譚仕廉 郭 樂 申元英 （大理大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學微生物學與免疫學教研室，大理671000）

黏膜屏障是由黏液層、上皮細胞層、參與構筑屏障的蛋白以及免疫活性物質(zhì)等組成，是阻止外界抗原如微生物、過敏原和致癌物等入侵黏膜組織的第一道防線，在維持黏膜免疫穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。多種疾病都有黏膜屏障功能的破壞和黏膜炎癥的發(fā)生，黏膜上皮細胞黏附連接和緊密連接的結(jié)構和通透性異常致使屏障功能受損，外界抗原通過受損的黏膜屏障進入機體，激活大量促炎癥細胞，從而加重黏膜炎癥反應。黏膜屏障功能受損導致黏膜炎癥，黏膜炎癥又進一步損傷屏障功能，兩者互為因果，最終導致黏膜相關組織損傷性病變。

近年來研究表明，miRNAs 在黏膜屏障功能和黏膜炎癥反應的調(diào)控中起重要作用。本文介紹了miRNAs 的生物功能，并探討miRNAs 在調(diào)節(jié)黏膜屏障功能中的作用，此外還總結(jié)了多種miRNAs 在黏膜炎癥中的表達變化及其在黏膜炎癥性疾病中的調(diào)控作用。

1 miRNAs的生物功能

miRNAs 是進化上高度保守且廣泛存在于真核生物中的一類非編碼單鏈小RNA 分子，大小約為19~25 個核苷酸，與信使RNA（mRNA）結(jié)合抑制靶基因的表達或翻譯來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。1993年，AMBROS 和RUVKUN 研究組在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個 miRNA：lin-4［1］，7 年后發(fā)現(xiàn)了第一個哺乳動物 miRNA：let-7［2］，miRNAs 的發(fā)現(xiàn)徹底改變了分子生物學領域；隨后研究證明miRNAs 可以調(diào)節(jié)細胞周期、分化、增殖以及死亡等關鍵過程［3］；篩選研究還顯示miRNAs 具有組織和細胞特異性功能［4］。有研究顯示，大約三分之二的人類基因是由轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)控的，這一數(shù)據(jù)顯示了miRNAs 在維持機體正常功能和調(diào)控人類疾病發(fā)生發(fā)展中起到至關重要的作用［5］。

迄今為止大多數(shù)研究表明，miRNAs 在其靶mRNA 的3'UTR 處與特定序列結(jié)合，從而誘導翻譯抑制或 mRNA 的失活降解［6］。然而在 mRNA 其他區(qū)域，包括5'UTR 和編碼序列以及啟動子區(qū)域，也發(fā)現(xiàn)了miRNAs 結(jié)合位點［7-8］。在一定條件下，miRNAs還可能激活翻譯或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄［9-10］。miRNAs與其靶基因的相互作用是動態(tài)的，并且依賴許多因素，如miRNAs 的亞細胞位置、miRNAs 與靶 mRNA 的豐度以及 miRNA-mRNA 相互作用的親和性［11］。miRNAs還可被分泌到細胞外液中，并通過小泡（如外泌體）或與蛋白質(zhì)結(jié)合運輸?shù)桨屑毎?，作為化學信使來介導細胞間的通訊［12］。

大部分miRNAs的形成是由DNA序列轉(zhuǎn)錄為初級 miRNA（pri-miRNA），加工為前體 miRNA（premiRNA），最終形成成熟miRNAs。目前已鑒定出的人類成熟 miRNAs 序列超過 2 500 個［13］。miRNAs 本身的表達調(diào)控機制是復雜而嚴格的，其生物形成過程中的任何中斷或偏差都可能改變miRNAs 表達，并因此改變基因表達。最近一項研究顯示Drosha、Exportin-5 和 Dicer 在 miRNAs 生物形成中不可或缺［14］，另一項研究表明 Argonaute 蛋白在轉(zhuǎn)錄后提高成熟miRNAs 的表達，降低miRNAs 降解，增加了miRNAs 的半衰期［15］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子也參與調(diào)控miRNAs，以組織或發(fā)育特異性的方式調(diào)控其表達［16］。由于miRNAs 在生理和病理過程如炎癥中的重要性，因此深入理解miRNAs 的表達調(diào)節(jié)是至關重要的。

