T細(xì)胞的耐受是在缺少共刺激因子和CD4+細(xì)胞數(shù)量少，或由枯否氏細(xì)胞分泌的IL-10刺激導(dǎo)致的Treg細(xì)胞擴(kuò)增的環(huán)境下被持續(xù)的抗原遞呈而誘導(dǎo)產(chǎn)生[12]。盡管這些免疫抑制對(duì)維持肝臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，但這也可能造成HCC的免疫逃逸。

三、原發(fā)性肝癌的免疫概況

肝臟惡性腫瘤通常在慢性壞死性炎癥的情況下發(fā)生，其特征是細(xì)胞死亡，代償性再生，肝星狀細(xì)胞(HSCs)過(guò)度活化和纖維化，以及侵潤(rùn)的炎癥細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能改變。在HCC患者中檢測(cè)到與全身炎癥反應(yīng)相關(guān)的自發(fā)性腫瘤消退，表明肝癌至少有一些基礎(chǔ)免疫原性[13]。另外，據(jù)估計(jì)，超過(guò)一半的HCC患者對(duì)腫瘤相關(guān)抗原NY-ESO-1自發(fā)地產(chǎn)生免疫反應(yīng)。經(jīng)皮酒精注射療法針和射頻消融(radiofrequency ablation ，RFA)能誘發(fā)T細(xì)胞對(duì)腫瘤組織的侵潤(rùn)[14]。

在人的肝癌樣本中，耗竭性CD8+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞增多，且存在克隆擴(kuò)增[15]。還檢測(cè)到了一系列已知的和特征不明顯的耗竭相關(guān)基因。膜蛋白Layilin在活化的CD8+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞中上調(diào)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可以抑制原始CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ，該現(xiàn)象與不良預(yù)后相關(guān)。對(duì)泰國(guó)的HCC/ICC患者進(jìn)行大范圍基因表達(dá)譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在癌和癌旁組織之間發(fā)現(xiàn)免疫抑制基因，包括PD-L1、PD-1、CTLA-4、TIM3、B7H3和LAG3[16]。

在小鼠模型中，由β-連環(huán)蛋白CTNNB1突變導(dǎo)致的肝臟腫瘤對(duì)抗PD-1治療反應(yīng)率低[17]?？赡艿臋C(jī)制是，Wnt/β-catenin通路的異常激活導(dǎo)致趨化因子，特別是CCF5的表達(dá)受損，引起募集樹(shù)突狀細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞進(jìn)入肝臟受損。這些受損/缺陷引發(fā)HCC的免疫逃逸及對(duì)PD-1抗體的反應(yīng)應(yīng)答低下，這與在人類HCC中觀察到β-連環(huán)蛋白活化和抗PD-1治療抵抗的現(xiàn)象相一致。

四、肝臟腫瘤由“冷”變“熱”

盡管ICIs在許多癌癥中取得了顯著的效果，但發(fā)現(xiàn)在相當(dāng)一部分癌癥患者中ICIs治療是沒(méi)有效果或僅部分有效，而且出現(xiàn)新的問(wèn)題，即部分患者對(duì)藥物產(chǎn)生耐受-最初有效果的患者出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)。因此，如何提高免疫治療的有效性，即把“冷”腫瘤變?yōu)椤盁帷蹦[瘤使之對(duì)藥物有反應(yīng)，成為一個(gè)急迫的問(wèn)題。(注：根據(jù)腫瘤細(xì)胞周圍的免疫細(xì)胞的多少，將腫瘤分為熱腫瘤和冷腫瘤。)

一般情況下，HCC對(duì)ICIs反應(yīng)弱。在HCC小鼠模型中，單獨(dú)注射抗PD-L1抗體，沒(méi)有顯示出任何顯著的腫瘤抑制作用[18]。另一項(xiàng)在轉(zhuǎn)基因小鼠系的研究中也獲得了類似的結(jié)果[17]。因此，如何將冷肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)變成熱肝細(xì)胞癌是非常必要。Lee[19]意外地在小鼠中發(fā)現(xiàn)了聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyIC)能夠有效地抑制腫瘤。polyIC是一種合成的雙鏈RNA，能有效地激活模式識(shí)別受體TLR3、RIG-I/MDA5和蛋白激酶PKR。通過(guò)刺激多種天然免疫細(xì)胞群，包括肝臟中的NK細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，協(xié)同激活這些天然抗腫瘤功能導(dǎo)致在癌前階段清除“高?！鞭D(zhuǎn)化細(xì)胞，從而防止肝癌的發(fā)生[19]。

與polyIC或PD-l1ab單獨(dú)使用相比，聯(lián)合使用polyIC和PD-l1ab對(duì)肝癌具有明顯的抑制作用，甚至對(duì)小鼠的晚期腫瘤也有顯著的抑制作用[18]。聯(lián)合治療后，發(fā)現(xiàn)大量的CD8+T細(xì)胞被募集并浸潤(rùn)到肝臟腫瘤。值得一提的是，polyIC誘導(dǎo)PD-L1在LSECs中表達(dá)與與腫瘤發(fā)生無(wú)關(guān)，因?yàn)椴徽撛诮】蹈闻K還是荷瘤的肝臟中都能檢測(cè)上述現(xiàn)象。因此，這種方法與肝癌腫瘤導(dǎo)致的各種腫瘤免疫逃逸機(jī)制無(wú)關(guān)?？傊?，這些小鼠的臨床前數(shù)據(jù)證明了用ICIs治療肝臟腫瘤是一種可行策略。

四、展望

毫無(wú)疑問(wèn)，靶向ICIs的免疫治療已經(jīng)改變了腫瘤治療策略。在治療不可切除的HCC(IMbrave 150)時(shí)，atezolizumab單抗(抗PD-L1)和bevacizumab單抗(抗VEGF)的聯(lián)合治療比sorafenib索拉非尼有更好的總生存率和無(wú)進(jìn)展生存率[20]。作為第一個(gè)在提高生存率上超過(guò)索拉非尼的肝癌治療策略，這項(xiàng)研究為聯(lián)合免疫治療提供了巨大的希望。

對(duì)HCC免疫治療進(jìn)行有效設(shè)計(jì)時(shí)，必須解決兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：肝臟腫瘤細(xì)胞免疫原性的強(qiáng)度和促進(jìn)肝癌進(jìn)展的免疫逃避的具體機(jī)制。還有兩個(gè)問(wèn)題值得關(guān)注，根據(jù)可靠的生物標(biāo)志物篩選出患者可以提高治療的應(yīng)答率，另一個(gè)更有意思的問(wèn)題是使用額外的藥物將低應(yīng)答或無(wú)應(yīng)答的患者轉(zhuǎn)化為ICI應(yīng)答者?？傊?，通過(guò)將臨床前研究與臨床研究相結(jié)合，將有助于發(fā)現(xiàn)新的免疫抑制分子和信號(hào)通路，為肝癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。