劉 宸,李 超,方夢蝶,任 娟,徐 昊,王孝舉,張衍梅

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子醫(yī)學(xué)中心,杭州 310012)

印記位點調(diào)節(jié)物兄弟因子(the brother of the regular of imprinted sites,BORIS),是調(diào)控細(xì)胞核三維空間結(jié)構(gòu)的因子CTCF(CCCTC binding factor)的唯一同源因子。BORIS在生理狀態(tài)下僅在健康人體睪丸中正常表達(dá),但在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)BORIS在除睪丸外的癌組織中異常表達(dá)[1],且BORIS高表達(dá)的癌癥患者的生存期相對較短,因此,BORIS是潛在的腫瘤治療靶標(biāo)[2-3]。BORIS在男性的睪丸中參與精子發(fā)生[4],而女性體內(nèi)幾乎檢測不到BORIS。雖然BORIS敲除小鼠未發(fā)現(xiàn)生命周期和生存狀態(tài)改變,在雌性表型和繁育能力均正常的情況下,BORIS缺失導(dǎo)致雄性不育的問題仍將嚴(yán)重破壞種群繁衍。本文綜述了BORIS在正常睪丸中的表達(dá),BORIS基因敲除小鼠和轉(zhuǎn)基因鼠的胚胎發(fā)育研究,BORIS在睪丸中功能的研究,對精子發(fā)生的調(diào)控作用,以及細(xì)胞質(zhì)定位BORIS的功能研究進(jìn)展和影響B(tài)ORIS通路的相關(guān)藥物。我們希望在理解正常組織中在生理狀態(tài)下BORIS的表達(dá)和功能的基礎(chǔ)上更深入地解析和挖掘BORIS在癌細(xì)胞中的作用機制,以及在此基礎(chǔ)上篩選提高男性生育能力且無誘發(fā)癌癥風(fēng)險的生物活性藥物。

1 BORIS在健康睪丸中特異性高表達(dá)

BORIS在健康雄性小鼠睪丸中高表達(dá),但并非在胚胎睪丸發(fā)育初始就表達(dá),為了驗證其表達(dá)時序,Jelinic等[5]利用免疫組化實驗檢測了小鼠胚胎中BORIS的表達(dá)時序。研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育13.5 dpc(交配后天數(shù))時未檢測到BORIS,但在14.5 dpc胚胎的有絲分裂停滯的生殖細(xì)胞中觀察到BORIS蛋白表達(dá),17.5 dpc時位于生精小管中心的生殖細(xì)胞有BORIS的表達(dá)。而小鼠成熟精子中未發(fā)現(xiàn)有BORIS[6]。與在機體內(nèi)普遍表達(dá)的CTCF不同,BORIS在生理條件下僅在雄性睪丸中高表達(dá)。Loukinov等[7]于2002年發(fā)現(xiàn)CTCF和BORIS在睪丸中的分布存在是互斥的。精原細(xì)胞經(jīng)過初級精母細(xì)胞,次級精母細(xì)胞,最后發(fā)育為精子細(xì)胞。Sleutels等[6]以正常成年小鼠睪丸為實驗材料,他們分離出了完整的曲細(xì)精管,發(fā)現(xiàn)CTCF在曲細(xì)精管精子發(fā)生的任何時期表達(dá),而BORIS僅在晚期精母細(xì)胞和線性前期的精原細(xì)胞中有表達(dá),且在精母細(xì)胞中BORIS在細(xì)胞質(zhì)中的含量比細(xì)胞核更加豐富。但也有報道闡述在圓形精子中檢測到了BORIS的mRNA的表達(dá)[8]。上述各項研究均指示BORIS在生精小管中的精母精原細(xì)胞區(qū)表達(dá)。

在健康小鼠中BORIS在精子發(fā)生階段才開始出現(xiàn),并可能進(jìn)一步影響精原和精母細(xì)胞的發(fā)育,但隨著精子的成熟BORIS的表達(dá)消失。因此BORIS的表達(dá)時序與精子發(fā)生時序高度一致,這提示BORIS的表達(dá)和功能在健康雄性小鼠中有調(diào)控精子發(fā)生的專一性。

