張美琦 任偉超 劉美琦 于欣欣 王思嘉 馬偉 蘇連杰

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)

黃芪，豆科(Leguminosae sp.)，黃耆屬(AstragalusLinn)，多年生草本植物[1]。黃芪是臨床常用的大宗藥材，性甘、微溫。歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)脾益氣、升陽、固表止汗等功效。黃芪中含有總多糖[2]、總皂苷[3]、總黃酮[4]三大類主要化學(xué)成分，這三大成分在臨床上的藥理作用十分豐富。在臨床用藥時(shí)，鹽處理[5]黃芪入腎經(jīng)、至下焦、補(bǔ)其虛。研究表明，鹽處理會(huì)使中藥的化學(xué)成分含量產(chǎn)生差異[6]，從而導(dǎo)致效用發(fā)生變化。因此，本研究通過炒、飯蒸兩種炮制方法對(duì)鹽浸黃芪飲片進(jìn)行處理，與生黃芪比較，分析其中三大類主要化學(xué)成分的變化情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司)、AB204-L型分析天平(深圳市深博瑞儀器儀表有限公司)、150B搖擺式500 g高速中藥粉碎機(jī)(浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)、美國(guó)奧泰ELSD6000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(杭州浣熊儀器科技有限公司)、DZTW型電子恒溫電熱套(力辰科技股份有限公司)、多功能電熱鍋(四川長(zhǎng)虹電器股份有限公司)。

1.2 試驗(yàn)材料與主要試劑

黃芪飲片來自黑龍江省，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)馬偉鑒定為蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao)的干燥根。主要試劑有D-無水葡萄糖、黃芪甲苷、蘆丁(中國(guó)食品藥品檢定研究院)、腌制鹽(山東省鹽業(yè)集團(tuán)有限公司)、大米(湯原縣瑞龍食貿(mào)有限公司)及乙醇、丁醇、硫酸、蒸餾水、苯酚、香草醛、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等。

1.3 樣品炮制方法

炒制的鹽浸黃芪：取黃芪飲片300 g，加入150 mL鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)，不斷攪拌使鹽水完全吸入黃芪飲片中，充分潤(rùn)透；把潤(rùn)透后的黃芪飲片置于鍋中炒干后(水分不超過10%)，繼續(xù)炒制10 min(黃芪藥材表面為100 ℃)，取出晾干備用。

飯蒸的鹽浸黃芪：取黃芪飲片300 g，加入150 mL鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)，不斷攪拌使鹽水完全吸入黃芪飲片中，充分潤(rùn)透，自然晾干。取400 g大米平鋪于容器中，加入800 mL水浸泡大米30 min，使米泡透，再用水浸透屜布平鋪于蒸屜中；把泡透的大米平鋪于紗布表面，呈直徑35.5 cm的圓，平均厚度8 mm，用另一塊水浸透的屜布平鋪于米上，將潤(rùn)透鹽水的黃芪片平鋪于屜布上至于鍋中。電鍋中加入2 500 mL水，加熱至圓氣時(shí)開始計(jì)時(shí)，電鍋(800 W檔位)蒸制40 min，取出晾干備用。

1.4 樣品溶液制備

總多糖成分的提取：取樣品粉末(過5號(hào)篩(篩孔內(nèi)徑(180.0±7.6)μm))2.0 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入40 mL水，密封浸泡24 h。在電熱套上加熱回流2 h，過濾，將藥渣中再次加入40 mL水，加熱回流，重復(fù)操作2次，合并提取液，濃縮；加250 mL的V(丁醇)∶V(氯仿)為1∶4的溶液充分振搖，用離心機(jī)離心15 min；將兩溶劑交界處的白色渾濁全部除去[7]，加入150 mL乙醇試劑(體積分?jǐn)?shù)為90%)后，在冰箱中5 ℃靜置16 h。過濾得到沉淀物質(zhì)用乙醇試劑(體積分?jǐn)?shù)為90%)洗滌3次[8]，取沉淀物烘干，稱定質(zhì)量，于1 000 mL容量瓶中定容，加水至刻度，即得。

