董曉沛綜述，康小紅審校

0 引 言

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)是真核信使RNA(messenger RNA，mRNA)中最常見的內部轉錄修飾，m6A修飾最早于20世紀70年代被發(fā)現(xiàn)，因技術瓶頸，該領域的發(fā)展非常緩慢，2011年，肥胖相關蛋白(fat-mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO)被報道具有m6A去甲基化酶功能，并證明m6A修飾是動態(tài)可逆的，該領域才得以復興[1]。迄今為止，科學家們總結了m6A的相關修飾是由甲基轉移酶復合體(METTL3、METTL14和WTAP組成)、去甲基酶(FTO和ALKBH5)以及相應的閱讀器(YTHDF1/2/3，YTHDC1)協(xié)同調控，并將其依次歸類為“書寫者(writers)”，“擦除者(erasers)”和 “閱讀者(readers)”。m6A修飾幾乎參與mRNA所有的代謝過程，如成熟、轉運、剪接、翻譯和降解等[2]。近年來大量研究證實m6A RNA甲基化在哺乳動物中具有重要的生物學功能，如組織發(fā)育、晝夜節(jié)律、DNA損傷反應、性別鑒定和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等[2]。本文主要就m6A在腫瘤進展中的潛在作用作一綜述。

1 m6A mRNA甲基化概述

m6A修飾是指在腺甘酸的N6位置上添加一個甲基基團，是進化上保守的RNA修飾。研究發(fā)現(xiàn)在mRNA中約有0.1%-0.4%的腺苷酸受到m6A修飾，平均每個轉錄本有2-3個m6A修飾位點，m6A主要發(fā)生在RRACH序列中(其中R=A或G，H=A，C，或U)，在終止密碼子、3′非翻譯區(qū)(3′ultranslated region，3′UTR)、和內部長外顯子聚集[3]，從而影響RNA轉錄，加工，翻譯和代謝。m6A修飾受到m6A調節(jié)酶的控制，其中甲基轉移酶作為m6A“書寫者”積極催化這種修飾，而具有脫甲基酶活性的m6A“擦除者”可消除m6A修飾，m6A“閱讀者”識別修飾的殘基并傳達信息，從而建立高效且有序的m6A調節(jié)網(wǎng)絡。

甲基轉移酶復合物主要由甲基轉移酶樣蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、METTL14和腎母細胞瘤1-相關蛋白(Wilm＇s tumor 1-associated protein，WTAP)組成，協(xié)同調控m6A的分布，METTL3為核心組分，METTL14與METTL3結合為穩(wěn)定的異二聚體，并通過協(xié)同效應催化m6A RNA甲基化，WTAP將METTL3- METTL14復合物錨定在靶RNA上，并促進其在核斑點中的積累，由于WTAP不存在甲基轉移酶活性，因此該調控亞基在功能性m6A甲基化復合物的前提下發(fā)生作用[4]。KIAA1429和RBM15已被確定為M6A“writer”復合體的新組成部分，RBM15有助于將復合物招募到目標位點。KIAA1429的分子功能尚不清楚[5]。METTL16是新定義的靶向U6小核RNA(U6 snRNA)的m6A分子，通過在蛋氨酸饑餓時誘導S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表達來調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的穩(wěn)態(tài)[6]。

m6A去甲基化酶包括FTO和Alk B同源物5(Alk B homolog 5，ALKBH5)。FTO最初被證明可調節(jié)能量穩(wěn)態(tài)，并且與肥胖風險呈正相關[7]。ALKBH5是FTO的同系物，均屬于Fe(II)和α- 酮戊二酸依賴性AlkB加氧酶家族。在m6A調節(jié)網(wǎng)絡中，F(xiàn)TO和ALKBH5將m6A修飾的核RNA識別為底物，并催化m6A甲基修飾的去除[8]。

