韓凱 劉振國(guó) 胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018）

蜜蜂是典型的社會(huì)群居性昆蟲(chóng)，不但能為我們提供豐富的蜂產(chǎn)品，而且作為一種重要的授粉昆蟲(chóng)，對(duì)整個(gè)世界的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境均具有重要意義。但在過(guò)去幾十年里，隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，一些化學(xué)物質(zhì)的使用對(duì)蜜蜂的腸道微生物造成了不良影響，降低了蜜蜂壽命[1]。益生菌是一類(lèi)在一定劑量具有益生作用的活的微生物總稱(chēng)，已在動(dòng)物養(yǎng)殖領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，具有促進(jìn)宿主營(yíng)養(yǎng)代謝、提高宿主健康水平并改善宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)的功能[2]。本文闡述了益生菌在改善蜜蜂腸道健康、促進(jìn)蜜蜂營(yíng)養(yǎng)吸收、提高蜜蜂免疫力方面的作用，對(duì)益生菌在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行介紹，并對(duì)益生菌的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 益生菌在畜牧業(yè)上的應(yīng)用

1954年，Vergin 在他的文章“Anti-und Probiotika”中首先用到“probiotic”（益生菌）一詞，并在書(shū)中介紹了幾種有使用價(jià)值的細(xì)菌。到了1965年，Lilly 和Stillwell 將可以為其他微生物提供生長(zhǎng)因子的有益微生物稱(chēng)為益生菌[3]。進(jìn)入現(xiàn)代，隨著對(duì)益生菌研究的深入，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）將益生菌定義為在一定合適的劑量下可以給宿主帶來(lái)益處的活的微生物菌類(lèi)[4]。

益生菌在畜牧業(yè)上的使用已經(jīng)較為廣泛。在奶牛的飼料中添加益生菌可以提高奶牛的產(chǎn)奶量，并改善瘤胃內(nèi)微生物菌落結(jié)構(gòu)[5]；益生菌還可以提高家禽的生產(chǎn)性能，增強(qiáng)家禽腸道屏障功能，改善家禽的健康狀態(tài)[6]；除此之外，科學(xué)使用益生菌還可以提高仔豬的免疫力，促進(jìn)腸道菌群平衡和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而降低仔豬的死亡率[7]。正是益生菌在其他動(dòng)物上的廣泛應(yīng)用，其在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中也受到越來(lái)越多的關(guān)注。

2 蜜蜂的腸道菌群

2.1 蜜蜂腸道菌群的組成

蜜蜂的腸道菌落大部分集中在后腸，豐度低且特異性高。16s DNA 基因測(cè)序結(jié)果顯示，成年工蜂的體內(nèi)共有9 大類(lèi)，涉及5 個(gè)綱：分別是Gamma-1(Gilliamella apicola)，Bata(Snodgrsella alvi)，F(xiàn)irm-4，F(xiàn)irm-5，Bifidobacterium，Alpha-2.1(Bartonella apis)，Alpha-2.2(Parasaccharibacter apium)，Apibacter adventoris，Gamma-2(Frischella perrara)[8]。不同的細(xì)菌在腸道內(nèi)定植的地點(diǎn)不同，比如在回腸中主要定植的是S.alvi和G.apicola，而在直腸主要定植的是Firm-4、Firm-5 和Bif idobacteriu[9]。

相比于后腸，僅有少量細(xì)菌存在于蜜囊中。Vasquez 等人通過(guò)微生物培養(yǎng)的方式，發(fā)現(xiàn)蜜囊中主要的微生物菌群是由乳酸菌屬（Lactobacillus）和雙歧桿菌屬（Bif idobacteriu）構(gòu)成[10]。2014年Corby-Harris 進(jìn)一步對(duì)蜜囊中的微生物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除乳桿菌屬外，還存在醋桿菌科（Acetobacteraceae）和少量來(lái)自環(huán)境中的腸桿菌科細(xì)菌（Enterobacteriaceae）[11]。蜜囊中的微生物菌群還會(huì)隨著外界蜜粉源以及蜜蜂健康狀況的變化而變化[12]。

2.2 蜜蜂腸道菌群的功能

對(duì)蜜蜂核心菌G.apicola、Lactobacillus和Bifidobacterium的基因組和代謝研究表明，它們具有消化和代謝多種碳水化合物的能力[13]。在相同飼養(yǎng)條件下，正常工蜂在腸道大小、體重增加、胰島素和卵黃原蛋白信號(hào)的表達(dá)以及對(duì)蔗糖的敏感性上要強(qiáng)于無(wú)菌蜂[14]。有些核心菌含有多種碳水化合物的代謝基因，而相同細(xì)菌不同菌株也具有不同的碳水化合物的代謝能力。除此之外，腸道菌群還能對(duì)中腸無(wú)法消化的花粉進(jìn)行代謝。Engel 等通過(guò)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)G.apicola可以代謝花粉當(dāng)中的果膠[15]；Kesnerova 等通過(guò)比較腸道內(nèi)容物種類(lèi)，發(fā)現(xiàn)正常工蜂體內(nèi)的發(fā)酵物和類(lèi)花生酸的含量增加，而無(wú)菌蜂體內(nèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)和花粉壁組成物質(zhì)的含量上升，進(jìn)一步證實(shí)了腸道菌群可以消化花粉[16]。