總皂苷成分的提取：取樣品粉末(過5號(hào)篩)10.0 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水，密封浸泡24 h。在電熱套上加熱回流2 h，過濾，將藥渣中再次加入200 mL水，加熱回流，重復(fù)操作2次，合并提取液，濃縮，定容至100 mL容量瓶中；通過大孔吸附樹脂柱[9](大孔樹脂量，20 g裝柱方法，濕法裝柱；沖洗柱子溶劑，先采用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液，后用水沖洗至無醇味；浸泡時(shí)間24 h)，用100 mL水洗脫到無色，再用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇洗脫，收集洗脫液；在水浴鍋上蒸發(fā)至干，用無水乙醇溶解定容至200 mL，即得。

總黃酮成分的提?。喝悠贩勰?過5號(hào)篩)20.0 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水，密封浸泡24 h。在電熱套上加熱回流2 h，過濾，將藥渣中再次加入200 mL水，加熱回流，重復(fù)操作2次，合并提取液，濃縮，定容至200 mL；加到聚酰胺層析柱中[10]，放置48 h，用水洗脫柱子到無色，體積分?jǐn)?shù)為體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇洗脫，收集洗脫液體，用無水乙醇定容至2 500 mL，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

總多糖成分測(cè)定條件：硫酸-苯酚法[11]測(cè)定總多糖成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，檢測(cè)波長(zhǎng)為491 nm。吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL質(zhì)量濃度為1.0 g/L的D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加水補(bǔ)至2.0 mL，配制成D-無水葡萄糖質(zhì)量濃度為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；加入1.0 mL剛配的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.5%苯酚溶液，搖勻；迅速加入5.0 mL濃H2SO4溶液，震蕩5 min，隨后置于沸水浴中15 min；取出冷卻置室溫，定容至10 mL容量瓶中；隨行空白對(duì)照組，在491 nm波長(zhǎng)下采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值；以D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，得到D-無水葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=2.179 6ρ+0.073 4(0.10≤ρ≤0.35)，R2=0.999 4>0.9，說明線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.0 mL黃芪多糖樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進(jìn)行操作，隨行空白對(duì)照組，在491 nm波長(zhǎng)處重復(fù)以上操作6次，測(cè)定吸光度值(A)。精密度試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.13%，表明儀器可靠，精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取2.0 mL黃芪多糖樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進(jìn)行操作，隨行空白對(duì)照組，分別在491 nm波長(zhǎng)處測(cè)定供試品溶液在0、1、2、3、4、5 h的吸光度值(A)。結(jié)果表明，在5 h內(nèi)，穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.06%。在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值不超過3%時(shí)，則說明試驗(yàn)穩(wěn)定性良好。因此，供試品檢測(cè)時(shí)間2 h，在穩(wěn)定性設(shè)定時(shí)間5 h之內(nèi)，說明試驗(yàn)可靠，穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱定同一樣品藥材粉末6份，每份約2.0 g，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進(jìn)行操作，隨行空白對(duì)照組，測(cè)定吸光度值(A)，計(jì)算6份供試品的黃芪總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，黃芪總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為159.9 mg/g，重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定吸光值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.17%，說明該方法重復(fù)性較好。

加樣回收率試驗(yàn)：取9份已知黃芪總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品溶液1.0 mL，然后分別加入1.0 mL質(zhì)量濃度為0.160 0、0.319 8、0.479 8 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的顯色方法進(jìn)行顯色，隨行空白對(duì)照組，測(cè)定吸光度值(A)，計(jì)算黃芪總多糖回收率。結(jié)果表明，黃芪總多糖的平均回收率為99.48%；一般中藥材回收率要求控制在95%～100%，試驗(yàn)中平均回收率的值符合要求，說明本方法準(zhǔn)確率符合要求。

黃芪多糖樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定：將已經(jīng)制備的樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，生黃芪總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為159.8 mg/g、炒制鹽浸黃芪總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為160.6 mg/g、飯蒸鹽浸黃芪總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為158.6 mg/g。