m6A閱讀蛋白可分為三大類：①包含一個進化保守的YTH(YT521-B同源性)結構域的蛋白，該結構域折疊成可直接與m6A結合的疏水芳香結構，人類基因組含有5種YTH結構域蛋白，分別為YTHDFs亞型中的讀取基因(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3)和YTHDCs亞型中的讀取基因(YTHDC1、YTHDC2)，對m6A甲基化mRNA的親和力是未甲基化mRNA的10-50倍[9]。YTHDFs亞型的蛋白主要在細胞質中分布。②包括三種核內不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNPs)，hnRNPC、hnRNPG和hnRNPA2B1，“m6A開關”現(xiàn)象即m6A削弱Watson-Crick堿基對，破壞RNA發(fā)夾結構，從而暴露了單鏈hnRNP結合基序，這些蛋白通過m6A開關選擇性地與含有m6A的轉錄本結合[10]，影響mRNA定位和選擇性剪接。③胰島素樣生長因子2mRNA結合蛋白1-3(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins 1-3，IGF2BP1-3)通過K同源域識別GG(m6A)C序列，在正常和應激條件下以m6A依賴的方式增強其靶mRNA的穩(wěn)定性和翻譯[11]。

2 m6A在腫瘤中的作用

2.1 m6A甲基轉移酶與腫瘤

2.1.1 METTL3METTL3是RNA N6 -腺苷主要的甲基轉移酶，在轉錄后水平調節(jié)癌基因和抑癌基因的表達，包括mRNA的穩(wěn)定性和翻譯過程。在膠質母細胞瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)中，Cui等[12]通過敲低METTL3來阻礙m6A的富集，造成GSCs的生長增強、自我更新和腫瘤的進展。相反，METTL3在人膠質母細胞瘤組織中表達上調，通過與3′UTR中的SOX2 mRNA結合，誘導m6A修飾，沉默METTL3可抑制SOX2的表達，增強腫瘤細胞對γ輻射的體外敏感性，抑制小鼠膠質母細胞瘤腫瘤生長，從而發(fā)揮致癌作用[13]。以上爭議的原因可能與m6A標記不同的靶mRNA，癌癥干細胞的遺傳和非遺傳異質性有關。此外，研究表明METTL3在人肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[14]、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)[15]和多發(fā)性實體瘤中均顯著上調，METTL3過表達與患者預后不良有關，敲低或敲除METTL3可顯著減少癌細胞的增殖和遷移，通過多種機制影響 m6A 修飾發(fā)揮促癌作用。在胰腺癌細胞中，METTL3的敲低對細胞增殖無影響，但會提高細胞對吉西他濱，5-氟尿嘧啶，順鉑和放射線等抗癌藥物的敏感性[16]。在膀胱癌中，METTL3通過識別DGCR8(Di George cirtical region 8)來加速pri-miR221 /222的加工，成熟的miR221 /222抑制了抑癌基因PTEN的表達，并促進腫瘤生長[17]；在皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)中，上調METTL3促進了Np63的表達，從而促進CSCC細胞的增殖和腫瘤的生長[18]。

2.1.2METTL14METTL14作為癌基因或抑癌基因在特定腫瘤中發(fā)揮著不同的作用，為與m6A修飾甲基轉移酶相關腫瘤藥物的研發(fā)提供了思路。①抑癌作用，與膠質母細胞瘤中 METTL3一樣，METTL14敲低后促進了惡性表型，表現(xiàn)為癌基因(如ADAM19)表達的上調和抑癌基因(如 CDKN2A)表達的下調[12]。同時，子宮內膜癌中METTL14功能的缺失突變會減弱m6A的甲基化，通過激活AKT通路增強子宮內膜癌的細胞增殖和致瘤性[19]。在肝癌組織中m6A修飾被抑制，而METTL14下調提示無復發(fā)生存差， METTL14以m6A依賴性方式正向調節(jié)pri-miRNA126，抑制癌轉移[20]。這一結果與Chen等[14]在原發(fā)性肝癌組織中發(fā)現(xiàn)的m6A顯著升高、METTL3過表達后通過m6A-YTHDF2依賴性SOCS2 mRNA降解而促進肝癌發(fā)生的結論相反。而爭議可能歸因于復雜因素，包括用于分類mRNA轉錄物的不同閱讀器蛋白質，以及不同的腫瘤樣本和m6A檢測方法。②致癌作用，在造血干細胞和AML細胞中，METTL14過表達后發(fā)揮致癌作用，其機制是通過m6A修飾對MYB和MYC mRNA的穩(wěn)定性和翻譯的積極調控[21]。這一結果與AML中METTL3的影響部分重疊，可用IGF2BPs介導的替代閱讀過程來解釋。

