何逸瑋， 邵國(guó)良

血管腔內(nèi)栓塞是介入治療的重要組成部分，常用的栓塞材料包括固態(tài)栓塞劑（明膠海綿、聚乙烯醇顆粒、彈簧圈等）和液態(tài)栓塞劑（碘化油、無(wú)水乙醇、魚(yú)肝油酸鈉等）。 隨著材料學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的微球類(lèi)栓塞劑被使用，包括永久性栓塞微球和生物可降解性微球。 栓塞微球表面光滑、不易聚集、粒徑可統(tǒng)一，對(duì)特定組織器官的靶向性高，栓塞效果好，尤其載藥微球?qū)盒阅[瘤的治療同時(shí)起到栓塞和藥物治療的作用，顯示了較好的效果［1］。 但常用的栓塞微球自身不能在X 射線(xiàn)、CT 或MRI 下顯影，因而難以精準(zhǔn)掌控其術(shù)中的注射和術(shù)后的復(fù)查定位。為提高微球栓塞治療的安全性與有效性，且利于術(shù)后復(fù)查，研制具有可視化功能的微球成為當(dāng)前的一個(gè)熱點(diǎn)，本文就其臨床意義、可視化微球的制備、生物相容性及今后展望作一綜述。

1 可視化微球的臨床意義

常用的介入栓塞微球存在自身無(wú)法顯影的缺點(diǎn)，在體內(nèi)無(wú)法跟蹤和定位，因而無(wú)法準(zhǔn)確判斷微球在血管中的分布情況和栓塞部位，僅能憑借與外源性對(duì)比劑（如碘海醇）的混合來(lái)輔助微球可視化［2］，但外源性對(duì)比劑很快就會(huì)隨著血流彌散，從注射部位迅速清除， 術(shù)后無(wú)法確認(rèn)栓塞微球的確切位置，從而影響療效評(píng)價(jià)［3-7］。 賦予栓塞微球具有自身顯影功能，在血管和組織中具有可視性，操作者可以實(shí)時(shí)監(jiān)控微球輸注，精準(zhǔn)操控，將大大提高手術(shù)操作過(guò)程的精準(zhǔn)性，有效避免異位栓塞的發(fā)生，從而提高栓塞治療的療效，減少異位栓塞造成的并發(fā)癥。 同時(shí)在介入術(shù)后的復(fù)查中可辨認(rèn)栓塞微球的位置，有利于評(píng)估栓塞區(qū)域，指導(dǎo)后續(xù)治療［8-9］。 對(duì)于載藥微球而言，通過(guò)微球的精確定位，可間接指示藥物釋放的靶位。

2 可視化微球的制備

可視化微球按可視的范圍分為三類(lèi)：X 射線(xiàn)可視微球，MRI 可視微球，多模態(tài)（X 射線(xiàn)/MRI）可視微球。 可視微球的制備可通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)，常用的主要方法有：物理包埋法、乳化法、電噴霧法、溶劑萃取法、微流控技術(shù)等。 物理包埋法是將顯影物質(zhì)包埋于微球中。 該方法存在顯影物質(zhì)會(huì)從微球中滲出，改變微球的物理化學(xué)性質(zhì)（如疏水性、彈性等），使得微球密度增加，出現(xiàn)微球沉淀等問(wèn)題［10］。乳化法是將油相物質(zhì)與水相物質(zhì)混合形成乳液，其本質(zhì)是一種液體以極微小液滴均勻地分散在另一種不相容的液體中［11］。 電噴霧（electrospraying，ES）技術(shù)是一種可以制備載藥的聚合納米粒子的新型技術(shù)［12］，它滿(mǎn)足了納米粒子生產(chǎn)的可擴(kuò)展性、重現(xiàn)性、有效封裝等潛在需求［13］，能精確控制顆粒大小和分布。 它通過(guò)選擇合適的材料，控制顆粒的粒徑，可優(yōu)化藥物釋放率和藥物靶向治療作用，通過(guò)將治療劑包埋在微球內(nèi)，來(lái)降低初始高速釋放率［14］。 溶劑萃取法是通過(guò)一種化合物在兩種互不相溶或微溶的溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同，使其從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中，經(jīng)過(guò)多次萃取，最終提取出絕大部分化合物的方法。 相較于攪拌法等方法，溶劑萃取法能夠有效避免蛋白損傷及微球碰撞粘連等不利因素［15］。 微流控技術(shù)是基于微流控芯片，利用微通道對(duì)微量流體或樣品（10-9～10-18L）進(jìn)行操作或控制的技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)為使用樣品、試劑的劑量少以及液滴尺寸、形狀可控［16］。 可視微球的制備，目前主要采用的方法是將不透X 射線(xiàn)的元素和MRI 對(duì)比劑引入微球中。 早期主要采用物理包埋法，而近年來(lái)隨著微流控技術(shù)的興起，其制備的微球，尺寸均一可控，已成為可視微球制備的一種新興的方法。