2 miRNAs在調(diào)節(jié)黏膜屏障功能中的作用

黏膜表面通常與不計其數(shù)的外來物質(zhì)相接觸，包括食物、共生菌、病原體、過敏原、致癌物等。臨床研究顯示95%以上感染皆發(fā)生于黏膜，因此維持正常黏膜屏障功能在抵御外界抗原感染中具有重要意義。

許多研究表明，miRNAs 對維持黏膜完整性至關重要。例如，Dicer1 酶基因缺失的小鼠表現(xiàn)出腸上皮組織紊亂、上皮細胞非正常凋亡增加并出現(xiàn)黏膜的缺失［17］。miRNAs 對于正常黏膜上皮細胞的發(fā)育和增殖不可或缺。已知成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）是調(diào)控形成肺分支形態(tài)和上皮細胞增殖的關鍵信號，其受體是酪氨酸激酶信號之一，miR-let-7a靶向結(jié)合位于酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導下游的Ras 蛋白的mRNA，抑制Ras 蛋白表達，從而調(diào)控肺上皮細胞增殖［18］。此外，LU 等［19］發(fā)現(xiàn)miR-17-92 可靶向調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因Rbl2 的表達，促進肺上皮祖細胞的增殖并抑制其分化，miR-17-92 簇缺陷的小鼠表現(xiàn)出肺發(fā)育不全，室間隔缺損以及B 細胞發(fā)育異常，實驗小鼠出現(xiàn)異常的肺黏膜表型。

除了黏膜完整性，miRNAs 還參與調(diào)控黏膜屏障功能。上皮細胞之間的緊密連接是構成黏膜屏障的重要組成部分［20］，YANG 等［21］觀察到炎癥性腸病患者腸道黏膜組織和外周血miR-21明顯升高，升高的miR-21 作用于其目的基因RhoB mRNA，使RhoB 表達明顯減少，RhoB 與腸道通透性密切相關，RhoB 表達減少可導致腸道黏膜組織和體外培養(yǎng)細胞的緊密連接蛋白occludin 和ZO-1 明顯減少，從而破壞上皮屏障。miR-122a 是另一種參與調(diào)控腸上皮緊密連接的miRNA，通過直接誘導緊密連接蛋白occludin mRNA 降解，導致腸上皮細胞中occludin 減少，TNF-α誘導的腸上皮通透性增加，該研究提示了靶向降低miR-122a 以保護腸道屏障的可行性［22］。此外，有研究表明，miR-495 靶向下調(diào)STAT3 的表達，抑制JAK-STAT3 炎性信號通路激活，從而改善了小鼠的腸黏膜屏障功能［23］。

3 miRNAs在調(diào)節(jié)黏膜炎癥反應中的作用

3.1 miRNAs 在急性肺損傷中的作用 急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的特征是肺內(nèi)嚴重炎癥，肺泡-毛細血管膜完整性和肺黏膜屏障破壞，導致大量中性粒細胞和其他炎癥細胞流入肺泡，釋放炎癥和細胞毒性介質(zhì)，肺泡內(nèi)充滿富含蛋白質(zhì)的液體，表面活性物質(zhì)的合成和代謝受損以及局部促凝狀態(tài)，因此，抑制炎性反應可能是ALI治療的關鍵［24］。

