王梓權(quán) 樊 平 周 杰 翁 杰 馮 波

（西南交通大學(xué)材料先進(jìn)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，材料科學(xué)與工程學(xué)院，成都610031）

1 引言

血管生成是組織修復(fù)的必要條件，其核心在于炎癥反應(yīng)。理想的組織修復(fù)過程是炎癥初期破壞病原體、促使血管萌芽，隨后組織再生，炎癥消退，最后恢復(fù)正常組織結(jié)構(gòu)。但實(shí)際上，急性炎癥在破壞有害物質(zhì)同時也可能破壞正常細(xì)胞，導(dǎo)致組織或器官損傷；而慢性炎癥會引起組織破壞和纖維化。巨噬細(xì)胞是炎癥過程中極其重要的參與者，除機(jī)體免疫外，巨噬細(xì)胞在人體發(fā)育、動態(tài)平衡、血管生成、組織再生和植入體整合等方面也具有重要意義［1-2］。因此，基于巨噬細(xì)胞的組織修復(fù)治療策略逐漸受到重視。

未受到極化刺激的巨噬細(xì)胞常被稱為M0，而受到極化刺激的巨噬細(xì)胞通常被分為2 種表型：巨噬細(xì)胞受脂多糖（LPS）、IFN-γ 等炎癥介質(zhì)激活時表現(xiàn)為M1 型，又稱經(jīng)典活化型，在炎癥反應(yīng)中清除侵入病原體和異物，促進(jìn)炎癥發(fā)展；而巨噬細(xì)胞受IL-4、IL-10等因子刺激時表現(xiàn)為M2型，又稱交替活化型，在機(jī)體中起抑制炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定血管生成和組織修復(fù)作用。

2 M0型巨噬細(xì)胞在血管生成中的作用

組織內(nèi)常駐的巨噬細(xì)胞多為未極化的M0 型，是組織發(fā)育的關(guān)鍵參與者，對病原體的免疫反應(yīng)、監(jiān)測組織變化，尤其是維持組織穩(wěn)態(tài)均具有重要作用［3］。

OLKOWSKI 等［4］采用3D 納米纖維聚苯乙烯支架（NPSs）與M0 型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平上調(diào)，可通過募集內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮促血管化作用［5］。MOORE 等［6］將不同表型巨噬細(xì)胞與主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（AECs）包被在具有生物活性的聚乙二醇的水凝膠內(nèi)，與單獨(dú)的AECs 相比，M0 型巨噬細(xì)胞與AECs共同包被組的小管體積提高了2 倍，原因可能為水凝膠中AECs 與M0 型巨噬細(xì)胞直接接觸。研究證明，巨噬細(xì)胞具有在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞的能力［7］。

總之，M0型巨噬細(xì)胞有助于血管生成和組織再生，但其促血管生成能力大多還是由極化后的表型實(shí)現(xiàn)。

3 M1型巨噬細(xì)胞在血管生成中的作用

M1 型巨噬細(xì)胞在血管生成中的作用具有一定爭議。部分研究認(rèn)為M1 型巨噬細(xì)胞在血管生成中具有不可或缺的作用。

GUREVICH 等［8］將原代人M1 或M2a 型巨噬細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）共培養(yǎng)于一層成纖維細(xì)胞上，與其他組相比，M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)最長的總血管長度，原因?yàn)镸1 型巨噬細(xì)胞分泌的VEGF水平顯著上調(diào)。HSIEH等［9］采用外源注入M1型巨噬細(xì)胞的方法治療小鼠缺血性肌肉損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在損傷早期（1～3 d）進(jìn)行M1 治療能改善血管生成，促進(jìn)骨骼肌再生。

BEYER 等［10］設(shè)計了一種體外模型，將內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞以15∶1 摻入膠原蛋白Ⅰ凝膠球中并誘導(dǎo)發(fā)芽，將上述凝膠球暴露于不同表型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基，結(jié)果表明，M1 型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的遷移。結(jié)合相關(guān)研究，可能與VEGF 和IL-1b 共同作用有關(guān)［5，11］。KANG 等［12］研究表明，M1 型巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α 既具有促血管生成又有抗血管生成作用，取決于劑量以及是否存在周細(xì)胞。無周細(xì)胞存在時，TNF-α 濃度越高，抗血管生成作用越強(qiáng)；有周細(xì)胞存在時，可改善高濃度TNF-α 引起的抗血管生成作用。