2.1 X 射線(xiàn)可視微球的制備

物質(zhì)的密度和厚度決定了其在X 線(xiàn)下的顯影強(qiáng)度。 將不透X 射線(xiàn)的元素引入微球以實(shí)現(xiàn)微球在X 線(xiàn)下的可視。不透X 射線(xiàn)的元素包括I，Ag，Ba，Ta等。 Wang 等［17］和Beh 等［18］采用微流控技術(shù)和離子交聯(lián)法合成了不透射線(xiàn)的、尺寸均勻的BaSO4- 海藻酸鹽微球（KMG）。Zeng 等［19］采用一步靜電噴霧法制備了鉭納米粒子海藻酸鈣微球（Ta@CaAlg）。Kilcup 等［20］用溶劑萃取法合成了由聚乳酸- 羥基乙酸（PLGA）和不透射線(xiàn)多元硅酸鋅玻璃（ORP5）組成的不透射線(xiàn)的復(fù)合微球（RC- DEB）。 Ashrafi 等［21］在DC BeadTM基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，將2，3，5- 三碘苯甲醛偶聯(lián)到聚乙烯醇（PVA）水凝膠微球的聚乙烯醇骨架上，制成DC Bead LUMITM。 該方法可使碘均勻地附著在整個(gè)微球結(jié)構(gòu)中，在CT 下顯像。 Hagan 等［22］在DC Bead LUMITM基礎(chǔ)上進(jìn)行研究， 在DC Bead LUMITM中加入一種小分子多酪氨酸激酶抑制劑（MTKi），制備了Vandetanib 載藥微球，為可視載藥微球提供了更多可能。

將合成的微球加入玻璃瓶中或制備成模體，在X射線(xiàn)下觀察顯影效果。 Wang 等［17］將含有不同BaSO4濃度的BaSO4/ALG 微球加入玻璃瓶中， 在CT 下掃描，對(duì)微球的X 射線(xiàn)可見(jiàn)度進(jìn)行評(píng)估。 結(jié)果顯示微球中BaSO4的含量越高，在X 射線(xiàn)照射下的亮度越強(qiáng)，樣品所測(cè)得的CT 值就越大。 Beh 等［18］將制備的X 射線(xiàn)可視微球（XEM）加入瓊脂糖凝膠和稀釋液中，組成模體，在CT 下檢測(cè)XEM 的可視度。 結(jié)果顯示射線(xiàn)下微球的可見(jiàn)度與XEMs 的濃度呈線(xiàn)性關(guān)系。 Ashrafi 等［21］將DC Bead LUMITM制成均勻的瓊脂糖微球模體，在μ-CT 下掃描分析，結(jié)果證實(shí)了碘均勻分布在微球內(nèi)部，并且加載阿霉素（Dox） 或伊立替康（Iri）不會(huì)影響碘在微球中的分布。

