孫艷美，王喜艷，吳 迪，王雪楠，潘曉燕

1吉林醫(yī)藥學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，吉林吉林 132013

2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖科，山東濟(jì)寧272029

高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展為研究非編碼RNA提供了極大便利，鑒于非編碼RNA在生殖系統(tǒng)發(fā)育調(diào)控中的重要作用，關(guān)于其調(diào)控機(jī)制的闡明也成為目前的研究熱點(diǎn)，引起了人們極大的關(guān)注[1- 2]。非編碼RNA包括小RNA(microRNAs，miRNAs)、長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNAs，IncRNAs)和環(huán)狀 RNA(circular RANs，circRNAs)3大類，其中以miRNAs的研究最為廣泛[3]。miRNA于1993年被發(fā)現(xiàn)，是一種內(nèi)源性22～24 nt大小的單鏈非編碼RNA[4]。成熟的miRNAs與Argonaute1(AGO1)等其他蛋白質(zhì)一起組成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，miRNA通過其5’端的種子序列與靶 mRNA 3’非編碼區(qū)(3’ UTR)完全或不完全的互補(bǔ)結(jié)合，也可通過識別靶mRNA 的開放閱讀框，將與之結(jié)合的AGO蛋白定位到靶mRNA上，導(dǎo)致靶mRNA 降解、基因沉默或翻譯抑制，從而調(diào)控靶基因表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡[5- 6]。

卵泡發(fā)育是一個高度精確、有序和周期性過程，從原始卵泡激活開始，逐漸激發(fā)周圍健康小卵泡的生長及優(yōu)勢卵泡的選擇，并伴隨著一系列卵母細(xì)胞和周圍體細(xì)胞(尤其是顆粒細(xì)胞)的分化。通過生物信息學(xué)分析，Zhang等[7]在優(yōu)勢卵泡的生長和選擇過程中，篩選出15個參與調(diào)控的miRNAs和139個相關(guān)的信號通路。這些miRNAs和相關(guān)的信號通路調(diào)控卵泡發(fā)育過程中的細(xì)胞增殖、分化、激素合成和卵母細(xì)胞的成熟及排卵等一系列重要事件，影響著卵泡發(fā)育的結(jié)局[8- 9]。本文總結(jié)了miRNAs在卵巢顆粒細(xì)胞增殖與凋亡、卵母細(xì)胞發(fā)育和激素合成等方面的調(diào)控作用，以期為闡明其在生殖發(fā)育機(jī)制和生殖疾病機(jī)理的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

miRNAs在顆粒細(xì)胞發(fā)育中的調(diào)控作用

卵泡發(fā)育過程伴隨著顆粒細(xì)胞的快速增殖和分化，顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育過程中起著重要的營養(yǎng)支持作用，可通過旁分泌以及與卵母細(xì)胞間的縫隙連接，為卵母細(xì)胞輸送營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長和成熟，并通過分泌大量性激素維持卵泡的正常功能。因此，顆粒細(xì)胞的正常發(fā)育是卵泡發(fā)育的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡受多種因素，如生長因子、激素、凋亡蛋白和氧化還原酶類等的調(diào)控[10- 11]，而miRNAs則通過多種途徑調(diào)控這些蛋白和激素等物質(zhì)的合成，進(jìn)而調(diào)控顆粒細(xì)胞的發(fā)育[12]。

生長因子途徑在顆粒細(xì)胞的生長發(fā)育過程中存在著一類重要的生長因子-轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)[13]，研究發(fā)現(xiàn)這類生長因子通路受miR- 10a和miR- 10b調(diào)控[14]。miR- 10家族可調(diào)控TGF-β通路中的許多關(guān)鍵基因，如促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、纖維母細(xì)胞生長因子9(fibroblast growth factor 9，F(xiàn)GF9)、激活素A、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)4和BMP15的表達(dá)，進(jìn)而影響顆粒細(xì)胞的增殖和分化[14]。miR- 125b則通過靶向作用于骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B(bone morphogenetic protein receptor 1B，BMPR1B)mRNA，影響B(tài)MPR1B蛋白的表達(dá)，改變Bcl- 2/Bax比值[15]，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡。Chi-miR- 4110和miR- 424/503靶向作用于TGF-β信號通路中的Smad2和Smad7基因 mRNA，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡[16- 17]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，激活素A的表達(dá)可負(fù)反饋下調(diào)miR- 424/503和miR- 10家族的表達(dá)，協(xié)同調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖[17]。且Smad4也可結(jié)合于miR- 143的啟動子區(qū)，負(fù)反饋下調(diào)miR- 143的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)miR- 143介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖[18]。