蜜蜂的腸道菌群除了參與宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝以外，在維持宿主健康上也有重要作用。F.perrara是一種定植在中腸和回腸之間靠近幽門(mén)區(qū)域的特殊細(xì)菌，它可以使蜜蜂腸道上皮產(chǎn)生一種黑色類(lèi)似“結(jié)痂”的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生可能是刺激包括黑化反應(yīng)在內(nèi)的免疫途徑的結(jié)果[17]。腸道微生物可以提高蜜蜂免疫力的一個(gè)重要原因是可以刺激蜂體免疫系統(tǒng)的表達(dá)。當(dāng)蜜蜂幼蟲(chóng)暴露在有病原菌的環(huán)境中時(shí)，幼蟲(chóng)體內(nèi)的抗菌肽表達(dá)水平明顯提高[18]；Evans 等發(fā)現(xiàn)如果蜂群中工蜂體內(nèi)抗菌肽Abaecin的表達(dá)提高，那么蜂群的幼蟲(chóng)芽桿菌（Paenibacillus larvae）的發(fā)病率就會(huì)降低；而維持腸道微生物的穩(wěn)定對(duì)AMPs 正常表達(dá)具有重要作用[19]。

2.3 益生菌在蜜蜂體內(nèi)的作用機(jī)制

益生菌對(duì)蜜蜂的益生作用，可能與其產(chǎn)生的抗菌化合物有關(guān)。比如乳酸菌可以產(chǎn)生乳酸和乙酸，這些有機(jī)酸可以增加蜜蜂消化道的酸度，創(chuàng)造不利于病原微生物生長(zhǎng)的內(nèi)部環(huán)境，從而使蜜蜂防御力增強(qiáng)[20]。除了有機(jī)酸，過(guò)氧化氫、二乙酰苯甲酸酯和細(xì)菌素等，都有可能在蜜蜂體內(nèi)發(fā)揮積極作用。

益生菌還會(huì)激活蜜蜂抗菌肽基因的表達(dá)，從而提高蜜蜂的免疫力?？咕拇蟛糠质菐д娀蛘呤怯H水親脂性的多肽，可以和細(xì)菌細(xì)胞膜上帶電的脂多糖相結(jié)合改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)菌的死亡[21]。所以蜜蜂體內(nèi)抗菌肽含量的上升可以使蜜蜂對(duì)細(xì)菌的防御力上升。益生菌激活抗菌肽基因的表達(dá)可能與介導(dǎo)Jak/STAT、TOLL、IMD 通路等免疫通路有關(guān)[22]。

3 益生菌在養(yǎng)蜂業(yè)中的應(yīng)用種類(lèi)

3.1 乳酸菌屬

乳酸菌屬是蜂群環(huán)境中最常見(jiàn)的細(xì)菌屬，占蜂蜜細(xì)菌總數(shù)的90%～99%，花粉的74%～76%，蜂糧的83%～89%，蜂王漿的93%，以及整個(gè)蜜蜂腸道的30%～33%。蜜蜂體內(nèi)的乳酸菌主要定植在直腸中，共有14 種；少量存在于蜜囊中，但也有12 種之多[13]。乳酸菌作為一種常見(jiàn)的益生菌常用于蜜蜂生產(chǎn)中。

Audisio 等在飼喂蜂群的蔗糖溶液中添加L.JohnsoniiCRL1647 會(huì)使蜂群內(nèi)的群勢(shì)、封蓋子量以及蜂蜜產(chǎn)量增加[23]；而由L.kunkeeiDan39、L.johnsoniiDan92 等組成的復(fù)合微生態(tài)制劑可以使蜜蜂腸道內(nèi)雙歧桿菌屬和醋酸桿菌屬的數(shù)量增加，乳酸菌屬的數(shù)量減少[24]；L.reuteriLP4 可以改善中華蜜蜂的腸道菌群結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)腸道免疫功能，提高工蜂的存活率[25]。除此之外，乳酸菌更多是用來(lái)抵御病原菌的入侵。L.Biut2和L.Hma11 以及L.brevis和L.plantarum的組合，通過(guò)體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)都對(duì)幼蟲(chóng)芽孢桿菌（Paenibacillus larvae）具 有 抑 制 作 用[20]；Endo 和Salminen 發(fā) 現(xiàn)L.kunkeeiFF30-6 可以在體外抑制蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus plutonius）的生長(zhǎng)[26]；而L.salivariusA3iob 還會(huì)減少蜂群中蜂螨和微孢子蟲(chóng)（Nosemaspp）的寄生[27]。

