朱璟希，李紅

復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是一種常見且嚴重的病理性妊娠，通常指在妊娠28周前與同一配偶連續(xù)發(fā)生3次及3次以上的妊娠失敗[1]。美國生殖醫(yī)學會發(fā)布的最新流行病學資料顯示自然流產(chǎn)的發(fā)生率為15%～20%，其中RSA發(fā)生率約占妊娠總數(shù)的2%～5%，這不僅對育齡期女性造成極大的生理和精神創(chuàng)傷，也給家庭和睦和社會穩(wěn)定都帶來很大的隱患[2-3]。RSA的病因復雜，常涉及遺傳、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)、生殖結(jié)構(gòu)異常和環(huán)境等多方面因素[2，4]。然而，目前仍有50%左右的RSA發(fā)病機制尚不明確，這部分病例又稱為原因不明的RSA（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。因此，深入探明URSA的發(fā)病機制并進行早期干預，進一步降低RSA患者再次妊娠流產(chǎn)率，提高RSA活產(chǎn)率迫在眉睫。近年隨著表觀遺傳學這一研究領(lǐng)域的迅速發(fā)展，為RSA的病因?qū)W研究打開了新的視角。表觀遺傳學是指在遺傳基因序列不變的情況下，某些基因的功能發(fā)生可遺傳的變化，主要包括DNA或RNA甲基化、組蛋白或染色質(zhì)翻譯后修飾（post translation modification，PTM）和非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）調(diào)控等。DNA和蛋白質(zhì)的表觀遺傳改變導致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑，從而通過激活或抑制決定細胞分化、增殖和凋亡等基本生命過程的關(guān)鍵基因表達，不僅在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學調(diào)控作用，還可以通過代際、跨代遺傳傳遞給后代進而影響其健康[5-6]。鑒于生命早期的表觀遺傳修飾決定了儲存在基因組中的遺傳信息的表達，現(xiàn)從DNA和RNA甲基化、組蛋白修飾及ncRNA調(diào)控這幾個方面就表觀遺傳學在RSA中的研究進展進行綜述。

1 DNA和RNA甲基化在RSA中的研究進展

1.1 DNA甲基化與RSA DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)也是目前研究最為廣泛的表觀遺傳機制，主要發(fā)生在位于基因啟動子區(qū)域的CpG島（CpG island，CGI）上，通過將S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）的甲基添加到胞嘧啶環(huán)的5號位上生成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）。由于m5C結(jié)構(gòu)既可以阻止轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）與DNA位點的結(jié)合，也可以通過結(jié)合組蛋白修飾招募甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白進行染色質(zhì)重塑，進而導致基因表達的沉默[7]。研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化修飾通過調(diào)控細胞分化和發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、X染色體失活、基因組印跡和染色體穩(wěn)定性等多種生物學過程在發(fā)育中發(fā)揮著極其重要的功能，與不良妊娠的發(fā)生密切相關(guān)[8-9]。

最新研究發(fā)現(xiàn)URSA患者叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3（forkhead box protein P3，F(xiàn)oxp3）基因調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）特異性去甲基化區(qū)（Tregspecific demethylated region，TSDR）的甲基化水平顯著高于健康對照組，且其甲基化水平與Treg比例和Foxp3基因的轉(zhuǎn)錄表達水平呈負相關(guān)，提示Foxp3基因TSDR高甲基化狀態(tài)可能是URSA患者CD4+T細胞中Foxp3基因的轉(zhuǎn)錄表達降低和Treg比例降低的原因之一[10]。由于DNA甲基化在配子發(fā)生和妊娠早期過程中不可或缺，研究者通過全基因組DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)，活化白細胞黏附分子（activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM）等基因可能是RSA的診斷生物標志物和候選調(diào)控靶點[11]。Hanna等[12]利用甲基化芯片分析核型正常的RSA組（RM組）、單次流產(chǎn)組（M組）和選擇性終止妊娠組（TA組）中妊娠早期絨毛的DNA甲基化差異情況，結(jié)果顯示與TA組相比，受體酪氨酸激酶AXL的甲基化水平上調(diào)，而防御素β1（DEFB1）基因的甲基化水平下調(diào)，提示這些胎盤特定位點的DNA甲基化水平改變可能是核型正常的RSA中胎盤功能低下的原因之一。另有研究采用全基因組DNA甲基化分析結(jié)合蛻膜組織全基因組基因表達，探討DNA甲基化水平改變在RSA中的作用，共鑒定出539個差異甲基化區(qū)（DMR），并與基因表達顯著相關(guān)，其中環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白5（cAMP responsive element binding protein 5，CREB5）基因附近的低甲基化DMR招募轉(zhuǎn)錄因子P53和SP1結(jié)合并上調(diào)CREB5的表達，提示CREB5甲基化水平的改變可能在RSA發(fā)病中發(fā)揮重要的作用，CREB5可能是一個潛在的RSA診斷生物標志物[13]。由此可見，DNA甲基化異?？赡苁荝SA發(fā)生的原因之一，而這些基因的DNA甲基化水平可能是診斷RSA的潛在生物標志物，具有重要的臨床應用價值。