激素受體途徑卵泡刺激素受體(follicular stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)在調(diào)控哺乳動物卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。在卵巢卵泡閉鎖過程中，F(xiàn)SHR表達(dá)下調(diào)，敲除FSHR可導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖[19]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。通過研究miRNAs在顆粒細(xì)胞發(fā)育中的作用，發(fā)現(xiàn)FSHR是miR- 143的重要作用靶點(diǎn)，在卵泡閉鎖期間miR- 143的表達(dá)上調(diào)，其通過靶向作用于FSHR，降低了細(xì)胞內(nèi)信號分子，如蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase，AKT)和磷酸化 AKT(phosphorylated AKT，P-AKT)的表達(dá)水平，影響細(xì)胞的代謝活動，加速顆粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)卵泡凋亡[18，20]。miRNAs可通過促性腺激素受體途徑參與調(diào)控顆粒細(xì)胞和卵泡的發(fā)育。

凋亡因子途徑在卵泡發(fā)育的不同階段，會有99%以上的卵泡閉鎖退化。卵泡閉鎖主要是由顆粒細(xì)胞凋亡引起的，許多促凋亡因子參與調(diào)控了這一過程[21- 22]，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1(forkhead box transcription factor O1，F(xiàn)ox O1)是其中一類重要的促凋亡調(diào)控因子[23- 24]。研究發(fā)現(xiàn)miR- 181a可靶向抑制FoxO1的去乙酰化酶沉默信息調(diào)節(jié)因子 1(silent informa-tion regulator 1，SIRT1)的表達(dá)，促進(jìn)FoxO1乙?；?，增強(qiáng)FoxO1表達(dá)，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡。Zhang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，利用過氧化氫處理顆粒細(xì)胞可增加顆粒細(xì)胞中miR- 181a的表達(dá)，并通過FoxO1通路促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡，但如果敲除miR- 181a，則阻止了過氧化氫誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡?？梢?，miRNAs在顆粒細(xì)胞凋亡和卵巢老化過程中起重要的調(diào)控作用。

miRNAs在卵母細(xì)胞發(fā)育中的調(diào)控作用

在卵泡發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞逐漸具備了完成減數(shù)分裂成熟和支持后續(xù)早期胚胎發(fā)育的能力。卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟，受顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。在卵母細(xì)胞發(fā)育的前期，顆粒細(xì)胞快速增殖，為卵母細(xì)胞的生長提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)；但在初級卵母細(xì)胞完成第1次減數(shù)分裂前，卵母細(xì)胞的發(fā)育已經(jīng)完成，顆粒細(xì)胞在激素和促凋亡因子等作用下，發(fā)生凋亡退化，逐漸失去了與卵母細(xì)胞之間的聯(lián)系，此時如果顆粒細(xì)胞凋亡退化異常，將會影響卵母細(xì)胞完成第1次減數(shù)分裂。

