余 超，李秋玉，邵 毅

0引言

光感受器丟失是視網(wǎng)膜變性疾病的主要原因之一，由于哺乳動物的視網(wǎng)膜沒有再生能力，因此視網(wǎng)膜變性疾病將導(dǎo)致視桿和視錐細(xì)胞光感受器的永久性丟失，而完全失明。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全世界視網(wǎng)膜變性疾病的人數(shù)約為2.85億[1]；而據(jù)估計(jì)在歐盟范圍內(nèi)，年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)或遺傳性視網(wǎng)膜變性(inherited retinal degeneration, IRD)等疾病中有3 400萬人的視網(wǎng)膜變性與光感受器丟失相關(guān)[2]。龐大的患者數(shù)目給世界經(jīng)濟(jì)帶來巨大負(fù)擔(dān)。目前通過光感受器移植進(jìn)行治療，而光感受器的獲取和植入后的免疫排斥影響是影響其療效重要因素。

1光感受器的解剖與功能

感光細(xì)胞是視網(wǎng)膜光敏細(xì)胞，為大腦提供視覺輸入。感光細(xì)胞是眼中最大的神經(jīng)元細(xì)胞群，約占視網(wǎng)膜的80%。感光細(xì)胞位于神經(jīng)視網(wǎng)膜的最外層，其細(xì)胞體形成所謂的外核層(outer nuclear layer, ONL)。人體視網(wǎng)膜包含一種類型的視桿(低強(qiáng)度光照條件下提供視覺)，三種類型的視錐，可以實(shí)現(xiàn)三色日光和高敏銳度的感知。光感受器外節(jié)以膜片(桿狀)或褶皺(圓錐形)的形式包含大量的細(xì)胞膜伸展，可容納大量跨膜的光色素。色素由蛋白質(zhì)(視蛋白)和發(fā)色團(tuán)(視網(wǎng)膜)組成。接受光信號之后膜盤內(nèi)的11-順式視黃醛異構(gòu)化為全反式視黃醛。隨后，觸發(fā)次級信使級聯(lián)反應(yīng)，使環(huán)狀核苷酸門控離子通道關(guān)閉，并最終使感光體超極化。然后，超極化信號通過連接的纖毛被動傳輸?shù)絻?nèi)部部分，隨后到含核的細(xì)胞體，最后是軸突末端。軸突末端含有一個(gè)專門的帶狀突觸，可調(diào)節(jié)突觸的釋放。超極化信號降低了Ca2 +水平，使神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸，以進(jìn)補(bǔ)、分級的方式突觸間隙的釋放減少。帶狀突觸與水平和雙極細(xì)胞的突觸后末端一起形成獨(dú)特的突觸三聯(lián)體。當(dāng)棒僅與ON雙極接觸時(shí)，圓錐形感光體與ON或OFF雙極突觸，其特征分別是抑制性谷氨酸受體和興奮性谷氨酸受體的分布不同。在信號以各種并行處理通道的形式通過視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGC)傳輸?shù)酱竽X之前，視覺信號處理的第一級是在內(nèi)部核層(inner nuclear layer, INL)進(jìn)行的(除Müller膠質(zhì)細(xì)胞外)，還包含雙極，水平和無長突細(xì)胞[3]。

其他兩種細(xì)胞類型對于正常的感光器功能至關(guān)重要，它們不通過神經(jīng)元信號傳遞，而是通過視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)和Müller膠質(zhì)細(xì)胞的維持和支持功能。感光體OS與底層RPE形成密切聯(lián)系。RPE除了在視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間形成邊界[因此是血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)的一部分]外，在光吸收、離子、流體和代謝物的上皮運(yùn)輸以及生長因子分泌上有重要功能[4]。重要的是RPE每天吞噬大約外段長度的1/10，從而使全反式類維生素A循環(huán)成11-順式形式。因此，RPE作為視覺周期的一部分，為感光器的維護(hù)和功能提供了必要的支持。除了它們在基底和根尖與繼發(fā)神經(jīng)元和RPE細(xì)胞的連接外，感光器還被Müller膠質(zhì)細(xì)胞突包裹。 Müller膠質(zhì)細(xì)胞形成內(nèi)部和外部限制膜，覆蓋神經(jīng)核的大部分層和叢狀層，密封大部分神經(jīng)視網(wǎng)膜[除了OS和IS(inner segment)的一部分]。 此外它還具有適當(dāng)?shù)母泄馄鞴δ埽ńY(jié)構(gòu)穩(wěn)定，谷氨酸和發(fā)色團(tuán)的吸收和再循環(huán)以及離子和水的動態(tài)平衡感知[5]。光感受器代表了視覺感知的中心單元，將光轉(zhuǎn)換為生物信號以通過化學(xué)突觸傳遞，并依賴于與RPE和Müller膠質(zhì)細(xì)胞的緊密接觸。