相反，也有研究認(rèn)為M1 型巨噬細(xì)胞不會促進(jìn)血管生成，甚至抑制血管生成。LIU 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后，M1型巨噬細(xì)胞釋放出大量促炎外泌體（M1-Exos），抗血管生成并加速心肌細(xì)胞損傷。M1型巨噬細(xì)胞還表達(dá)高水平的促炎miRNA，如miR-155。miR-155 通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖抑制血管形成。XU 等［14］采用褪黑激素將激光誘導(dǎo)的小鼠脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）中的巨噬細(xì)胞從M2 型極化為M1 型，這種表型轉(zhuǎn)變顯著降低CNV病變體積和血管增殖能力。

因此，M1型巨噬細(xì)胞在血管生成中的作用存在爭議，可能有以下原因：①研究者選擇不同種屬細(xì)胞作為研究對象，已有研究表明不同來源巨噬細(xì)胞差異顯著［15］；②不同損傷部位炎癥環(huán)境存在差異，如糖尿病大鼠傷口潰瘍往往較為嚴(yán)重，M1型巨噬細(xì)胞階段持續(xù)時間過長，抑制血管生成，因此需盡快將炎癥環(huán)境轉(zhuǎn)為M2 階段，促進(jìn)血管生成和組織再生［16］，相反，小鼠缺血性肌肉損傷修復(fù)中需要豐富的新生血管，也就需要M1 型巨噬細(xì)胞激發(fā)血管萌芽［9］；③促炎因子存在時間，如SAINSON 等［17］采用含TNF-α（10 ng/ml）的培養(yǎng)基預(yù)處理包被有內(nèi)皮細(xì)胞的纖維蛋白凝膠微球，2 d后將含TNF-α的培養(yǎng)基更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，結(jié)果顯示經(jīng)TNF-α 預(yù)處理組萌發(fā)的芽數(shù)顯著多于僅使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基的對照組，但如先使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理樣品2 d后再換成含TNF-α的培養(yǎng)基，該組萌發(fā)芽數(shù)反而明顯少于對照組；④M1型巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的接觸方式。

4 M2型巨噬細(xì)胞在血管生成中的作用

M2型巨噬細(xì)胞可穩(wěn)定血管生成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積［18-19］。M2 型巨噬細(xì)胞因不同刺激物還可分為以下幾種亞型：由IL-4或IL-13誘導(dǎo)的M2a；由免疫復(fù)合物（immune complex，IC）和Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）或IL-1R 激動劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的M2b；由IL-10 和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的M2c［20］。3種亞型在血管生成過程中起不同作用。

SPILLER 等［21］研究顯示，M2a 型巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平的基質(zhì)金屬蛋白酶-3 組織抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-3，TIMP-3），可阻斷VEGF 信號傳導(dǎo)和TNF-α 釋放。因此，M2a 型巨噬細(xì)胞可通過募集周細(xì)胞和調(diào)節(jié)M1 型巨噬細(xì)胞信號傳導(dǎo)促進(jìn)血管生成。另外，M2a 型巨噬細(xì)胞表達(dá)并分泌高水平血小板衍生生長因子-BB（PDGFBB）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子-2（FGF-2），PDGFBB具有募集周細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，穩(wěn)定新生血管作用［22］。如果沒有PDGF-BB，僅在VEGF 刺激下形成的血管是滲漏的，不成熟易于降解；而FGF-2 是一種非常有效的促血管生成有絲分裂原和生長因子。M2c 型巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平的基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和胎盤長因子（placental growth factor，PGF），MMP-9 具有刺激血管生成、重塑細(xì)胞外基質(zhì)和趨化內(nèi)皮細(xì)胞作用；PGF 則在M2c 誘導(dǎo)的血管生成中起驅(qū)動作用［21-22］。

YUE 等［23］將 心 臟 成 纖 維 細(xì) 胞（cardiac fibroblasts，CF）與不同亞型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)或與其條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，M2b 巨噬細(xì)胞顯著抑制CF 增殖和遷移，以及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)。而M2a的作用與之相反。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中M2b 也顯示出抗纖維化作用。研究顯示，M2b 與M2a 和M2c 的區(qū)別還在于其保留了高水平炎癥細(xì)胞因子，并伴有高水平IL-10和低水平IL-12表達(dá)［24］。盡管M2b型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子和有毒分子，但其可減少脊髓損傷和心肌缺血/再灌注損傷，有助于損傷部位組織修復(fù)［25］。此外，M2b 型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)Th2 分化和體液抗體產(chǎn)生。

M2型巨噬細(xì)胞不同亞型間作用機(jī)制不盡相同，需要在今后研究中更加細(xì)化其亞型分類及功能。另外，M2型巨噬細(xì)胞促血管生成能力并不適用于所有情況，研究發(fā)現(xiàn)，將M2 型巨噬細(xì)胞注射至糖尿病db/db 小鼠全層切除皮膚傷口，與空白對照組（注射生理鹽水）相比，M2 型巨噬細(xì)胞并不能改善小鼠血管再生和傷口閉合［26］。提示M1 型巨噬細(xì)胞在促血管生長中的重要地位，即新血管生長需要經(jīng)歷炎癥初期M1 階段再轉(zhuǎn)變到M2 階段。過長的M2 階段會導(dǎo)致過度纖維化從而損傷機(jī)體，在未來研究中應(yīng)當(dāng)關(guān)注如何使M2階段適時結(jié)束。