3.2 芽孢桿菌屬

除乳酸菌屬外，芽孢桿菌屬是另一類(lèi)可以用到蜜蜂養(yǎng)殖過(guò)程中的益生菌。芽孢桿菌可以生活在不同的環(huán)境中，現(xiàn)已證實(shí)芽孢桿菌與蜂巢內(nèi)花粉的發(fā)酵、蜂產(chǎn)品的存儲(chǔ)以及增強(qiáng)蜂群疾病防御能力有關(guān)[28]。

Sabate 等用含有B.subtilisMori2 的蔗糖溶液連續(xù)飼喂蜂群8 個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)飼喂益生菌的蜂群內(nèi)蜂王產(chǎn)卵能力和群勢(shì)都有明顯增加，并降低了蜂群的蜂螨發(fā)病率[29]。除了能提高蜂群生產(chǎn)性能以外，芽孢桿菌還可以用來(lái)抵御病原菌。B.subtilis和B.cereus的組合在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下被證實(shí)可以抑制幼蟲(chóng)芽孢桿菌的活性[30]，B.subtilisAcja3 可以降低蜂房蜜蜂球菌的活性[31]。Alippi 等人還證實(shí)了從蜂群當(dāng)中分離出B.megaterium和B.licheniformis具有抑制美洲腐臭病發(fā)生的作用，并進(jìn)一步驗(yàn)證了B.cereus可以對(duì)幼蟲(chóng)芽孢桿菌產(chǎn)生抑制作用[32]。

3.3 其他益生菌種類(lèi)

除了單獨(dú)使用乳酸菌和芽孢桿菌以外，人們還使用商業(yè)性復(fù)合益生菌制劑飼喂蜜蜂。在國(guó)外，蜜蜂飼喂益生菌制劑Enterobiotics 之后，蠟腺分泌細(xì)胞的發(fā)育增強(qiáng)[33]；在實(shí)驗(yàn)室條件下，益生菌制劑Biogen-N 還可以增加蜂體干物質(zhì)重以及粗脂肪含量，并降低蜜蜂死亡率[34]；除此之外，益生菌制劑EM?可以降低微孢子蟲(chóng)在蜜蜂體內(nèi)的寄生，延長(zhǎng)蜜蜂壽命[35]。在我國(guó)，有學(xué)者將EM?微生物混合制劑用到蜜蜂的生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)可以提高蜂群群勢(shì)，并增加工蜂中腸圍食膜的厚度[36]。但并不是所有的益生菌都對(duì)蜜蜂有益。據(jù)報(bào)道，將鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）飼喂給蜜蜂并不能抑制微孢子蟲(chóng)的繁殖，而且還能破壞蜜蜂的免疫系統(tǒng)、增加蜜蜂死亡率[37]，所以蜜蜂養(yǎng)殖選擇合適的益生菌至關(guān)重要。

4 益生菌在養(yǎng)蜂業(yè)中應(yīng)用前景展望

總體來(lái)說(shuō)，益生菌更多是用來(lái)研究如何增強(qiáng)蜜蜂抵御病原菌的能力，而在實(shí)際生產(chǎn)上的應(yīng)用相對(duì)較少。在益生菌的使用過(guò)程中，使用劑量從105CFU/ml 到107CFU/ml 不等，且飼喂間隔以及持續(xù)時(shí)間也不盡相同，這些益生菌飼喂當(dāng)中的不確定性都制約了其在蜂群上的應(yīng)用。另一個(gè)影響益生菌應(yīng)用的問(wèn)題是益生菌種類(lèi)的選擇。由于天然蜂蜜中含有殺菌物質(zhì)使微生物難以生長(zhǎng)[38]，所以需要選擇能在蜂箱內(nèi)長(zhǎng)期生存的益生菌，例如可以產(chǎn)生芽孢的菌類(lèi)，但這些益生菌又有可能會(huì)對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生威脅。所以如何選擇正確的益生菌就成了一個(gè)關(guān)鍵性的問(wèn)題。

隨著蜜蜂養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的大量使用，人們對(duì)蜂產(chǎn)品當(dāng)中的抗生素殘留問(wèn)題越來(lái)越重視。為了解決此問(wèn)題，人們積極的選擇抗生素的替代者，而益生菌就是其中之一，但現(xiàn)在能應(yīng)用于蜜蜂生產(chǎn)的益生菌種類(lèi)以及使用方法還不是很明確。根據(jù)蜜蜂生理特點(diǎn)、生物學(xué)特性以及蜜蜂營(yíng)養(yǎng)需要，在國(guó)內(nèi)外試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)實(shí)際益生菌的應(yīng)用效果，篩選出能用于蜜蜂生產(chǎn)的益生菌種類(lèi)就顯得十分重要。