2視網(wǎng)膜退行性疾病治療現(xiàn)狀

鑒于全球視力障礙和失明的形勢嚴(yán)峻，新型治療策略的研究活動激增，但對于大多數(shù)致盲疾病，并沒有真正的治愈方法[6]。

引入抗體阻斷血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，可以大大減少濕性ARMD患者的新生血管形成，延遲光受體破壞速度，改善和保持視覺功能。但長期研究SEVEN-UP的結(jié)果顯示，開始治療后7～8a，有一半以上的患者視力下降，視力下降程度取決于疾病最初幾年VEGP抑制劑的注射規(guī)律[7]。另外，這種策略對高達(dá)25%的患者無效。

FDA于2017-12批準(zhǔn)LCA基因補(bǔ)充方法后第一種眼基因療法進(jìn)入市場。這種方法通過使用AAV載體，將催化全反式向11- 順式視網(wǎng)膜的異構(gòu)化的正常RPE65基因?qū)牖颊逺PE細(xì)胞，注射到視網(wǎng)膜下間隙，使視覺功能得到改善(在兒童中效果最好)[8]。盡管尚存在許多缺陷，RPE65基因補(bǔ)充的成功激勵了研究者對影響RPE，視桿或視錐光感受器的一系列其他視網(wǎng)膜疾病開發(fā)基因療法。通過這種基因療法優(yōu)化修復(fù)RPE和光感受器，恢復(fù)視力，為視網(wǎng)膜疾病的治療帶來希望。

3光感受器獲取與移植

3.1概述根據(jù)目前多項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果，通過多能干細(xì)胞衍生的RPE細(xì)胞治療ARMD和Stargardt疾病安全而且穩(wěn)定[9],為光感受器的移植安全提供了事實(shí)依據(jù)。在大多數(shù)移植研究中，供體細(xì)胞是年輕的后光受體或視網(wǎng)膜片，從小鼠/人類視網(wǎng)膜(原發(fā)細(xì)胞)獲得或從小鼠/人類PSC中提取。視網(wǎng)膜片可以直接移植到宿主亞視網(wǎng)膜空間，如若是細(xì)胞懸浮液，需要進(jìn)行光受體濃縮[通過 FACS(fluorescence activated cell sorting) 或基于 MACS(magnetic-activated cell sorting) 的排序來實(shí)現(xiàn)]。移植后，應(yīng)用組織學(xué)技術(shù)(光學(xué)相干斷層掃描、免疫組織化學(xué)、電子顯微鏡)分析宿主細(xì)胞的定位和宿主視網(wǎng)膜內(nèi)的相互作用。供體細(xì)胞的功能和突觸連接可以使用相應(yīng)技術(shù)在不同級別進(jìn)行測試，從單細(xì)胞記錄、微電極陣列(評估視網(wǎng)膜內(nèi)視網(wǎng)膜細(xì)胞水平的功能)到通過行為測試(如水迷宮或淺暗盒)向更高的視覺中心發(fā)出信號[10]。

3.2獲取與任何細(xì)胞治療方法一樣，識別合適的細(xì)胞類型和來源對光感受器移植的成功極為重要。臨床前實(shí)驗(yàn)大多使用原代細(xì)胞或組織進(jìn)行移植，然而與使用有絲分裂后感光器相比，這種策略并不是很成功。

2006年開始，在視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞治療方法中，首選的且最常用的原代細(xì)胞類型是年輕的，解離的有絲分裂后光感受器的豐富群體，也稱為光感受器前體。胚胎階段11.5d到成年的視網(wǎng)膜發(fā)育階段獲得移植細(xì)胞懸液之后，出生的第4～7d是桿狀感光受體前體分離和移植的最佳階段[11]。關(guān)于視錐細(xì)胞感光細(xì)胞，相應(yīng)的發(fā)育階段大約在E15.5左右，初步研究表明，有絲分裂后的幼小視錐細(xì)胞適合用于移植，因?yàn)檫@些細(xì)胞的存活率比成年感光細(xì)胞高[12]，并能在視網(wǎng)膜下間隙有效成熟[13]。