2.1.3WTAP在肝癌[22]癌組織中，WTAP過表達，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。但是，WTAP對細胞增殖的調控具有細胞類型特異性。在AML中，WTAP支持腫瘤生長，但阻止白血病細胞分化[23]。當WTAP耗竭后，采用依托泊苷治療可使急性髓性白血病干細胞凋亡程度明顯增加[23]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌中，碳酸酐酶IV通過靶向WTAP- WT1- TBL1軸抑制Wnt信號通路[24]。綜上，WTAP在癌癥的治療中可起到重要的作用，但對其分子機制的了解并不深入，需要進一步研究。

2.1.4METTL16METTL16是新定義的m6A的“書寫者”，關于其在腫瘤中的作用機制研究相對較少。最近Liu等[25]使用TCGA、GEO和HPA數(shù)據(jù)庫以及組織芯片(TMA)隊列驗證了METTL16在結腸腺癌中高表達，且METTL16表達與患者預后密切相關，但其分子機制并不清楚。

2.1.5KIAA1429在乳腺癌組織中，KIAA1429通過m6A獨立的方式調節(jié)細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)，促進癌細胞的增殖和轉移，而5′-氟尿嘧啶對降低乳腺癌KIAA1429和CDK1的表達非常有效[26]。Cheng等[27]研究發(fā)現(xiàn)KIAA1429在肝癌細胞過表達并促進癌細胞的侵襲，KIAA1429的下調抑制了DNA 結合抑制因子2 mRNA的m6A修飾。以上研究均證實了KIAA1429在腫瘤中的致癌作用，并發(fā)現(xiàn)了KIAA1429的有效抑制劑，說明KIAA1429可能是一種有前途的腫瘤治療靶向因子。

2.2m6A去甲基化酶與腫瘤

2.2.1 FTOFTO作為第一個被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和化療耐藥中起著重要作用。Li等[28]發(fā)現(xiàn)FTO在AML中高表達，并促進腫瘤細胞的增殖，F(xiàn)TO通過抑制一組關鍵轉錄本(如ASB2和RARA)的表達來發(fā)揮其致癌作用，從而抑制全反式維甲酸誘導的t(15；17)AML細胞向粒細胞分化。因此，利用靶向的FTO信號抑制因子結合全反式維甲酸治療白血病可能成為一種有效的治療策略。FTO是R-2-羥基戊二酸鹽(R-2HG)的直接靶點，Su等[29]發(fā)現(xiàn)R-2HG通過抑制FTO而促進m6A在MYC和CEBPA轉錄本上的積累，降低其mRNA的穩(wěn)定和表達，抑制AML進展。同時，R-2HG與地西他濱、柔紅霉素等一線化療藥物也有協(xié)同作用，并在小鼠模型中得到驗證。Cui等[12]研究表明，F(xiàn)TO在膠質母細胞瘤中具有促癌作用，其抑制劑MA2是甲氯滅酸(MA)的乙酯形式，可增加GSCs中的mRNA m6A修飾水平，抑制GSC的生長。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO促進黑素瘤的致瘤性和抗程序性死亡受體1(anti-PD-1)阻斷的反應。FTO敲低增加了致癌基因(包括PD-1，CXC趨化因子基序受體4和SOX10)的m6A甲基化，導致通過閱讀器YTHDF2引起的RNA衰減增加。FTO敲低亦可降低黑色素瘤對γ干擾素的敏感性，進而對小鼠的抗PD-1治療產生敏感性[30]。以上均說明了FTO的致癌作用，然而作為抑癌因素，F(xiàn)TO的蛋白水平在肝內膽管癌中下調并降低細胞凋亡，對順鉑治療產生耐藥性[31]。在透明細胞腎癌中，F(xiàn)TO的mRNA水平降低與腎切除術后總生存率降低有關[32]。