研究者將這些微球植入動(dòng)物體內(nèi)，觀察微球在不同時(shí)期X 射線(xiàn)下的顯影效果。 Wang 等［17］在DSA的引導(dǎo)下，經(jīng)微導(dǎo)管將BaSO4/ALG 微球懸液注入兔腎動(dòng)脈，以市售海藻酸鈣微球（KMG）與市售碘基對(duì)比劑（碘二醇溶液）混合為參照物，注入兔腎動(dòng)脈。在指定的時(shí)間間隔內(nèi)，通過(guò)DSA 和CT 成像進(jìn)一步評(píng)估兔腎臟的栓塞效果和兩種藻酸鹽微球的能見(jiàn)度。 結(jié)果顯示與KMG 微球相比，BaSO4/ALG 微球栓塞的腎臟輪廓更清晰、完整，對(duì)比度更好。 7 d 和14 d后，KMG 微球動(dòng)物的腎臟輪廓不再清晰可見(jiàn)，而B(niǎo)aSO4/ALG 微球栓塞動(dòng)物， 仍然可以觀察到由圍繞腎臟的小白點(diǎn)組成的白色環(huán)，這可能是由于栓塞后腎臟萎縮和微球的潛在的碎裂所致。 白色環(huán)的大小和位置反映了栓塞的范圍和位置。 此研究表明，BaSO4/ALG 微球在X 射線(xiàn)下的良好能見(jiàn)度不僅有利于評(píng)價(jià)即時(shí)的栓塞效果，而且有利于對(duì)栓塞部位和療效的隨訪評(píng)估。 Beh 等［18］采用健康豬進(jìn)行了腎動(dòng)脈和胃底動(dòng)脈的栓塞術(shù)， 以檢測(cè)XEM 在體內(nèi)的可見(jiàn)性和栓塞效果。 結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中XEM 直接可視，能清晰觀察到動(dòng)脈的栓塞，并不需要加入外源性對(duì)比劑。 其中在一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中可見(jiàn)到XEM 的反流，在術(shù)后的病理檢查中得到證實(shí)，這充分說(shuō)明了栓塞過(guò)程中微球可視化的重要性。Tacher 等［23］采用VX2 兔肝腫瘤模型，在動(dòng)脈栓塞術(shù)后處死動(dòng)物，立即采用錐束CT 掃描肝臟。 然后取出肝臟放入裝有10%緩沖甲醛溶液的容器中。 在術(shù)后第3 天和第7 天，再次進(jìn)行錐束CT 掃描，觀察病灶的可見(jiàn)度和對(duì)比劑隨時(shí)間的洗脫情況。 3 至5 周后，使用高分辨率的顯微CT 評(píng)估肝葉內(nèi)微球的可見(jiàn)性。 結(jié)果顯示栓塞微球在所有CT 掃描圖像中都可以觀察到。 Ashrafi 等［21］構(gòu)建VX2 兔肝內(nèi)腫瘤模型，進(jìn)行選擇性肝動(dòng)脈栓塞術(shù)，1 h 后處死動(dòng)物并CT 掃描。 結(jié)果顯示腫瘤周?chē)鷦?dòng)脈血管內(nèi)有負(fù)載阿霉素的DC Bead LUMITM，這是因?yàn)樵谠撏媚Ｐ椭校[瘤血管相對(duì)較細(xì)，所以很少有微球進(jìn)入腫瘤內(nèi)部，但腫瘤的強(qiáng)化程度低于周?chē)螌?shí)質(zhì)的強(qiáng)化程度，表明腫瘤的供血?jiǎng)用}已被成功栓塞。

2.2 MR 可視微球的制備

制備MR 可視微球通常是在微球中加入MR 對(duì)比劑，包括順磁性鑭系元素（如鈰、鑭、釹、鐠等）和超順磁性氧化鐵（super paramagnetic iron oxide，SPIO，包括Fe3O4，F(xiàn)e2O 等）［4，24-25］。Oerlemans 等［25］采用噴射切割技術(shù)（JetCutter）制備了藻酸鹽- 鑭系元素微球。Kim 等［26-27］分別在2014年和2015年采用微流控技術(shù)制備了包裹了抗癌藥物（6- 甲氧乙基氨基硫化物，MEAN）的超小型超順磁性氧化鐵（USPIO）納米簇藻酸鹽微球和包裹了抗癌藥物（氨化物，AMN）的超小型超順磁性氧化鐵海藻酸鹽微球，兩者均為既可載藥又能MR 可視的栓塞微球。van Elk 等［28］用自制的噴霧裝置制備了溫度敏感脂質(zhì)體-海藻酸鋇微球（TSL-Ba-MS）和含有鈥離子的海藻酸微球（Ho-MS）。TSL 中含 有阿 霉素（DOX） 和Gd （HPDO3A）（H2O）（T1MRI 對(duì)比劑），鈥離子作為T(mén)2MRI 對(duì)比劑，將兩種微球以95∶5 的比例混合， 以實(shí)現(xiàn)微球的可視化。Wang 等［29］采用反相懸浮聚合法制備了空白聚丙烯酸微球， 然后用原位沉淀法負(fù)載超順磁性氧化鐵（SPIO）納米粒子，得到MRI 可檢測(cè)的SPIO 載藥聚丙烯酸微球（SPMs）。Choi 等［30］采用噴霧凝聚法制備了由海藻酸鈣和USPIO 納米團(tuán)簇組成的栓塞型微球（ALG-USPIO 微球），該微球可按需降解并在MRI下可視。