然而將幼小的供體感光細(xì)胞在人體中培養(yǎng)到適宜階段會帶來一系列倫理法律等問題，為此近年來通過胚胎多能干細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(embryonic stem cell/induced pluripotent stem cells, ESC / iPSC)獲得可移植感光體，并結(jié)合胚狀體(EB)形成和2D培養(yǎng)系統(tǒng)。但最初只能成功地獲得培養(yǎng)物中ESC衍生的神經(jīng)祖細(xì)胞。為了進(jìn)一步分化為感光細(xì)胞，這些神經(jīng)祖細(xì)胞必須移植到成年大鼠的視網(wǎng)膜下間隙中[14]或?qū)⑵渑c胚胎產(chǎn)后第1d或成年胚胎共培養(yǎng)[15]。隨后誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)被證明也具有向感光細(xì)胞分化的能力。以上培養(yǎng)基本通過使用細(xì)胞外基質(zhì)來操縱發(fā)育信號通路的方法產(chǎn)生光感受器，但是整體效率非常低，只有不到20%的細(xì)胞表達(dá)出光感受器特異性標(biāo)記。

mESC衍生的視網(wǎng)膜類器官含有桿狀光感受器，可以對其進(jìn)行MACS富集，并移植到野生型和晚期視網(wǎng)膜變性小鼠受體中存活并表達(dá)成熟的光感受細(xì)胞。作為一種新興技術(shù)，類器官領(lǐng)域仍然有大量工作需要完成，如標(biāo)準(zhǔn)化和有效協(xié)議的進(jìn)一步完善，這有助于生產(chǎn)符合GMP條件的用于臨床的光感受器移植物。另外，針對相關(guān)的培養(yǎng)時(shí)間長問題，可以采用培養(yǎng)機(jī)器人和生物反應(yīng)器標(biāo)準(zhǔn)化工作步驟擴(kuò)大移植生產(chǎn)規(guī)模來解決(已在腦類器官的產(chǎn)生和視網(wǎng)膜組織體的制備中應(yīng)用)。盡管初始步驟尚未實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化或自動化，仍然需要具有專業(yè)技術(shù)技能的專家研究人員，但這無疑是減少因時(shí)間帶來的成本的解決方法之一。

3.3純化分離感光體的最初策略包括成年視網(wǎng)膜的連續(xù)酶解、機(jī)械解離，以及通過顯微鏡評估確定獲得相對純凈感光體種群的最佳解離時(shí)間?，F(xiàn)階段利用GFP的熒光報(bào)告蛋白標(biāo)記和分離可移植細(xì)胞。在感光器領(lǐng)域，進(jìn)一步的研究利用不同小鼠模型特定的視網(wǎng)膜細(xì)胞表達(dá)GFP報(bào)告蛋白，作為在宿主視網(wǎng)膜內(nèi)的鑒定工具，并在移植前對其進(jìn)行分離和富集[16]，具體可以利用FACS進(jìn)行。

但由于高壓和剪切力，F(xiàn)ACS對細(xì)胞產(chǎn)生相當(dāng)大的壓力。另外有研究表明，感光細(xì)胞的存活力隨分離時(shí)間的增加而降低，而FACS是一個(gè)相對較慢的過程(每個(gè)細(xì)胞都被單獨(dú)詢問和分類)，增加細(xì)胞的死亡率，并不適合用于臨床應(yīng)用。而利用磁激活細(xì)胞分選(MACS)作為替代，通過MACS，基于磁性可以同時(shí)分類數(shù)百萬甚至數(shù)十億個(gè)磁性標(biāo)記的細(xì)胞，且相對溫和，幾乎沒有負(fù)面影響。在使用CD73作為細(xì)胞表面標(biāo)志物的情況下，證明基于MACS的分選產(chǎn)生了高度富集的桿狀光感受器群體并具有來自原代小鼠視網(wǎng)膜的高細(xì)胞活力[17]以及mESC衍生的視網(wǎng)膜類器官。MACS技術(shù)具有巨大的可擴(kuò)展性潛力，很容易適應(yīng)GMP條件和自動化處理，是一種運(yùn)用于臨床應(yīng)用的細(xì)胞分選系統(tǒng)。