綜上所述，F(xiàn)TO在腫瘤中發(fā)揮雙向調節(jié)作用。FTO抑制劑(大黃酸、2OG類似物、恩他卡朋、FB23-2、MA2、R-2HG)的發(fā)現(xiàn)預示了FTO可能成為腫瘤治療和藥物開發(fā)的潛在分子靶點，但其抑制劑在人體內的藥物作用還需要被深入證實。

2.2.2ALKBH5與BRCA突變的上皮性卵巢癌中的FTO相似，ALKBH5的表達也受到抑制，通過穩(wěn)定FZD10 mRNA激活Wnt /β-catenin途徑，使細胞對奧拉帕尼(Olaparib)產生抗性[24]。ALKBH2為ALKBH蛋白質家族中的一個亞型，用其構建的RNAi慢病毒載體為進一步研究ALKBH2沉默后相關的泌尿系腫瘤生物學功能的影響提供穩(wěn)定、高效、可靠的技術平臺[33]。ALKBH5發(fā)揮致癌作用，在膠質母細胞瘤干細胞中[34]，ALKBH5高表達，通過調節(jié)癌癥干細胞功能，促進癌細胞的增殖和轉移。新近研究發(fā)現(xiàn)，ALKBH5可特異性的促進AML的進展以及白血病干細胞的自我更新，而對正常造血及血液細胞的自我更新影響很小[35]。在胰腺癌中，ALKBH5則發(fā)揮抑癌作用，ALKBH5造成lncRNA KCNK15-AS1脫甲基化，從而抑制胰腺癌細胞的轉移[36]。

2.3m6A結合蛋白與腫瘤

2.3.1 YTHDF1在人結腸癌組織中，c-Myc癌蛋白可促進YTHDF1基因表達，誘導癌細胞增殖并對氟尿嘧啶和奧沙利鉑產生耐藥性[37]。YTHDF1可識別溶酶體蛋白酶m6A標記的轉錄本，并促進抗原的降解，被吞噬的新抗原的交叉呈遞和CD8+T細胞的交叉表達被抑制，從而導致免疫逃逸和腫瘤的不完全消除[38]。在眼黑色素瘤中，YTHDF1促進了含有m6A的HINT2 mRNA(一種腫瘤抑制劑)的翻譯[39]。在NSCLC中，常氧條件下，YTHDF1的耗竭會導致m6A標記的轉錄物翻譯效率降低，抑制腫瘤的生長并導致癌細胞對順鉑耐藥；在化療應激條件下，YTHDF1 耗竭會導致 m6A修飾的Keap1的翻譯減少，從而上調Nrf2和AKR1C1(活性氧的清除系統(tǒng))[40]。這些相反的結果突出了在正常和應激狀態(tài)下實現(xiàn)YTHDF1表達及其目標穩(wěn)態(tài)的重要性。