DNA甲基化過程常涉及各種酶類，包括DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）、具有去甲基化作用的DNA 甲基化羥化酶（ten eleven translocation，TET）等，因此，在研究RSA患者全基因組DNA甲基化水平的同時常會關(guān)注DNA甲基化過程中相關(guān)酶類的表達情況。研究發(fā)現(xiàn)與妊娠早期人工流產(chǎn)對照組相比，RSA組的全基因組甲基化水平顯著降低，RSA組絨毛組織中DNMT1和DNMT3b的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平顯著降低，TET1和TET2的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平顯著增加，提示RSA患者的絨毛組織呈現(xiàn)出低甲基化水平的狀態(tài)，可能與DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3b表達下調(diào)和DNA甲基化羥化酶TET1、TET2表達上調(diào)有關(guān)[14]。此外，在基因型研究中發(fā)現(xiàn)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3b 的基因多態(tài)性（rs1569686）可能是RSA易感性的遺傳標志[15]。

葉酸代謝作為生成甲基供體活性甲硫氨酸SAM的重要途徑，與DNA甲基化的發(fā)生密不可分。研究發(fā)現(xiàn)與匹配孕周的健康對照組相比，RSA病例中葉酸代謝關(guān)鍵酶亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因特異性甲基化顯著升高（P=0.002），強調(diào)了MTHFR基因特異性甲基化與RSA的關(guān)聯(lián)[16]。Rotondo等[17]發(fā)現(xiàn)RSA患者配偶的精子細胞中的MTHFR基因啟動子區(qū)域呈現(xiàn)出高水平的甲基化狀態(tài)，進一步提示MTHFR基因的甲基化水平異?？赡苡绊懪咛サ恼ＩL發(fā)育，進而導致RSA的發(fā)生。

DNA甲基化過程的異常導致基因表達調(diào)控的改變，直接或間接地影響了胚胎的著床、生長和發(fā)育。一方面這些甲基化水平差異基因有望作為診斷RSA的潛在生物標志物，另一方面，需要更多的基礎(chǔ)研究對其在RSA中的分子機制及相關(guān)的信號通路進行深入研究，以期為RSA的預防和治療提供新的視角。

1.2 RNA甲基化與RSA 在很長一段時期內(nèi)，DNA都是位于生命科學研究的首位，然而，隨著近20年RNA轉(zhuǎn)錄后修飾和功能性ncRNA的發(fā)現(xiàn)徹底改變了學者們對RNA的看法，RNA 扮演著攜帶遺傳信息和操縱遺傳調(diào)控的雙重角色。RNA甲基化是在RNA 層面上調(diào)控基因表達的一種重要方式，常見的甲基化修飾包括N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）、N1-甲基腺嘌呤（N1-methyladenosine，m1A）和m5C等[18]，其中m6A是哺乳動物mRNA中最為普遍的內(nèi)部修飾，m6A是一種發(fā)生在腺苷酸N6位的甲基化修飾，是一種動態(tài)的、可逆的甲基化修飾，過程涉及甲基轉(zhuǎn)移酶（Writers）、去甲基酶（Erasers）和甲基化閱讀蛋白（Readers）等[19]，通過調(diào)控選擇性剪切、出核、定位、蛋白質(zhì)翻譯和降解等生命過程調(diào)控包括分化、侵襲和凋亡等多重生物學效應，參與到多種疾病的病理和生理過程中[20-22]。