3.4移植較其他器官的移植，光感受器移植到視網(wǎng)膜具有以下優(yōu)勢：(1)親和性更好，不需要高侵入性手術(shù)方法；(2)眼睛是免疫特權(quán)器官，免疫排斥較其他器官弱。光感受器移植的目標(biāo)位置是所謂的視網(wǎng)膜下空間，即退化的視網(wǎng)膜和RPE的剩余光感受器(如果有的話)之間的空間。正常情況下，感光器外部片段與RPE細(xì)胞緊密接觸，這是類維生素A視覺周期和感光器外部片段尖端的每日吞噬作用所必需的。在移植過程中，使感光器外部與RPE之間視網(wǎng)膜脫離產(chǎn)生空間進(jìn)行移植。視網(wǎng)膜與RPE的重新附著通常在幾天之內(nèi)發(fā)生。移植方法包括單細(xì)胞移植、視網(wǎng)膜片移植以及生物材料支持移植。

單細(xì)胞移植優(yōu)勢在于:(1)能移植準(zhǔn)確數(shù)量的細(xì)胞； (2)供體和宿主視網(wǎng)膜細(xì)胞之間有更好地接觸；(3)外科手術(shù)對眼的侵害最少；(4)供體細(xì)胞容易標(biāo)記。獲得的供體光感受器細(xì)胞懸液可以經(jīng)角膜注射,也經(jīng)玻璃體或鞏膜注射來移植。通過角膜的注射方法中，注射針通過角膜上/下側(cè)的移植部位沿對角線進(jìn)入眼球，而同樣的方法應(yīng)用于通過玻璃體注射。這種注射方法能夠準(zhǔn)確確定注射部位并規(guī)避血管損傷。但客觀上視網(wǎng)膜的穿刺仍會導(dǎo)致宿主內(nèi)發(fā)生反應(yīng)性膠質(zhì)增生[18]。而盡管經(jīng)鞏膜注射可避免損壞視網(wǎng)膜本身，但脈絡(luò)膜會被擠壓，更容易導(dǎo)致血管損傷，使免疫細(xì)胞滲入視網(wǎng)膜并可能形成出血。以上后兩種方法都有細(xì)胞逆流的風(fēng)險(xiǎn)，但經(jīng)玻璃體注射法的優(yōu)點(diǎn)在于手術(shù)過程中可以目視監(jiān)測注射部位，更易于評估注射過程中的細(xì)胞逆流，作出及時(shí)的應(yīng)對。使用單細(xì)胞懸浮法，在野生型和晚期視網(wǎng)膜變性的小鼠模型中觀察到適宜的外部節(jié)段形成，這表明了移植物在視網(wǎng)膜下空間的成熟受環(huán)境因素影響[19]。單細(xì)胞懸液移植的缺點(diǎn)包括在推注期間潛在的高細(xì)胞死亡率和移植細(xì)胞外排，供體細(xì)胞移離移植部位錯(cuò)位，長期細(xì)胞存活和整合率低，存在抑制性細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)蛋白(例如CD44或神經(jīng)聚糖)等[20]。