2 BORIS的正常表達(dá)維持胚胎發(fā)育

BORIS在胚胎發(fā)育中的具有重要作用。Sleutels等[6]于2012年構(gòu)建了BORIS基因敲除小鼠,繁殖出雜合子BORISdel/+和純合子BORISdel/del小鼠。基因敲除后的小鼠無任何表型及行為異常。實驗證明,無論純合子還是雜合子均對雌性小鼠無生育影響。而在雄性小鼠中,雜合子小鼠正常發(fā)育,小鼠依然有預(yù)期生育率。而純合子小鼠的生育率明顯降低。稱重90日齡的BORIS基因敲除小鼠的睪丸的重量,純合子的睪丸平均重量顯著低于雜合子小鼠的睪丸,且精子含量顯著降低,僅為雜合子的15%[6]。上述研究表明,BORIS基因缺失影響雄性動物的生育能力,但不影響雌性動物的生長發(fā)育、生殖及哺育后代的能力。

BORIS的異常表達(dá)影響胚胎的正常生長發(fā)育。Sati等[9]構(gòu)建了BORIS轉(zhuǎn)基因小鼠,并對新生轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠進(jìn)行BORIS的表達(dá)對比。以qRT-PCR的方式檢測肝、肺、腎、腦、眼和皮膚組織,野生型小鼠中未發(fā)現(xiàn)BORIS表達(dá),而轉(zhuǎn)基因小鼠的上述器官中均有不同程度的表達(dá),以肺和皮膚組織表達(dá)量最高。研究表明BORIS轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)了生長遲緩、眼睛畸形、多器官病變、血管缺陷和新生兒死亡等現(xiàn)象。該研究證明在胚胎早期發(fā)育時期出現(xiàn)BORIS的表達(dá)將顯著影響機體的生長發(fā)育。

綜合BORIS在健康小鼠睪丸發(fā)育時序中的表達(dá)以及BORIS敲除、轉(zhuǎn)基因?qū)π∈蟮挠绊?BORIS可能僅在健康哺乳動物睪丸發(fā)育過程中特異表達(dá),并專一調(diào)控精子發(fā)生。BORIS的缺失雖然不影響動物個體的生命周期和生存狀態(tài),但極大降低雄性動物的生育能力,從而影響其種群的繁殖能力。

3 睪丸中BORIS通過競爭抑制調(diào)控精子發(fā)生

BORIS與其旁系同源蛋白CTCF的位于中部的氨基酸序列為鋅指結(jié)構(gòu)區(qū),11個高度同源的鋅指區(qū)域使得二者識別相同的DNA簇。但BORIS和CTCF的氨基和羧基端差異較大,差異區(qū)域占據(jù)各自蛋白質(zhì)氨基酸序列全長近三分之二的區(qū)域[7]。BORIS的氨基和羧基端可能與不同配體相互作用競爭CTCF的結(jié)合位點[10]。研究表明BORIS與CTCF不同,BORIS識別DNA時并不依賴DNA甲基化的程度[11]。對基因的表達(dá)調(diào)控研究發(fā)現(xiàn),BORIS激活基因表達(dá),而CTCF抑制基因表達(dá)[12]。這些結(jié)果表明,CTCF通常為抑制因子抑制基因轉(zhuǎn)錄,而BORIS是激活因子促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[12]。

在分離的野生型小鼠睪丸細(xì)胞中利用BORIS和CTCF的抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP),結(jié)果顯示BORIS與Stra8和Prss50的啟動子優(yōu)先結(jié)合,而CTCF與Vps18優(yōu)先結(jié)合,該結(jié)果表明BORIS在睪丸中擁有和CTCF不同的功能[6]。Stra8在B精原細(xì)胞發(fā)育至線性前期精母細(xì)胞瞬時表達(dá),Stra8的瞬時表達(dá)對于視黃酸誘導(dǎo)的減數(shù)分裂必需[13-14]。免疫組化結(jié)果顯示BORIS的表達(dá)時序類似Stra8,胚胎干細(xì)胞中BORIS的過表達(dá)研究顯示GFP-BORIS在特定位點結(jié)合且誘導(dǎo)睪丸特異性基因表達(dá)[6]。ChIP研究顯示GFP-BORIS與Gal3st1,Stra8和Prss50的啟動子結(jié)合,調(diào)控并誘導(dǎo)上述基因的表達(dá)[6],其中Gal3st1對精子發(fā)生必需[8]。上述研究均表明睪丸中表達(dá)的BORIS與精子發(fā)生密切相關(guān)。