Wang 等［29］將一定體積的不同粒徑范圍（100～300，300～500，500～700 和700～900 μm）的微球（SPMs）均勻懸浮在預(yù)熱的1%瓊脂糖溶液中，最終濃度分別為0%，2.5%，5%，10%和20%， 分別轉(zhuǎn)移到Eppendorf 管中，冷卻，使微球懸浮在凝膠中，同時(shí)制備不同亞組濃度為20%PM （polyacrylic acid microspheres，聚丙烯酸微球）樣品作為對(duì)照，在MR下比較T2 加權(quán)成像情況。 結(jié)果顯示各亞組SPM 均可清晰檢測(cè)到， 而PM 由于與空白凝膠信號(hào)強(qiáng)度相近而不能被檢測(cè)到。 各亞組SPM 的MR 信號(hào)強(qiáng)度隨SPM 濃度的增加而降低。 此外，在相同濃度下，小顆粒SPM 的MR 信號(hào)強(qiáng)度比大顆粒SPM 的MR 信號(hào)強(qiáng)度要低。 Kim 等［27］將由不同量的AMN- 磁性微球（20 wt%磁團(tuán)簇）組成的100 μL 溶液添加到有MCARH7777 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中， 在MR 下比較T2 加權(quán)成像情況。 結(jié)果顯示在所評(píng)估的5 個(gè)磁性微球濃度中，T2 加權(quán)信號(hào)隨微球濃度的增加而呈指數(shù)下降。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，大多數(shù)研究者均采用小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將MR 可視的微球植入小鼠體內(nèi)，在不同時(shí)期采用MR 掃描觀察微球顯影效果。 Wang 等［29］在3 只小鼠背部皮下注射100～300 μm 的SPM 與1%的羧甲基纖維素鈉溶液組成的混懸液0.2 mL，分別于注射后即刻和14 d 進(jìn)行MRI 隨訪。 結(jié)果顯示在T2 加權(quán)MR 圖像中，注射SPM 后即刻和14 d，實(shí)驗(yàn)小鼠的皮下組織內(nèi)可檢測(cè)到低信號(hào)區(qū)。 Kim 等［27］在10 只建模小鼠肝左動(dòng)脈注入AMN- USPIO- 海藻酸鹽微球（5 mg/200 μL），在動(dòng)脈注入微球之前和之后收集T2 加權(quán)圖像。 結(jié)果顯示肝內(nèi)注射微球僅限于靶向的病灶肝葉，微球沉積的位置表現(xiàn)為點(diǎn)狀低信號(hào)，證實(shí)了微球栓塞的精準(zhǔn)性。

2.3 多模態(tài)可視微球的制備

單一模態(tài)可視微球不能全面解決術(shù)中實(shí)時(shí)監(jiān)視、術(shù)后多模態(tài)顯影的問(wèn)題。 基于微球內(nèi)同時(shí)聚合不透X 射線(xiàn)物質(zhì)和MR 對(duì)比劑的思路，有學(xué)者開(kāi)始研究X 射線(xiàn)/MRI 均可顯影的多模態(tài)可視微球。Stampfl 等［31］采用包埋法制備多模態(tài)可視微球。 他們先在Embozene 微球的核心內(nèi)包埋了不透射線(xiàn)的碘和硫酸鋇，此外，還在微球中包埋了氧化鐵，使其在MR 下可視， 從而制備了改良版Embozene 微球。Oerlemans 等［9］采用乳化、噴射切割技術(shù)（JetCutter）制備了由海藻酸鈉（基質(zhì)形成聚合物）、鈥（交聯(lián)和MRI 對(duì)比劑）、碘化油（不透射線(xiàn)對(duì)比劑）和PluronicF-68（表面活性劑）組成的鈥- 碘油- 海藻酸鹽微球（HO-LIP-AMS）。 Kim 等［32］采用微流控凝膠法制備KMG 微球內(nèi)載入金納米棒和磁簇的納米復(fù)合微球。趙瑋等［33］采用乳化交聯(lián)法制備載固態(tài)納米Fe3O4顆粒的明膠栓塞微球。 將這些微球制備成模體，分別在X 射線(xiàn)和MR 下觀察其顯影情況。 趙瑋等［33］制備的納米Fe3O4- 明膠栓塞微球，根據(jù)微球中Fe3O4與明膠質(zhì)量比將微球分為3 組（a 組1∶1，b 組2∶1，c 組3∶1），加入去離子水EP 管中，在DSA 及CT 下觀察X 線(xiàn)下顯影效果，檢測(cè)顯示，b、c 組微球顯影能力明顯強(qiáng)于a 組。 b、c 組CT 值高于a 組。 取最優(yōu)化微球， 秤取不同質(zhì)量微球分別加至90℃1%瓊脂糖溶液中，在MRI 下檢測(cè)T2 值，結(jié)果顯示T2 值隨微球濃度增高而逐漸下降。Kim 等［32］制備了金納米棒-磁簇- 海藻酸鈉納米復(fù)合微球， 用不同濃度的微球在1%瓊脂糖中稀釋制備成像模體，進(jìn)行MRI 和CT成像。 結(jié)果顯示隨著微球濃度的增加，T2 加權(quán)信號(hào)降低，CT 衰減增加。