2.2 總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

總皂苷成分測(cè)定條件：硫酸-香草醛法測(cè)定皂苷類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，檢測(cè)波長(zhǎng)為583 nm。吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL質(zhì)量濃度為1.0 g/L的黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于10 mL離心管中，分別加入無水乙醇至0.5 mL，配制黃芪甲苷質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；加入體積分?jǐn)?shù)為8%香草醛無水乙醇試劑0.5 mL，搖勻，于冰水浴中加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為72% H2SO4溶液；搖勻后，置于62 ℃水浴中20 min，加無水乙醇至10 mL，取出后立即冰浴冷卻至室溫。隨行空白對(duì)照組，在583 nm波長(zhǎng)下采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值(A)，得到黃芪甲苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=0.689ρ+0.160 6(0.2≤ρ≤1.0)，R2=0.999 6>0.9，說明線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取0.2 mL黃芪皂苷樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進(jìn)行操作，隨行空白對(duì)照組，在583 nm波長(zhǎng)處重復(fù)以上操作6次，測(cè)定吸光度值(A)。精密度試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.33%，表明儀器可靠，精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取0.2 mL黃芪皂苷樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進(jìn)行操作，隨行空白對(duì)照組，分別在583 nm波長(zhǎng)處測(cè)定供試品溶液在0、1、2、3、4、5 h的吸光度值(A)。結(jié)果表明，在5 h內(nèi)，穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.06%。在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值不超過3%時(shí)，則說明試驗(yàn)穩(wěn)定性良好。因此，供試品檢測(cè)時(shí)間3 h，在穩(wěn)定性設(shè)定時(shí)間5 h之內(nèi)，說明試驗(yàn)可靠，穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱定同一樣品藥材粉末6份，每份約10.0 g，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進(jìn)行操作，隨行空白對(duì)照組，測(cè)定吸光度值(A)，計(jì)算6份供試品的黃芪總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明黃芪總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為26.2 mg/g，重復(fù)性試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.23%，說明該方法重復(fù)性較好。

加樣回收率試驗(yàn)：取9份已知黃芪總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的供試品溶液0.1 mL，然后分別加入0.1 mL質(zhì)量濃度為0.655、1.310、1.965 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進(jìn)行操作，隨行空白對(duì)照組，測(cè)定吸光度值(A)，計(jì)算黃芪總皂苷回收率。結(jié)果表明，黃芪總皂苷的平均回收率為99.20%；一般中藥材回收率要求控制在95%～100%，試驗(yàn)中平均回收率符合要求，說明本方法準(zhǔn)確率符合要求。

黃芪皂苷樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定：將已經(jīng)制備的樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，生黃芪總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.5 mg/g、炒制鹽浸黃芪總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.4 mg/g、飯蒸鹽浸黃芪總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.6 mg/g。

2.3 總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

總黃酮成分測(cè)定條件：亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測(cè)定黃酮類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm。吸取0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL質(zhì)量濃度為1.0 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于10 mL容量瓶中，加無水乙醇至2 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻放置6 min；再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻放置6 min；加入濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液4 mL，用體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇定容至10 mL容量瓶中，放置15 min。隨行空白對(duì)照組，在510 nm波長(zhǎng)下采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值(A)，并對(duì)結(jié)果構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=1.188 4ρ+0.045 2(0.25≤ρ≤0.65)，R2=0.999 3>0.9，說明線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取1.0 mL黃芪黃酮樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進(jìn)行操作；隨行空白對(duì)照組，在510 nm波長(zhǎng)處重復(fù)以上操作6次，測(cè)定吸光度值(A)；精密度試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.43%，表明儀器可靠，精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取1.0 mL黃芪黃酮樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進(jìn)行操作；隨行空白對(duì)照組，分別510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定供試品溶液在0、1、2、3、4、5 h的吸光度值(A)，在5 h內(nèi)，穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.66%。在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值不超過3%時(shí)，則說明試驗(yàn)穩(wěn)定性良好。因此，供試品檢測(cè)時(shí)間2 h，在穩(wěn)定性設(shè)定時(shí)間5 h之內(nèi)，說明試驗(yàn)可靠，穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱定同一樣品藥材粉末6份，每份約20.0 g，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進(jìn)行操作；隨行空白對(duì)照組，測(cè)定吸光度值(A)，計(jì)算6份供試品的黃芪總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。黃芪總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為114.6 mg/g，重復(fù)性試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.24%，說明該方法重復(fù)性較好。