Li等[23]為探索m6A修飾在RSA患者胎盤中的作用，采用熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）、m6ARNA甲基化定量（MeRIP-qPCR）和免疫組織化學方法，分別檢測RSA患者和健康對照組絨毛組織中m6A甲基化水平和m6A去甲基化酶AlkB同源蛋白5（AlkB homologue 5，ALKBH5）基因的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于對照組RSA患者胎盤絨毛組織中mRNA水平的m6A甲基化顯著降低，而ALKBH5的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達顯著上調(diào)；深入研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5可能通過依賴于m6A調(diào)控機制抑制滋養(yǎng)層細胞的侵襲，該研究為進一步探索RSA中廣泛的RNA表觀遺傳調(diào)控模式奠定了基礎(chǔ)。然而，目前關(guān)于RNA表觀修飾異常與RSA的發(fā)病機制研究尚淺，有待于更多的科研工作者進行深入探索。

2 組蛋白修飾在RSA中的研究進展

在染色質(zhì)中，DNA由組蛋白八聚體包裹成高度緊密的結(jié)構(gòu)，從而形成串珠樣核小體。組蛋白八聚體由2個組蛋白2A（H2A）和2個組蛋白H2B（H2B）的四聚體組成，同時兩側(cè)是組蛋白3（H3）和組蛋白4（H4）的二聚體。這些組蛋白包含1個球形的羧基（C）末端結(jié)構(gòu)域和1個延伸的氨基（N）末端，它們受到多種PTM的影響，包括甲基化、乙?；?、泛素化、磷酸化和瓜氨酸化等，其中以組蛋白H3和H4上賴氨酸殘基的乙?；图谆佣啵@些修飾被稱為組蛋白修飾。在各種蛋白酶的參與下，組蛋白修飾通過調(diào)控DNA復制、轉(zhuǎn)錄以及損傷修復等生物學過程參與炎癥反應和包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病，其中以組蛋白甲基化酶和乙?；傅漠惓１磉_較為常見[24-25]。

Fatima等[26]在12例正常妊娠早期女性（對照組）和15例URSA患者的新鮮蛻膜/子宮內(nèi)膜組織中研究甲基轉(zhuǎn)移酶G9a和組蛋白H3K9甲基化的表達情況，結(jié)果表明，甲基轉(zhuǎn)移酶G9a在URSA組中的表達顯著低于對照組，而URSA組中組蛋白H3K9甲基化水平也顯著低于對照組，提示組蛋白甲基化修飾異?？赡苁菍е耈RSA的潛在原因之一。眾所周知，父源基因組缺陷被認為是自發(fā)性RSA的重要誘因之一，而氧化應激增加會導致染色質(zhì)、蛋白質(zhì)和膜脂損傷，學者們通過探討精子DNA包裝缺陷引起的組蛋白殘留與氧化應激是否存在顯著關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在發(fā)生流產(chǎn)的胚胎分化早期，組蛋白精氨酸和賴氨酸等位點的氧化修飾可能擾亂了父系表觀基因組調(diào)控[27]。此外，Wang等[28]通過應用曲古他汀A（TSA）抑制CBA/J小鼠CD4+CD25-T細胞組蛋白脫乙酰酶（HDAC），發(fā)現(xiàn)Foxp3的組蛋白修飾調(diào)控可產(chǎn)生功能性Treg，提示妊娠早期移植TSA誘導的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞有助于誘導母胎免疫耐受，并減少具有流產(chǎn)傾向小鼠的胚胎吸收，具有細胞免疫治療作用。由此可見，組蛋白位點的共價修飾在RSA的發(fā)生發(fā)展中起著異常關(guān)鍵的作用，而調(diào)控組蛋白修飾的相關(guān)研究能夠為RSA的防治提供一個新的視角。

3 ncRNAs在RSA中的研究進展

ncRNA作為基因組轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，雖不能作為蛋白質(zhì)翻譯的模板，但其是轉(zhuǎn)錄和蛋白表達過程中的重要調(diào)節(jié)因子，成為新型的疾病診斷標志物，具有重要的臨床應用價值[29]。根據(jù)大小，ncRNAs主要分為短鏈ncRNA（short non-coding RNA，sncRNA，＜200 nt）和長鏈ncRNA（long non-coding RNA，lncRNA，＞200 nt）。由于ncRNA參與許多生物學過程，且母胎界面的ncRNA表達水平異常可能參與RSA的發(fā)病，因而成為RSA病因?qū)W研究的熱點。