Kim 等［32］將制備好的金納米棒- 磁簇- 海藻酸鈉納米復(fù)合微球，在原位肝細(xì)胞癌大鼠模型上，進(jìn)行了經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈內(nèi)灌注，隨后進(jìn)行了MR 和CT 成像。在T2 加權(quán)MRI 圖像中， 腫瘤相對(duì)于周?chē)谓M織表現(xiàn)為高信號(hào)，微球沉積的位置表現(xiàn)為腫瘤周邊信號(hào)強(qiáng)度的局部降低。CT 成像顯示腫瘤位置周?chē)乃p增強(qiáng)。Stechele 等［34］對(duì)9 只新西蘭大白兔用SPIO- 聚二氧六環(huán)酮（PDO）微球進(jìn)行單側(cè)腎下極動(dòng)脈的超選擇性栓塞，在介入后1、4、8、12、16 周分別進(jìn)行DSA檢查和MRI。 結(jié)果顯示在每個(gè)MR 序列中，即使血管造影顯示完全再灌注， 也能檢測(cè)到負(fù)載SPIO 的微球的信號(hào)改變， 這表明SPIO 浸漬是無(wú)創(chuàng)性顯示PDO 微球的有效方法。 T2 序列是檢測(cè)SPIO 負(fù)載微球的最敏感的MRI 序列。

3 生物相容性

評(píng)估微球生物相容性的方法有體外直接接觸法和體內(nèi)植入法。 體外直接接觸法是將微球與細(xì)胞在體外接觸培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；體內(nèi)植入法是將微球植入動(dòng)物體內(nèi)合適的部位，觀察機(jī)體的反應(yīng)，并在不同時(shí)期取出含植入微球的組織進(jìn)行檢查及評(píng)價(jià)［35］。

Wang 等［17］采用體外直接接觸法，用不同濃度的BaSO4/ALG 微球與肝細(xì)胞（HepG2 細(xì)胞）孵育24 h，采用MTT 法和細(xì)胞培養(yǎng)插入法對(duì)BaSO4/ALG 微球的細(xì)胞毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。 結(jié)果顯示微球即使在5 mg/mL的濃度水平下也是相對(duì)無(wú)毒的，表明該微球有較好的生物相容性。Beh 等［18］采用體內(nèi)植入法，取出體內(nèi)可能接受NTE 的栓塞器官和鄰近結(jié)構(gòu)并進(jìn)行蘇木精- 伊紅和三色染色，檢測(cè)XEM 和/或常規(guī)栓塞微球是否存在、位置、微球完整性，以及是否存在炎癥。病理學(xué)檢查顯示，XEMs 在給藥3 周后仍然完好無(wú)損，局部沒(méi)有明顯的纖維化或炎性浸潤(rùn)，具有良好的生物相容性。

可視化栓塞微球相較于普通微球，實(shí)現(xiàn)了微球自身在血管中的顯影，可實(shí)時(shí)監(jiān)控栓塞操作并直接反饋，避免非靶向栓塞，同時(shí)便于栓塞術(shù)后復(fù)查，大大提高了栓塞治療的有效性與安全性。 而多模態(tài)可視微球?yàn)樾g(shù)后根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的成像模式示蹤微球的分布及觀察病灶的變化提供更多的選擇。 近年來(lái)，隨著載藥微球在栓塞治療肝惡性腫瘤中的廣泛應(yīng)用，對(duì)可視化的研究成為深受關(guān)注的問(wèn)題。 但在可視化載藥微球栓塞治療研究中存在實(shí)驗(yàn)效果與臨床應(yīng)用不一致的情況，同時(shí)如何通過(guò)成像分布來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤中藥物的劑量或腫瘤不同部位的藥物濃度也有待進(jìn)一步深入研究［36-37］。 此外，具備表面增強(qiáng)拉曼散射成像的微球可在腫瘤術(shù)中起到影像導(dǎo)航的作用［38-40］。 但到目前為止，除個(gè)別X 線(xiàn)可視化微球面市外，大多數(shù)尚處于實(shí)驗(yàn)室階段，隨著相關(guān)研究的進(jìn)展，相信將有更多的可視化微球進(jìn)入臨床。