4 BORIS與睪丸特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子共同調(diào)控睪丸發(fā)育

BORIS缺失小鼠會因睪丸變小、配子產(chǎn)生延遲而導(dǎo)致生育能力降低,研究發(fā)現(xiàn)受BORIS調(diào)控的Stra8和Prss50等基因調(diào)控下游基因的表達(dá)影響精子發(fā)生[6,15],因此BORIS可能通過睪丸特異性轉(zhuǎn)錄因子級聯(lián)影響睪丸的發(fā)育。Pugacheva等[16]通過ChIP對小鼠睪丸中BORIS和CTCF的結(jié)合位點進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)存在2類CTCF家族因子結(jié)合位點:1xCTSes(單一motif)和2xCTSes(重復(fù)motif)。其中CTCF結(jié)合1xCTSes,而BORIS結(jié)合2xCTSes或BORIS和CTCF共同結(jié)合2xCTSes。相比于CTCF的結(jié)合位點1xCTSes,BORIS的結(jié)合位點2xCTSes可富集更多的轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子RNAP II,H3K27ac和H3K4me3[16],表明BORIS更易富集轉(zhuǎn)錄因子、參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

研究發(fā)現(xiàn)睪丸特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(testisspecific transcriptional regulators,TSTRs)富集在BORIS在基因組上的結(jié)合位點,調(diào)控睪丸發(fā)育。通過ChIP分析數(shù)個TSTR(A-myb、Brd4、Dmrt1、Dmrt6、Taf7l、Rfx2、Trim33)與1xCTSes或2xCTSes兩類結(jié)合位點的相互作用,發(fā)現(xiàn)TSTR于13.4%的BORIS和CTCF共同的結(jié)合位點富集,于44.2%的BORIS單獨結(jié)合位點富集,而CTCF單獨結(jié)合位點幾乎沒有TSTR的富集[16]。在已確定的位點中,只有那些與TSTR相結(jié)合的BORIS結(jié)合位點才與成熟精子中魚精蛋白的組蛋白保留區(qū)緊密相連[17]。精子中TSTR相關(guān)的BORIS結(jié)合位點,可通過促進(jìn)精子中的高水平轉(zhuǎn)錄以及組織精子染色質(zhì)來促進(jìn)組蛋白在精子中的保留。組蛋白與精子分化為單倍體密切相關(guān)[18],由此可知,TSTR與BORIS在基因組上結(jié)合位點的相互作用對精子發(fā)生有重要影響。

5 細(xì)胞質(zhì)定位BORIS的功能及機制

在精子發(fā)生過程中,精原細(xì)胞的干細(xì)胞性特征和精母細(xì)胞的正常生長發(fā)育是非常關(guān)鍵的。已有研究表明BORIS和細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、干細(xì)胞調(diào)節(jié)相關(guān)[1]。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)定位的BORIS有明確的抑制細(xì)胞凋亡的功能。通過刪除中部鋅指結(jié)構(gòu)域,構(gòu)建了細(xì)胞質(zhì)定位的BORIS(BORIS-ZFdel),發(fā)現(xiàn)BORIS-ZFdel阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì),同時caspase3/7活性減弱,確證了細(xì)胞質(zhì)定位的BORIS有抑制細(xì)胞凋亡的功能。

此外,BORIS調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的細(xì)胞周期[20]。和其他細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子相似,BORIS的過量表達(dá)影響了細(xì)胞周期的正常進(jìn)行[21],BORIS調(diào)控細(xì)胞周期標(biāo)志因子PCNA and Cyclin A的表達(dá),BORIS的過度表達(dá)引起細(xì)胞在S期的積累、細(xì)胞增大和多倍體細(xì)胞的出現(xiàn),導(dǎo)致有絲分裂失敗。BORIS需要被進(jìn)一步降解以利于細(xì)胞周期的順利進(jìn)行。去甲基化作用顯著提高BORIS的表達(dá)量,因此BORIS在癌癥中被激活[22],去甲基酶脂肪團和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)基因敲除的小鼠出現(xiàn)小鼠精原細(xì)胞中染色體不穩(wěn)定,以及將細(xì)胞阻滯于G2/M期[23],睪丸中由于去甲基化程度影響的BORIS的表達(dá)水平可能調(diào)控精母精原細(xì)胞有絲分裂的細(xì)胞周期,進(jìn)而影響精子發(fā)生[23-24]。