微小RNA（microRNA，miRNA）作為研究最為廣泛的sncRNA，是一種序列高度保守的單鏈RNA，約有20個nt，是維持生物穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵介質(zhì)，常通過緩沖外界干擾，從而確保生物體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。學者們?yōu)榱私沂綰RSA患者蛻膜組織中自然殺傷（NK）細胞的miRNA圖譜，應用miRNA表達譜分析鑒定出50個差異表達的miRNA，構(gòu)建了miRNA-基因-網(wǎng)絡、miRNA-Go分析-網(wǎng)絡和miRNA-基因-轉(zhuǎn)錄因子-網(wǎng)絡，確定了網(wǎng)絡中的關(guān)鍵miRNA——has-miR-5787及關(guān)鍵信號通路——Wnt 受體信號通路，提示miRNAs的異常表達與URSA之間存在著密切的關(guān)系，有助于URSA的臨床診斷和開發(fā)針對URSA的治療新靶點[30]。此外，Wang等[31]發(fā)現(xiàn)pri-miR-196A-2中的多態(tài)性位點miR-196A-2rs11614913T/T可能通過干擾成熟miR-196A-3p的產(chǎn)生，增強二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）的表達，從而增加RSA的遺傳易感性。

lncRNA可以通過多種機制參與生物個體的生長發(fā)育、分化和凋亡等生命活動，進而在心血管疾病、胚胎發(fā)生和器官分化等過程中發(fā)揮著不同的重要作用。此外，由于lncRNA的組織特異性表達，使得它們可以作為生物標志物或治療靶點，有效地應用于各類疾病中，具有重要的臨床意義[32]。研究表明RSA患者中主要的感染和免疫途徑發(fā)生變化，而lncRNA被認為是免疫細胞激活和分化的重要調(diào)節(jié)因子，提示lncRNA可能通過免疫途徑參與RSA的發(fā)病機制[33]。此外，Tristetraprolin（TTP）作為一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合蛋白，其能夠結(jié)合下游靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū) （3′-untranslated regions，3′-UTRs）所包含的腺嘌呤-尿嘧啶（AU）重復序列從而誘導靶基因mRNA的降解，但在RSA患者的胎盤滋養(yǎng)層細胞中TTP表達上調(diào)，深入研究發(fā)現(xiàn)在滋養(yǎng)層細胞中過表達TTP 顯著抑制了lncRNA HOTAIR（homologous gene transcriptional antisense RNA，HOTAIR）的表達，揭示了TTP通過調(diào)控lncRNA影響妊娠早期滋養(yǎng)層細胞侵襲的新途徑[34]。

環(huán)狀RNA（circRNA） 是一組近年新發(fā)現(xiàn)的ncRNA，其特征是環(huán)狀共價閉合結(jié)構(gòu)，具有穩(wěn)定性、保守性、豐富性、組織和階段特異性，其功能包括充當miRNA海綿或與內(nèi)源RNA競爭調(diào)節(jié)基因表達，并通過與蛋白質(zhì)相互作用來影響細胞。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病和癌癥在內(nèi)的多種疾病中表現(xiàn)出異常表達，顯示出其在疾病預測、預后和臨床治療方面的巨大潛力[35]。研究者在URSA患者絨毛組織中應用circRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)存在多種異常表達的circRNA，深入研究將有助于闡明circRNA在URSA發(fā)病中的作用機制[36]。

上述研究指出ncRNA的差異表達及調(diào)控異常與RSA的發(fā)生密切相關(guān)。此外，ncRNA的結(jié)構(gòu)異常也可能參與RSA的發(fā)生，并作為潛在的疾病診斷標志物具有重要的臨床應用價值，值得進行更為深入的研究。

4 結(jié)語與展望

RSA的致病因素復雜多樣，表觀遺傳修飾通過精確調(diào)控基因的遺傳和表達，在胚胎著床和生長發(fā)育等各過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在DNA、組蛋白和ncRNA等分子上發(fā)生的各種表觀遺傳修飾通過改變關(guān)鍵基因的表達導致不良妊娠的發(fā)生，一方面明確這些決定妊娠結(jié)局的關(guān)鍵基因，并對適齡女性進行早期篩查，將有助于降低RSA的發(fā)病率；另一方面針對這些關(guān)鍵靶點進行精準和個性化的干預，對治愈RSA具有重要的臨床應用價值。因此，針對遺傳DNA正常的RSA患者進行更為深入的表觀遺傳調(diào)控機制及相關(guān)信號通路的基礎(chǔ)科學研究，不僅有助于進一步闡明RSA的病理生理機制，為RSA的診療提供新的策略，也將促進家庭和睦以及社會穩(wěn)定，具有非常重要的社會意義。