視網(wǎng)膜片移植是單細(xì)胞懸液的替代方法。該方法是在健康的視網(wǎng)膜內(nèi)遞送供體感光細(xì)胞，并保持其特征性分層組織。在大鼠模型中，視網(wǎng)膜片(視網(wǎng)膜上，視網(wǎng)膜下或脈絡(luò)膜)的存活，組織和成熟度與移植物的位置有關(guān)[21]。正確放置在SRS(sub-retinal space)中的視網(wǎng)膜片移植物有助于保留視網(wǎng)膜的分層結(jié)構(gòu)，并形成與宿主RPE接觸的外部和內(nèi)部部分[22]。在臨床模型中，針對晚期色素性視網(wǎng)膜炎患者目前進(jìn)行的是對移植物存活和視覺恢復(fù)的評估。在這種同種異體移植條件且不使用免疫抑制時(shí)，視網(wǎng)膜片移植1a內(nèi)沒有排斥反應(yīng)。另外在針對10例患有各種視網(wǎng)膜疾病的患者研究中[包括視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)和ARMD]，其中7例患者提供了切實(shí)的視力改善的臨床證據(jù)[23]。Seiler實(shí)驗(yàn)室的最新出版物證明在將hESC來源的視網(wǎng)膜片或胎兒視網(wǎng)膜片移植到大鼠模型后，通過光動力學(xué)測試(optokinetic testing，OKT)或上丘和視皮層的電生理記錄顯示的嚴(yán)重視網(wǎng)膜變性能恢復(fù)視覺功能[24]。視網(wǎng)膜片移植優(yōu)勢之一是移植物存活率明顯更高[25]。在某些視網(wǎng)膜變性模型中，供體細(xì)胞在異常環(huán)境中可能損害其生存和分化[26]，但在其他一些模型中，例如Prph2，即使是視網(wǎng)膜變性的后期(即9mo)移植，供體視桿感光細(xì)胞也能存活[27]。另外，有可能在視網(wǎng)膜中層壓結(jié)構(gòu)內(nèi)遞送保持頂基極極性的感光細(xì)胞。盡管這研究結(jié)果令人歡喜，但視網(wǎng)膜片移植仍然需要解決一系列問題。一個(gè)是如何解決除了感光層之外，包含外叢狀、內(nèi)核乃至內(nèi)叢狀和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，在注射后形成“雙視網(wǎng)膜”的問題。這種結(jié)構(gòu)影響與宿主二級神經(jīng)元形成正確的突觸和供體感光細(xì)胞產(chǎn)生信號的正確處理(影響程度尚不明確)。另外一個(gè)問題是手術(shù)方面的，即如何在做到正確定向移植物遞送的同時(shí)，控制侵入最小并保障患者的安全。

以上兩種方法的應(yīng)用于視網(wǎng)膜的變性的不同階段[28]。一般地，視網(wǎng)膜變性的早期階段需要單細(xì)胞懸液移植，因?yàn)楣w細(xì)胞可以支持宿主視網(wǎng)膜中剩余的感光細(xì)胞。相反，以缺乏宿主感光器為特征的視網(wǎng)膜變性晚期可能需要進(jìn)行視網(wǎng)膜片移植，盡管視網(wǎng)膜晚期的遞送最佳策略尚存在爭論。

生物材料支持移植：早期試驗(yàn)將視網(wǎng)膜嵌入明膠基質(zhì)中，并使用振動切片法將感光體分離。這使供體感光片的操作和移植時(shí)受到的損害最小化；同時(shí)明膠柔韌無毒害，能在體溫下溶解，使感光體與宿主視網(wǎng)膜融合。最近在生物支架中植入hPSC衍生的光感受器，促進(jìn)了頂端-基底方向的極化[29]。通常生物支架中具有低楊氏模量(模仿視網(wǎng)膜)的柔性聚合物是最佳的，可以調(diào)整內(nèi)部剛度以匹配其EMC的順應(yīng)性，柔性聚合物允許在注射過程中進(jìn)行操作，避免損壞周圍組織[30]。此外，支架的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也具有促進(jìn)細(xì)胞黏附(例如通過層黏連蛋白包被進(jìn)行修飾)的作用。理想情況下，生物支架具有生物相容性、可生物降解性、易于注射性?？傊?，視網(wǎng)膜細(xì)胞和生物支架結(jié)合用于供體細(xì)胞移植遞送是一種很有潛力的方法。隨著進(jìn)一步發(fā)展，生物材料支架將是一種結(jié)合單細(xì)胞移植和片狀移植優(yōu)點(diǎn)的方法。但目前仍然需要進(jìn)行多項(xiàng)研究以評估生物支架在移植后對視網(wǎng)膜的修復(fù)力等。

4光感受器移植的問題與展望

感光體移植的最終目標(biāo)是通過移植感光體使目前無法治愈的視網(wǎng)膜變性疾病恢復(fù)某些視覺功能，從而改善患者的生活。盡管有關(guān)感光體移植的大多數(shù)研究尚在臨床實(shí)驗(yàn)中，并未實(shí)際運(yùn)用，但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，感光體移植中的相應(yīng)問題諸如感光體的獲得純化等必將得到解決，感光體移植的不同策略將更好的針對不同視網(wǎng)膜疾病階段進(jìn)行高效可行的治療，比如目前首個(gè)用于治療RPE65 LCA的基因療法已被批準(zhǔn)并投放市場，并針對不同情況(包括基于視桿和視錐細(xì)胞的疾病)開展了其他幾項(xiàng)基因療法試驗(yàn)[31]，這無疑是視網(wǎng)膜疾病患者治愈的希望。