許多學者證明了不同的miRNAs 在調(diào)控ALI 炎癥中發(fā)揮的作用。WANG 等［25］發(fā)現(xiàn) miR-155 在小鼠ALI 時表達增加，并通過負調(diào)控巨噬細胞中SOCS-1蛋白的表達，促進炎癥細胞因子TNF-α、IL-6 的釋放，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的ALI小鼠模型中發(fā)揮促炎作用。在另一項研究中，miR-34b-5也被發(fā)現(xiàn)在肺損傷期間表達上調(diào)，miR-34b-5p抑制減弱了肺通透性、炎癥細胞浸潤和細胞因子水平，且靶向上調(diào)生長因子proanulin（PGRN）表達，促進創(chuàng)面愈合和減少細胞凋亡，進而在LPS 誘導的ALI 中發(fā)揮保護作用，這一研究提示了miR-34b-5p參與調(diào)控ALI的病程發(fā)展［26］。

ZHU 等［27］在 LPS 誘導的 ALI 大鼠模型中發(fā)現(xiàn)miR-21 的表達顯著升高，Nuclear factor-κB（NF-κB）是炎性過程中關鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子，在ALI 的早期階段促進活化的巨噬細胞分泌產(chǎn)生各種促炎細胞因子。體外實驗顯示miR-21 會阻礙巨噬細胞中TLR4-NF-κB通路的激活，從而負向調(diào)節(jié)LPS誘導的炎癥反應。同樣的，SHI 等［28］觀察到 miR-21 在Ⅱ型肺泡上皮細胞（typeⅡalveolar epithelial cells，AECⅡ）內(nèi)高表達，且在細胞凋亡過程中明顯下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)過表達miR-21-5p 可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達，同時下調(diào)促凋亡蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶 3（caspase-3）和 Bax 表達，減少 AECⅡ凋亡，從而減輕高氧性急性肺損傷。這些研究均證明了miR-21 在ALI 損傷中發(fā)揮保護作用。TLR4是LPS 的模式識別受體，在ALI 的動物模型和體外細胞模型炎癥反應的上調(diào)和炎癥細胞因子的釋放中起著非常重要的作用。JU 等［29］研究顯示miR-27a靶向負調(diào)控TLR4 蛋白水平，抑制TLR4-MyD88-NF-κB 通路激活，減弱LPS 誘導的小鼠巨噬細胞凋亡和炎癥反應。同樣的，YANG 等［30］研究顯示在 LPS 誘導的肺泡上皮細胞中，miR-16 與 TLR4 的 3'UTR 相互作用，下調(diào)TLR4-NF-κB 通路，抑制下游NLRP3炎癥小體激活，從而發(fā)揮改善炎癥的作用。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 可以在細胞間轉(zhuǎn)移并介導關鍵效應細胞間的通訊，進而在ALI 炎癥中發(fā)揮作用。miR-223 因其在肺部炎癥過程中介導肺浸潤性多形核中性粒細胞（polymor-phonuclear neutrophils，PMNs）和肺泡上皮細胞（alveolar epithelial cells，AECs）之間的信號，受到 NEUDECKER等［31］的關注，進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-223 在 PMNs 中選擇性升高并在轉(zhuǎn)移到AECs 后靶向抑制PARP-1的表達，下調(diào)炎癥因子的釋放，從而起到緩解炎癥的作用。miRNAs 還可以通過外泌體分泌的方式從供體細胞轉(zhuǎn)移到受體組織，從而調(diào)節(jié)它們的生物學行為。在 WU 等［32］研究中，內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPCs）釋放的外泌體中的 miR-126 轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞（endothelial cells，ECs），靶向下調(diào)SPRED-1 表達，部分增強了RAF-ERK 信號通路，可以有效改善大鼠的肺損傷，恢復肺毛細血管的完整性，減少肺部炎癥和水腫的形成。在另一項研究中，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分泌的外泌體中miR-30b-3p 轉(zhuǎn)移到AECs 后，直接靶向抑制血清淀粉樣蛋白A3（serum amyloid A3，SAA3）的表達參與 ALI［33］?？傊琺iRNAs 在細胞間直接傳遞或通過外泌體轉(zhuǎn)移的方式在受體組織中發(fā)揮作用，將為ALI的治療提供新的視角。