近年研究表明，miRNAs表達(dá)于卵泡發(fā)育的不同階段，包括原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡，參與調(diào)控整個卵泡的發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟過程[26]。人們已在卵母細(xì)胞發(fā)育的不同階段發(fā)現(xiàn)了miRNAs表達(dá)模式的差異。Xiong等[27]對GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行了高通量測序，結(jié)果顯示：MⅡ期卵母細(xì)胞中有47個miRNAs表達(dá)上調(diào)，28個miRNAs表達(dá)下調(diào)，在表達(dá)上調(diào)的let- 7i、miR- 10b、miR- 10c、miR- 342、miR- 143、miR- 146b和miR- 148等miRNAs中，miR- 342的表達(dá)水平升高了9.25倍。為進(jìn)一步闡明這些在GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs的調(diào)控作用，Song等[28]研究了7個差異表達(dá)的miRNAs調(diào)控的信號通路和靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR- 21、miR- 27b- 3p、miR- 10a- 5p、miR- 10b- 5p參與了豬卵母細(xì)胞脂肪酸代謝的調(diào)控，miR- 27b- 3p調(diào)控著GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ)的表達(dá)，在卵母細(xì)胞的體外成熟液中添加PPARγ激動劑，可顯著提高卵母細(xì)胞的成熟率和早期胚胎的發(fā)育能力。在卵母細(xì)胞體外成熟過程中，顯微注射miR- 130b前體或抑制劑能降低靶基因SMAD5和MSK1的表達(dá)，顯著降低第一極體的排出和卵母細(xì)胞進(jìn)入第二次減數(shù)分裂中期的比例[29]；相反miR- 130b的過表達(dá)則可明顯增加顆粒細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制卵母細(xì)胞成熟[29]。miR- 378則在卵泡發(fā)育的早期通過降低BMP15和GDF9的表達(dá)，減弱卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的相互作用，從而降低卵母細(xì)胞成熟率[30]。因此，在卵母細(xì)胞發(fā)育的不同階段，會受到不同類型miRNAs的精確調(diào)控，miRNAs的調(diào)控異常將直接影響卵母細(xì)胞成熟和卵巢功能。

近期人們在動物和人類卵泡液中檢測到一類重要物質(zhì)-外泌體miRNAs(extracellular vesicle containing miRNA，EV-miRNAs)[31]，該物質(zhì)會通過細(xì)胞和細(xì)胞之間的傳遞，完成細(xì)胞間的交流[32]。da Silveira等[33]將含有miRNAs的外泌體添加到卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液和早期胚胎的培養(yǎng)液中，顯著提高了胚胎細(xì)胞中bta-miR- 631的表達(dá)水平，改變了胚胎中DNA的甲基化和羥甲基化水平，產(chǎn)生了不同的囊胚發(fā)育率。EV-miRNAs參與調(diào)控了卵母細(xì)胞的成熟和支持后續(xù)胚胎發(fā)育能力的獲得。在卵母細(xì)胞成熟過程中，卵泡液中miRNAs的表達(dá)隨著雌性年齡和卵泡發(fā)育階段的變化而變化。da Silveira等[34]在青年馬(3～10歲)不同發(fā)育階段的卵泡液中發(fā)現(xiàn)了26個miRNAs的差異表達(dá)，而在老年馬(20～26歲)不同發(fā)育階段的卵泡液中發(fā)現(xiàn)了55個miRNAs的差異表達(dá)，這些差異表達(dá)的miRNAs包括miR- 23a、miR- 222、miR- 24、miR- 132、miR- 320、miR- 520c- 3p 、miR- 222和miR- 181a等，它們參與調(diào)控著卵泡雌激素合成、FSH循環(huán)水平、TGF-β信號通路、WNT信號通路和排卵等過程，這些過程與卵母細(xì)胞的發(fā)育、卵巢的老化和衰老密切相關(guān)。Diez-Fraile等[35]比較了年輕女性(<31歲)和中老年女性(>38歲)卵泡液中EV-miRNAs的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR- 21- 5p僅在年輕女性的卵泡液中分離到，可靶向作用于TGF-β信號通路；而miR- 134、miR- 190b和miR- 99b- 3p僅在中老年女性卵泡液中發(fā)現(xiàn)，可能與低質(zhì)量的卵母細(xì)胞密切相關(guān)。雖然EV-miRNAs的表達(dá)類型和水平在馬和人都存在物種的差異，但它們都參與了調(diào)控卵泡發(fā)育的重要活動和重要信號通路，在卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟中發(fā)揮了重要作用。