5 由M1 到M2 的順序激活在血管生成中的必要性

自然發(fā)生的炎癥過程就是由促炎型M1 階段適時轉(zhuǎn)入愈合型M2 階段，體外研究也證明順序激活M1和M2的必要性。

SPILLER等［21］采用不同表型巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC，觀察血管化情況，結(jié)果表明，HUVEC 在M1 條件培養(yǎng)基中形成松散互連的血管簇，但在由其他表型（M0、M2a 或M2c）或所有3 種表型組合（M1、M2a 和M2c）的條件培養(yǎng)基中并沒有這種現(xiàn)象。當(dāng)條件培養(yǎng)基在24 h 從M1 型轉(zhuǎn)換為M2a時，血管化類似于體內(nèi)自然轉(zhuǎn)變，成管行為明顯增強(qiáng)。當(dāng)條件培養(yǎng)基在24 h 由M1 轉(zhuǎn)變成M2c 或基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，未觀察到這種現(xiàn)象。因此，僅當(dāng)初期存在M1型巨噬細(xì)胞及其釋放的炎癥信號時，M2a型巨噬細(xì)胞才能分泌一些引起發(fā)芽血管融合的信號（如PDGF-BB等），從而增強(qiáng)成管行為。

CHEN 等［27］對純鈦表面進(jìn)行納米化表面改性，得到二氧化鈦納米管（TNTs）陣列，將抑炎因子IL-4吸附到TNTs后，在其上制備京尼平交聯(lián)的羧甲基殼聚糖凝膠，再加載促炎因子IFN-γ，最后覆蓋一層β-甘油磷酸鈉交聯(lián)的殼聚糖凝膠。這種攜載雙重炎癥因子的材料體系被用于研究材料引發(fā)的初期炎癥響應(yīng)和后期調(diào)控。結(jié)果表明，隨著凝膠層降解，首先是IFN-γ 明顯釋放，形成的炎癥環(huán)境將巨噬細(xì)胞極化為M1 表型；隨后以IL-4 釋放為主，導(dǎo)致M1型巨噬細(xì)胞大量極化為M2 型，將促炎階段轉(zhuǎn)變?yōu)榇儆想A段。YIN 等［28］在裝載IL-4 的TNTs 上組裝海藻酸鈉/殼聚糖的聚電解質(zhì)多層膜（PEM），再結(jié)合京尼平/氯化鈣交聯(lián)劑以調(diào)節(jié)IL-4 釋放。該材料體系在仿生條件下前3 d 緩慢釋放少量IL-4，3 d 后釋放量快速增加。當(dāng)材料與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時，采用促炎因子刺激的巨噬細(xì)胞在前3 d 保持M1 型，高表達(dá)促血管出芽的TNF-α、IL-1β 和VEGF；而7 d 時已轉(zhuǎn)化為以M2 表型為主，并高表達(dá)促血管網(wǎng)絡(luò)化的PDGF-BB。

以上植入材料設(shè)計表明，可通過階段性控釋炎癥因子，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型由M1 到M2 的順序激活，促進(jìn)新血管生長，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)組織再生。

6 巨噬細(xì)胞與其他細(xì)胞相互作用

血管生成和組織再生是通過巨噬細(xì)胞與其他細(xì)胞相互作用實(shí)現(xiàn)的。內(nèi)皮細(xì)胞是血管生成過程中的必需細(xì)胞，因?yàn)檠苌墒峭ㄟ^內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、排列、分支和吻合等行為實(shí)現(xiàn)的。巨噬細(xì)胞可通過作用于內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)現(xiàn)促進(jìn)血管生成的作用。反之，內(nèi)皮細(xì)胞對巨噬細(xì)胞也有所影響。

HE 等［29］研究中，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（IMEC）與造血細(xì)胞（hematopoietic cells，HCs）直接共培養(yǎng)可使HCs分化為巨噬細(xì)胞并產(chǎn)生集落，集落外圍的巨噬細(xì)胞向M2型極化。當(dāng)2種細(xì)胞間接共培養(yǎng)時，集落消失且無極化現(xiàn)象。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，被IMEC 極化的巨噬細(xì)胞促進(jìn)小鼠體內(nèi)腫瘤血管生長。JETTEN 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，盡管M1 型巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基具有血管生成潛力，但當(dāng)其與內(nèi)皮細(xì)胞直接共培養(yǎng)時，血管形成受到抑制。表明內(nèi)皮細(xì)胞和這些巨噬細(xì)胞直接接觸抑制血管形成并抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促血管生成因子。MOORE 等［30］采用聚乙二醇水凝膠包被內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞可改變巨噬細(xì)胞形態(tài)。內(nèi)皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞有2種直接接觸模式，分別為：巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞小管外壁緊密結(jié)合；巨噬細(xì)胞橋接內(nèi)皮尖細(xì)胞并作為支持細(xì)胞。但有關(guān)巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的膜結(jié)合因子及其對血管生長的影響機(jī)制尚未闡明。