3.2 miRNAs 在炎癥性腸病中的作用 炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一組累及胃腸道的慢性、復發(fā)性、非特異性炎癥性疾病。外界的各種刺激因素均可導致腸道黏膜屏障的完整性受損和通透性增加，使得病原菌易于穿過黏膜上皮屏障，造成黏膜固有免疫細胞和效應T 細胞的異?；罨?，炎癥因子的大量產(chǎn)生以及免疫耐受機制的打破，最終導致腸道炎癥的發(fā)生［34］。為了更具體地研究miRNAs 在調(diào)控IBD 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用，一些研究確定了腸黏膜中功能性的miRNAs。ROJASFERIA［35］團隊篩選比較了活動性克羅恩?。–rohn's disease，CD）和健康對照者結(jié)腸黏膜中miRNAs 的表達差異，分析顯示 4 個miRNAs（miR-144、miR-211、miR-373-3p 和miR-519）在炎癥的黏膜中顯著上升，提示miRNAs 譜可作為活動性CD 的生物標志物。另外有研究也致力于比較潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和 CD 中 miRNAs 的表達差異，利用微陣列 分 析 提 示 miRNAs（miR-19a、miR-21、miR-31、miR-101、miR-146a 和 miR-375）可作為識別和區(qū)分CD和UC的標志物［36］。

腸黏膜局部T細胞在黏膜炎癥反應中有重要作用，miRNAs 可以通過調(diào)控黏膜組織中T 細胞的成熟、分化、活化或其產(chǎn)生的細胞因子來影響?zhàn)つぱ装Y的發(fā)生發(fā)展。YANG 等［37］研究發(fā)現(xiàn) IBD 患者結(jié)腸黏膜中高表達的miR-425 通過下調(diào)靶基因Foxo1 導致Th17 細胞分化增加，活化后的Th17 細胞又產(chǎn)生多種細胞因子（IL-17、IL-12、IL-21等）、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等參與黏膜炎性反應，從而加重TNBS 誘導的小鼠結(jié)腸炎。miR-125a 在IBD 患者腸道黏膜和外周血單個核細胞中低表達，主要表達于CD4+T 細胞。E26 轉(zhuǎn)化特異性-1（E26 transformationspecific 1，ETS-1）在Th1 細胞分化中是一個重要的靶點，在miR-125a-/-小鼠中，ETS-1 表達上調(diào)。實驗表明miR-125a 是通過抑制ETS-1 的表達，從而抑制CD4+T 細胞向Th1 細胞的分化，在TNBS 誘導的小鼠腸道黏膜炎癥中起保護作用［38］。CHAO 等［39］觀察到IBD 患者外周血調(diào)節(jié)性 T 細胞（Treg）中 miR-155 的升高，F(xiàn)oxp3+Treg細胞中特異性過表達miR-155的小鼠表現(xiàn)出自發(fā)的自身免疫和更嚴重的DSS誘導的腸道損傷，CTLA-4 是一種由T 細胞表達的共抑制分子，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子和炎癥抑制劑，體外實驗表明miR-155的促炎效果是靶向抑制CTLA-4表達來介導的。SHI等［40］發(fā)現(xiàn) CD 患者和 UC 患者黏膜組織中升高的miR-31 通過降低IL-25 在轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)的表達水平，增強Th2 反應的同時抑制了Th1 和Th17 的細胞因子反應。體內(nèi)外實驗均顯示miR-31 抑制劑的治療降低了抗原提呈細胞中IL-12和IL-23 的水平，并且伴隨著結(jié)腸IL-25 的升高而改善了結(jié)腸炎癥。miR-31還可以調(diào)控參與T細胞成熟和極化的細胞因子——胸腺間質(zhì)淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的表達，使其在UC中促進黏膜愈合和調(diào)節(jié)炎癥中發(fā)揮作用，而UC 患者的淋巴細胞中表達增加的miR-31 直接靶向下調(diào)TSLP表達，加重破壞炎癥黏膜屏障的完整性［41］。