此外研究發(fā)現(xiàn)，EV-miRNAs與M Ⅱ期卵母細(xì)胞的質(zhì)量密切相關(guān)，其表達(dá)變化影響著體外受精的結(jié)果[36]。Martinez等[37]收集了126名進(jìn)行體外受精女性的卵泡液，分析了卵泡液中EV-miRNAs的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常受精組的卵母細(xì)胞相比，未受精卵母細(xì)胞的卵泡液樣本中Hsa-miR- 92a和Hsa-miR- 130b的表達(dá)顯著升高；卵泡液中Hsa-miR- 888的過度表達(dá)，以及Hsa-miR- 214和Hsa-miR- 454的表達(dá)下降與D3的胚胎質(zhì)量密切相關(guān)。對含有成熟卵母細(xì)胞的單個卵泡的卵泡液進(jìn)行樣本分析發(fā)現(xiàn)，miR- 663B在人卵泡液中的表達(dá)水平與活囊胚的形成率呈顯著負(fù)相關(guān)[38]。通過胞漿內(nèi)單精子顯微注射研究發(fā)現(xiàn)，來自高水平Hsa-miR- 320a和Hsa-miR- 197卵泡液的卵母細(xì)胞可獲得高質(zhì)量發(fā)育的胚胎[39]。卵泡液中miRNAs的類型和表達(dá)水平在一定程度上與卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量有關(guān)，而卵母細(xì)胞的發(fā)育質(zhì)量直接決定后期胚胎的發(fā)育狀況。如果miRNAs能成為體外受精后胚胎發(fā)育潛能的客觀評價指標(biāo)，將大大提高輔助生殖技術(shù)的成功率，減少多胎的發(fā)生率。

miRNAs對卵泡合成和分泌性激素的調(diào)控作用

在卵泡發(fā)育成熟過程中分泌多種激素，包括雌激素、孕激素和少量雄激素，這些激素調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖與分化、卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟及排卵[40- 41]。研究發(fā)現(xiàn)，這些激素的合成受miRNAs調(diào)控，miR- 320a可靶向作用于轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的3’UTR，通過調(diào)節(jié)CYP11A1和CYP19A1的表達(dá)，增強(qiáng)顆粒細(xì)胞中類固醇激素的合成[42]。雌激素的合成受FSH和促黃體生成激素(luteinizing hormone，LH)的調(diào)控，在顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞上分別有FSH受體(FSH receptor，F(xiàn)SHR)和LH受體(LH receptor，LHR)的表達(dá)。LHR mRNA的穩(wěn)態(tài)水平是通過LHR mRNA 結(jié)合蛋白(LHR mRNA binding protein，LRBP)控制其降解速度來維持的。Menon等[43]研究顯示，miR- 122調(diào)控LRBP的表達(dá)，間接決定了細(xì)胞中LHR mRNA的水平。在排卵前，為應(yīng)對LH峰的出現(xiàn)，LHR mRNA表達(dá)會隨著miR- 122和LRBP水平的降低而降低。miRNAs根據(jù)卵泡發(fā)育的需要，精確地調(diào)控卵巢激素的合成和分泌。

卵泡對雌激素的合成也受促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)信號通路的調(diào)控，Yu等[44]發(fā)現(xiàn)該調(diào)控通路需要miR- 375的介入，CRH通過激活胞內(nèi)PKA-p38 MAPK信號通路，促進(jìn)miR- 375表達(dá)，miR- 375結(jié)合到特異性蛋白1(specificity protein1，SP1)mRNA的 3’UTR 區(qū)，抑制SP1蛋白的表達(dá)，下調(diào)了Cyp19a1轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制了顆粒細(xì)胞中E2的合成。Wang等[45]發(fā)現(xiàn)，miR- 764- 3p可通過影響類固醇生成因子- 1(steroidogenic factor- 1，SF- 1)mRNA的穩(wěn)定性，抑制SF- 1的表達(dá)，進(jìn)而抑制了SF- 1下游的靶基因Cyp19a1的表達(dá)，影響E2的合成。Dai等[46]研究顯示，miR- 133b是通過結(jié)合到Foxl2 mRNA的3’UTR區(qū)，降低了Foxl2的表達(dá)水平，抑制了Foxl2結(jié)合到類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)和Cyp19a1基因的啟動子區(qū)，降低了StAR和Cyp19a1的表達(dá)，進(jìn)而影響E2的合成。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，不同類型的miRNAs通過不同的信號通路，精確調(diào)控著卵泡激素的合成，但具體哪條通路起了主要作用或是這些通路之間是如何相互作用調(diào)控著激素合成還不清楚，尚需進(jìn)一步展開研究。