血管生成過程中，巨噬細(xì)胞除與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用外，還與間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等相互作用。JUKKA 等［31］研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可募集巨噬細(xì)胞，并使其向M2 表型極化；巨噬細(xì)胞對間充質(zhì)干細(xì)胞具有募集、增殖和分化作用。JULIE 等［19］和MIKLOS 等［32］研究顯示，M2 型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)成纖維細(xì)胞趨化、增殖和分化；反之，成纖維細(xì)胞也會募集巨噬細(xì)胞。

LI 等［11］設(shè)計了一種將IFN-γ 加載于5%硅酸鈣/β-磷酸三鈣（CaSiO3-β-TCP）的支架。早期釋放IFN-γ 以刺激巨噬細(xì)胞向M1 型極化，隨后釋放Si 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 型極化。將原代人骨髓源性單核細(xì)胞（hBMMs）與幾種支架共培養(yǎng)，包括β-TCP、IFN-γβ-TCP、CaSiO3-β-TCP 或IFN-γ-CaSiO3-β-TCP。分別收集其上清作為條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC，用作體外血管形成試驗(yàn)。另以CaSiO3-β-TCP 浸提液用于血管形成實(shí)驗(yàn)，以區(qū)別硅酸鹽對HUVEC 的直接作用，結(jié)果表明IFN-γ-CaSiO3-β-TCP 與hBMMs 條件培養(yǎng)基用于HUVEC 培養(yǎng)時，具有最好的血管生成效果。同時僅材料本身的浸提液也可促進(jìn)HUVEC 血管生成。

CHEN等［33］將聚己內(nèi)酯（PCL）/F-127通過3D打印技術(shù)制備成納米纖維網(wǎng)，該納米纖維網(wǎng)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）組成一種新型支架。 載有BMSCs的3D支架可促進(jìn)肉芽組織形成，促進(jìn)血管生成并促進(jìn)膠原蛋白沉積。且該支架抑制巨噬細(xì)胞向M1 型極化并促進(jìn)其向M2 型極化。間充質(zhì)干細(xì)胞因其可分化性多用于骨修復(fù)。

血管生成和組織再生過程是一個多細(xì)胞參與的復(fù)雜生理過程，進(jìn)行組織修復(fù)時，如果僅考慮巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞對其他細(xì)胞的單向作用，可能不易起到良好的治療效果，需綜合考察此過程中巨噬細(xì)胞與其他細(xì)胞的相互作用，有望更好地解決組織再生與修復(fù)中的難題。

7 結(jié)論和展望

綜上所述，巨噬細(xì)胞無論是以何種表型存在（包括M0、M1 和M2），均對血管生成和組織再生起重要作用，且3種表型的作用并不是孤立的，而是相互聯(lián)系的。組織修復(fù)過程中，巨噬細(xì)胞是極為重要的角色，但其他細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，也是不可或缺的，其與巨噬細(xì)胞相互作用，共同達(dá)到促血管生成，進(jìn)而促組織再生的目的。雖然目前對巨噬細(xì)胞在血管生成中的作用有了一定認(rèn)識，但無論在理論上還是臨床應(yīng)用中均還存在亟待解決的問題，如炎癥微環(huán)境變化與巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的聯(lián)系及其對血管生成的作用，巨噬細(xì)胞不同表型存在時長對血管生成的影響，巨噬細(xì)胞與其他細(xì)胞相互作用過程的生化反應(yīng)、信號通路及其傳遞機(jī)制，內(nèi)源巨噬細(xì)胞募集效率，外源巨噬細(xì)胞遞送方式和時間點(diǎn)，生物植入材料設(shè)計方案，老年患者組織修復(fù)中的血管生成，血管生成中的性別差異等。

巨噬細(xì)胞在血管生成中的作用是涉及多細(xì)胞、多蛋白、多生物因子及可變生理微環(huán)境的多因素協(xié)同過程。通過組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)等多層面實(shí)驗(yàn)與理論研究才能充分認(rèn)識其作用機(jī)制的科學(xué)基礎(chǔ)，并指導(dǎo)臨床實(shí)踐，更好服務(wù)于患者，造福社會。