2.3.2YTHDF2在HCC中，YTHDF2減少可引起炎癥和血管重建，促進腫瘤的進展。此外，應用靶向HIF-2α并恢復YTHDF2表達的小分子抑制劑PT2385，可提高體內外治療HCC細胞的效果[41]。Chen等[42]發(fā)現(xiàn)在胰腺癌臨床樣本中，YTHDF2表達上調，YTHDF2通過破壞酵母相關蛋白mRNA的穩(wěn)定，促進胰腺癌細胞系的增殖并抑制其遷移和侵襲，這一現(xiàn)象被稱為胰腺癌細胞中上皮-間質轉化的“遷移-增殖二分法”。在前列腺癌中，miR-493-3p誘導YTHDF2表達下調，促進細胞的增殖和遷移[43]。Paris等[44]報道YTHDF2縮短了m6A修飾的TNF受體2(TNFR2)mRNA的半衰期，而后者通常阻止白血病細胞的積聚，從而促進AML的擴散。以YTHDF2為靶點不僅能根除白血病干細胞，還能擴增造血干細胞以增強骨髓重建。因此，YTHDF2抑制劑在AML中的治療前景將非常可觀。

2.3.3YTHDF3LncRNA GAS5增強YAP磷酸化、泛素化和降解，削弱YAP信號，抑制結直腸癌細胞增殖和轉移，而YTHDF3識別m6A修飾的GAS5并誘導其衰變[45]。不同睪丸生殖細胞瘤(testicular germ cell tumors，TGCT)亞型間m6A豐度和VIRMA/YTHDF3表達存在差異，在精原細胞瘤中，YTHDF3和VIRMA的表達均上調，它們之間存在正相關[46]。這一發(fā)現(xiàn)為鑒別TGCT亞型提供了新思路。

2.3.4YTHDCs結合蛋白(YTHDC1、YTHDC2)與腫瘤關系的研究非常少，最近幾年進展緩慢。YTHDC1 的異常表達可調節(jié)癌組織選擇性剪接[47]。在結腸癌組織中，YTHDC2 的表達與腫瘤的分期呈正相關[48]。YTHDC2通過解開編碼轉錄因子HIF-1α和Twist1的mRNA的5′-UTR而促進兩者的翻譯，HIF-1α通過Twist1促進上皮-間質轉化，誘導腫瘤轉移。

2.3.5IGF2BPIGF2BPs在正常和應激條件下均可增強 mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，這會導致MYC等致癌產物的積累，在宮頸癌和肝癌細胞中敲除IGF2BP可抑制細胞的增殖和侵襲[49]。IGF2BP1以m6A依賴性方式破壞卵巢癌和肺癌中miRNA定向的miRNA降解并維持血清反應因子的表達，最終上調致癌驅動因子PDLIM7和FOXK1的表達[50]。在轉移性黑色素瘤中，螯合物1/ SQSTM1 / p62(p62)的表達較高，與患者不良預后相關。p62通過與IGF2BP1相互作用增強FERMT2和其他促轉移因子的穩(wěn)定性[51]。IGF2BP2可介導結直腸癌的肝轉移。在機制上，circNSUN2的m6A修飾被YTHDC1識別，在細胞質中形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2三元復合物，促進HMGA2 mRNA穩(wěn)定性[52]。IGF2BP3具有致癌特征，在胰腺癌中高表達，與患者不良預后有關[53]。

3 結 語

m6A修飾的“書寫者”，“擦除者”和“閱讀者”在調節(jié)RNA代謝、干細胞自我更新、免疫應答和各種癌癥轉移方面都起到重要作用。毫無疑問，m6A甲基化在開發(fā)全新的人類癌癥療法方面具有巨大潛力。但仍然存在許多挑戰(zhàn)。第一：m6A調節(jié)劑在某些癌癥中的機制尚不清楚，尤其是m6A修飾的“閱讀者”相關研究更少；第二：許多研究表明，m6A調節(jié)劑和相關途徑可以用作治療靶標，但是在臨床實踐中由于樣本量大，缺乏特定的應用，而且相應的副作用在很大程度上還不清楚；第三：m6A修飾蛋白具有抑癌或致癌的雙重作用，許多爭議性的研究結果有待進一步探索其具體原因。當然，在下一代測序的時代，輕松生成和分析大數(shù)據(jù)(組學)是可能的，這將進一步擴展和變革癌癥生物學，為解決以上問題提供條件。