miRNAs對卵泡發(fā)育障礙性疾病的調(diào)控作用

卵泡發(fā)育障礙性疾病是造成雌性/女性不孕的重要原因，也是生殖醫(yī)學(xué)/生殖生物學(xué)的研究重點(diǎn)，越來越多的研究表明，miRNA在常見卵泡發(fā)育障礙性疾病，如多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)和卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)中發(fā)揮作用。PCOS的特征是卵巢多囊樣改變、不排卵和高雄激素血癥。Naji等[47]研究發(fā)現(xiàn)，在PCOS患者顆粒細(xì)胞中miR- 93和miR- 21水平顯著升高，且游離睪酮和游離雄激素指數(shù)與miR- 93和miR- 21的表達(dá)呈正相關(guān)，miRNA作為雄激素合成通路的中間調(diào)控因子，其異常升高引起了患者的高雄激素血癥。MiR- 320a在PCOS患者顆粒細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)，其靶向作用于雌激素合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RUNX2，顯著降低了CYP11A1和CYP19A1的表達(dá)，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞中雌激素合成顯著減少[42]。此外，在PCOS患者的顆粒細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了miR- 323- 3p水平下調(diào)。MiR- 323- 3p可靶向作用于胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF- 1)mRNA，抑制IGF- 1的表達(dá)，從而下調(diào)雄激素受體、抗苗勒氏管激素Ⅱ型受體、細(xì)胞色素P450 19A、表皮生長因子受體和鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子GATA- 4的表達(dá)水平，導(dǎo)致患者體內(nèi)雌激素合成減少，雄激素水平顯著升高，出現(xiàn)高雄激素血癥[39]。miR- 27a- 3p則通過作用于cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1，下調(diào)Cyp19a1的表達(dá)，導(dǎo)致雄激素和雌激素表達(dá)水平失調(diào)，促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的凋亡[48]。因此，顆粒細(xì)胞miRNA調(diào)控紊亂，將會引起激素失調(diào)，顆粒細(xì)胞凋亡，與PCOS的發(fā)生密切相關(guān)。

POF是指卵巢功能衰竭、卵巢中卵母細(xì)胞數(shù)量顯著減少所導(dǎo)致的40歲之前閉經(jīng)的現(xiàn)象，其特點(diǎn)是顆粒細(xì)胞功能紊亂、雌激素水平降低，促性腺激素水平升高，但具體發(fā)生機(jī)制尚不清楚。Chen等[49]在POF患者血漿和卵巢顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR- 146a的表達(dá)顯著升高，miR- 146a可靶向調(diào)控白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6的表達(dá)，通過caspase級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致卵泡閉鎖。Cho等[50]研究發(fā)現(xiàn)，miR- 146a單核苷酸多態(tài)性會改變FOXO3、FOXL2 和CCND2的mRNA水平，使其靶基因表達(dá)異常，進(jìn)而導(dǎo)致顆粒細(xì)胞功能紊亂，卵巢卵泡發(fā)育缺陷。MiR- 938可靶向結(jié)合到促性腺激素釋放激素受體(gonadotropin-releasing hormone receptor，GnRHR)mRNA上，調(diào)控著促性腺激素的循環(huán)水平，進(jìn)而影響卵巢卵泡發(fā)育。miR- 938 G>A多態(tài)性可引起GnRHR表達(dá)的異常調(diào)控，造成卵泡發(fā)育受阻，出現(xiàn)POF[51]。目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA參與了POF發(fā)生的調(diào)控，這些miRNAs作為POF的診斷、靶向治療或預(yù)后標(biāo)志物的選擇具有潛在的應(yīng)用價值，對于闡明POF的發(fā)生機(jī)制也是至關(guān)重要。

未來展望

隨著對miRNAs研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識到miRNAs作為細(xì)胞活動的關(guān)鍵調(diào)控分子，不論是在正常生理狀態(tài)還是病理狀態(tài)下都廣泛表達(dá)，其調(diào)控卵泡細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，影響卵巢正常的生理和病理過程，未來需要進(jìn)一步闡明其在卵泡發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制。miRNAs具有高度保守性和穩(wěn)定性，因此進(jìn)一步挖掘miRNAs在生殖領(lǐng)域作為檢測標(biāo)志物的研究，以其進(jìn)行卵巢疾病的診斷和治療并作為輔助生殖技術(shù)選擇優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞和胚胎的客觀標(biāo)準(zhǔn)，將對篩查和治療卵巢疾病、提高受孕率和減少多胎發(fā)生率都具有重要意義。