BORIS亦參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞。已有研究表明BORIS在癌癥干細(xì)胞中表達(dá),與特定的干細(xì)胞標(biāo)記呈正相關(guān)(如hTERT端粒酶基因),因此被認(rèn)定為是干細(xì)胞標(biāo)記物的正向調(diào)節(jié)劑,并在維持干細(xì)胞中發(fā)揮作用[1]。BORIS沉默后,干細(xì)胞標(biāo)記因子如ALDH1、NANOG、OCT4、SOX2和ABCG2普遍下調(diào),BORIS可能通過誘導(dǎo)hTERT端粒酶表達(dá),使干細(xì)胞獲得自我更新和永生的能力[25]。

6 基于BORIS為靶點的藥物研究

Fang等[26]利用BORIS表達(dá)干擾的microarray表達(dá)譜比對CMap數(shù)據(jù)庫,從1309種藥物處理6種細(xì)胞獲得的microarray表達(dá)譜中比對獲得了與BORIS表達(dá)干擾處理相似的藥物蒼術(shù)苷。SEMA3A、X RCC4和PPLL6基因在蒼術(shù)苷處理和BORIS表達(dá)干擾處理下表達(dá)均升高。蒼術(shù)苷是蒼耳子提取物,研究表明蒼術(shù)苷作用于線粒體[27],導(dǎo)致線粒體通透性增強,提示BORIS可能作用在線粒體相關(guān)信號通路上。有研究證明,蒼術(shù)苷有促進(jìn)大鼠精子早期凋亡現(xiàn)象,且在蒼術(shù)苷作用下,精子線粒體會出現(xiàn)融合、外膜破損、通透性增加和基質(zhì)丟失等情況[27],BORIS敲除小鼠中也發(fā)現(xiàn)精原精母細(xì)胞大量凋亡的現(xiàn)象。BORIS出現(xiàn)在精子發(fā)生早期,在細(xì)胞中起到抑制凋亡和促進(jìn)增殖的作用。在早期精子中,蒼術(shù)苷可能抑制BORIS的功能,導(dǎo)致大鼠精子出現(xiàn)了早期凋亡。

7 結(jié)語和展望

以往研究發(fā)現(xiàn)位于Y染色體的Usp9y,X染色體的Usp26,及常染色體的Sox30等都有調(diào)控精子發(fā)生的作用[28-30],但特殊的是BORIS在生理狀況下僅在人體睪丸中表達(dá),且是調(diào)控精子發(fā)生的關(guān)鍵因子之一,但目前缺乏與男性不育癥的相關(guān)研究。BORIS基因敲除僅影響成年雄性的生育能力,但對幼齡和雌性個體無任何影響(包括行為、表型、生存周期和繁育能力),BORIS失調(diào)將嚴(yán)重影響男性的生育能力進(jìn)而影響種群的繁育[6]。BORIS參與精子發(fā)生并對男性生育起重要作用,對于少精或精子發(fā)育異常的男性患者可考慮應(yīng)用激活BORIS的治療方法。此外,BORIS在除睪丸外的其他器官中表達(dá)會導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常和致死,而BORIS也被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤發(fā)生、耐藥和癌癥患者預(yù)后相關(guān)[31-32]。因此BORIS也是潛在的抗腫瘤作用靶點。由于目前世界范圍內(nèi)并未篩選出直接靶向BORIS的抗腫瘤生物活性抑制劑,考慮到BORIS在精子發(fā)生中的重要作用,靶向BORIS的腫瘤治療藥物的篩選應(yīng)建立以精母精原細(xì)胞為對照的并行的腫瘤細(xì)胞藥物篩選模型,以甄別有效抑制腫瘤且保護(hù)男性生育能力的BORIS靶向藥物。綜上所述,BORIS與雄性哺乳動物的精子發(fā)生密切相關(guān),對BORIS在睪丸中的功能研究將解析其作用機制,為靶向BORIS的藥物篩選,建立保護(hù)BORIS活性的方法奠定基礎(chǔ)。