加樣回收率試驗(yàn)：取9份已知黃芪總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的供試品溶液0.5 mL，然后分別加入質(zhì)量濃度為0.459 2、0.918 4、1.377 6 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL，置于10 mL容量瓶中；按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進(jìn)行操作，隨行空白對(duì)照組，測(cè)定吸光度值(A)，計(jì)算黃芪總黃酮回收率。結(jié)果表明，黃芪總黃酮的平均回收率為98.70%，一般中藥材回收率要求控制在95%～100%之間，試驗(yàn)中平均回收率符合要求，說明本方法準(zhǔn)確率符合要求。

黃芪黃酮樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定：將已經(jīng)制備的樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，生黃芪總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為114.5 mg/g、炒制鹽浸黃芪總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為113.7 mg/g、飯蒸鹽浸黃芪總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為113.6 mg/g。

3 討論

黃芪藥用歷史悠久，也是現(xiàn)代中醫(yī)臨床最常用的大宗藥材之一。祖國(guó)傳統(tǒng)處理藥材理論認(rèn)為，生黃芪主要偏于固表止汗，蜜處理黃芪偏于補(bǔ)虛損、補(bǔ)中益氣[12]，而鹽處理黃芪主下行入腎，補(bǔ)腎及治崩帶淋濁。中藥材的化學(xué)成分種類繁多，在臨床用藥過程中，需要針對(duì)性地用藥，不同的處理方式也會(huì)使藥材的效用產(chǎn)生一定的差異性。本研究中，炒、飯蒸兩種炮制方法對(duì)鹽浸黃芪飲片進(jìn)行處理，黃芪中總多糖、總皂苷、總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所不同，藥材不同的處理方式，可使藥效產(chǎn)生不同的治療效果。中藥黃芪經(jīng)鹽處理后，黃芪總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果，由大到小依次為炒制鹽浸黃芪、生黃芪、飯蒸鹽浸黃芪。在探討不同炮制方法對(duì)黃芪中多糖成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響中發(fā)現(xiàn)，生黃芪總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于鹽浸黃芪，其原因是多糖的熱穩(wěn)定性較好，也與處理后黃芪甲苷、氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低有關(guān)；在本研究中測(cè)定的炒制鹽浸黃芪的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)也是增加。在飯蒸鹽浸黃芪處理試驗(yàn)中，采用稻米進(jìn)行蒸制，稻米中含有氨基酸比較豐富，在蒸制過程中稻米中的氨基酸對(duì)鹽制后的藥材降低的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所補(bǔ)充，使鹽制過程中黃芪的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較??；因此，飯蒸鹽浸黃芪的總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所降低。黃芪總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由大到小依次為生黃芪、炒制鹽浸黃芪、飯蒸鹽浸黃芪，在研究蒙古黃芪、生飲片及其炮制品的質(zhì)量差異時(shí)，生飲片中黃芪甲苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于鹽浸黃芪，高溫對(duì)黃芪甲苷結(jié)構(gòu)造成破壞，高溫會(huì)影響皂苷類化學(xué)成分，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低；本研究中測(cè)定，炒制鹽浸黃芪的總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。在飯蒸鹽浸黃芪處理試驗(yàn)中，長(zhǎng)時(shí)間的高溫蒸制，使總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，因此飯蒸鹽浸黃芪的總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。黃芪總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由大到小依次為生黃芪、炒制鹽浸黃芪、飯蒸鹽浸黃芪；在研究不同方法對(duì)黃芪中黃酮成分的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)鹽炙對(duì)黃酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化無顯著影響，本研究中測(cè)定炒制鹽浸黃芪的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)略微下降。在飯蒸鹽浸黃芪處理試驗(yàn)中，會(huì)使總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)略微下降。

總之，中藥黃芪的主要化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)生變化，會(huì)直接改變黃芪的臨床功效，鹽處理方式可以以改變黃芪的主要化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，影響其藥效。因此，在臨床使用中，要進(jìn)行科學(xué)的用藥方式達(dá)到預(yù)期的治療效果。