miRNAs 還可以通過激活或抑制炎癥信號通路來調(diào)控黏膜炎癥反應。LIN 等［42］在活動性 CD 中觀察到表達上調(diào)的miR-143 與自噬相關基因2B（autophagy-related gene 2B，ATG2B）表達呈負相關，增強的自噬體活性能有效減輕NF-κB 介導的炎癥，而miR-143 靶向抑制 ATG2B 的表達，引起 NF-κB 通路異常激活，增加促炎細胞因子的水平，從而加重了CD 的炎癥反應。同樣，UC 患者炎癥結(jié)腸組織中miR-193a-3p 的下調(diào)伴隨著PepT1（一種攝取細菌產(chǎn)物的二/三肽轉(zhuǎn)運體）的上調(diào)，抑制NF-κB 途徑激活，減輕了 DSS 誘導的結(jié)腸炎［43］。GUO 等［44］研究顯示，miR-7 靶向三葉因子家族3（trefoil factor family 3，TFF3）抑制PI3K-AKT 信號通路來調(diào)節(jié)結(jié)腸細胞的增殖和遷移。抑制miR-7表達促進杯狀細胞分泌TFF3蛋白，恢復緊密連接蛋白表達和細胞骨架重排來降低腸道通透性，對TNBS誘導的IBD動物模型的腸黏膜損傷具有保護作用。

目前，在腸黏膜炎癥相關的miRNAs 中，miR-146a 和miR-155 在調(diào)節(jié)炎癥反應中發(fā)揮重要作用。研究顯示miR-146a 在暴露于細菌LPS 和肽聚糖以及鞭毛蛋白后誘導其高表達，過表達的miR-146a 降低TNF 受體相關因子（TRAF）-6 和 IL-1 受體相關激酶（IRAK）-1 的表達，因此認為 miR-146a 在負反饋機制中起防止過度炎癥的作用［45］。與之一致的是，在ANZOLA 等［46］研究中，促炎細胞因子誘導腸上皮細胞中miR-146a表達升高，過度表達的miR-146a又誘導免疫耐受，抑制細胞因子MCP-1 和GROα/IL-8對LPS 或IL-1β 的反應。然而有報道顯示高表達的miR-146a 增加了小鼠對DSS 結(jié)腸炎的易感性，腸道內(nèi)過表達的miR-146a 抑制腸屏障基因表達，還抑制固有層內(nèi)Th17 細胞和Treg 細胞的數(shù)量，miR-146a-/-小鼠通過增強MyD88 信號的機制增強了腸道內(nèi)的屏障功能［47］?？傊?，在腸黏膜炎癥中，miR-146a 不僅調(diào)節(jié)免疫反應，而且還影響屏障功能，但miR-146a 到底發(fā)揮促炎還是抑炎的作用似乎還需要更多的研究。LI 等［48］發(fā)現(xiàn) miR-155 在 UC 中是一種強有力的調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)巨噬細胞極化，其缺乏可導致巨噬細胞M1 型轉(zhuǎn)變成M2 型，M2 在結(jié)腸中的優(yōu)勢可導致腸道免疫細胞增殖受抑制并抑制CD4+T細胞向Th1 和Th17 極化，從而影響IBD 的發(fā)生發(fā)展。現(xiàn)有研究提示了miRNAs 可以通過多種途徑參與調(diào)控腸黏膜炎癥的發(fā)生發(fā)展，深入研究miRNAs 在腸黏膜炎癥中的調(diào)控機制有望為IBD靶向特異性治療及改善預后等提供新的方向。

3.3 miRNAs 在其他黏膜炎癥性疾病中的作用 除了肺和腸黏膜，miRNAs 對于其他部位的黏膜組織比如生殖道、口腔、皮膚黏膜的炎癥反應中同樣發(fā)揮重要作用。傷口愈合是恢復皮膚完整性的一個基本的生物過程，其包括四個連續(xù)而重疊的階段：止血、炎癥、增殖和組織重構，LI 等［49］在傷口愈合的炎癥期和增殖期，發(fā)現(xiàn)miR-31在角質(zhì)形成細胞中逐漸上調(diào)，并通過抑制其直接靶基因上皮膜蛋白1（epithelial membrane protein 1，emp1）促進細胞增殖、遷移以及再上皮化，緩解炎癥促進皮膚創(chuàng)面愈合，加快恢復完整的皮膚屏障。與LI 結(jié)果一致的是，SHI 等［50］的小鼠研究結(jié)果證實了 miR-31 通過直接靶向RAS/MAPK 通路的負調(diào)控因子Rasa1、Spred1、Spred2 和 Spry4 激活 RAS/MAPK 信號，促進皮膚傷口愈合過程中的再上皮化，這為miR-31在皮膚創(chuàng)口愈合中的重要性提供了又一證據(jù)?？谇槐馄教μ\（oral lichen planus，OLP）是一種伴有基底角質(zhì)形成細胞變性的慢性炎癥性口腔黏膜疾病。miR-125b 通過PI3K/Ak/tmTOR 通路靶向負調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases 2，MMP-2）的表達，在OLP 疾病發(fā)展中抑制角質(zhì)形成細胞增殖，促進角質(zhì)形成細胞凋亡，降低細胞癌變的可能性，這一結(jié)果提示了miR-125b是OLP 的潛在治療靶點［51］。ZHENG 等［52］在 OLP 患者的黏膜中發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和 CD44 高表達，OPN 通過CD44 抑制CD8+T 細胞的凋亡，而口腔黏膜miRNA-214 靶向CD44 參與了口腔扁平苔蘚的發(fā)生發(fā)展。let-7c通過抑制LPS 誘導 NF-κB 通路激活，調(diào)節(jié)下游促炎細胞因子的釋放，緩解上皮細胞的壞死和中性粒細胞的募集，從而減輕子宮內(nèi)膜上皮的損傷，提示let-7c對LPS刺激的子宮內(nèi)膜炎具有保護作用［53］。然而let-7c 作用的具體靶基因仍待闡明。同樣的，YIN 等［54］的研究表明 miR-19a 靶向目標基因 TBK1減弱NF-κB信號通路的激活，減輕LPS誘導的炎癥。因此認為miR-19a可能作為治療子宮內(nèi)膜炎的靶點。

4 總結(jié)與展望

本綜述強調(diào)了miRNAs 在維持黏膜屏障功能和調(diào)節(jié)黏膜炎癥過程中的作用，從體外和體內(nèi)研究中揭示了miRNAs 在急性或慢性黏膜疾病中的調(diào)控機制。當前miRNAs 的研究發(fā)展迅速，獲得了重要的研究進展，但miRNA 研究仍處于早期階段，無論是在實驗室研究還是面向臨床應用時，許多現(xiàn)實問題和技術性瓶頸仍有待解決。例如：①miRNA 制備過程中數(shù)量和質(zhì)量的不穩(wěn)定性，不同部位不同方法提取所得到的 RNA 質(zhì)量不同［55］；②每個 miRNA 可預測出成百上千個可能作用的靶基因，使得辨別miRNA靶點和驗證 miRNA 生物功能頗具復雜性［56］；③miRNA 調(diào)節(jié)藥物的特異性和失靶作用；④miRNA 治療藥物的劑量考慮；⑤miRNA 對藥物個體化治療差異的影響等等。

綜上所述，miRNAs 在疾病調(diào)控中表現(xiàn)出巨大潛力，盡管miRNAs 治療仍存有諸多局限，但未來的研究將揭示miRNAs 在調(diào)控疾病中的更多細節(jié)，使得miRNAs 有可能成為預防、檢測、治療、監(jiān)控、診斷疾病以及判斷疾病預后的靶點，并為臨床藥物相互作用提供新的思路。未來的研究挑戰(zhàn)在于將這些知識轉(zhuǎn)化為成功的臨床治療，使得miRNAs 治療成為最具潛力的新醫(yī)療方案。