張世紀(jì)，付 翁，謝雅彬，謝 偉△，劉 遠(yuǎn)

（1包頭醫(yī)學(xué)院內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與神經(jīng)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古包頭014040；2包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)與麻醉學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014040；3首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053；4包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭014030）

低氧預(yù)適應(yīng)（hypoxic preconditioning，HPC）是指機(jī)體在經(jīng)歷一次或多次短暫、非致死性低氧刺激后，獲得的對(duì)更嚴(yán)重甚至致死性低氧/缺血刺激的耐受性，被認(rèn)為是機(jī)體抗低氧/缺血的一種內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象［1］。雖然HPC可以明顯減輕組織、器官尤其是神經(jīng)系統(tǒng)的低氧/缺血損傷并產(chǎn)生保護(hù)作用［2-3］，但其分子機(jī)制還不甚清楚。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及其受體原肌球蛋白相關(guān)激酶B（tropomyosin-related kinase B，TrkB）廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，二者結(jié)合后，通過(guò)激活BDNF/TrkB信號(hào)通路來(lái)影響神經(jīng)元分化、發(fā)育、突觸可塑性等過(guò)程，并在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用［4-5］。已有研究指明BDNF和TrkB是HPC對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用的重要因子［6］，但是HPC調(diào)控兩者表達(dá)的具體機(jī)制還有待研究。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種修飾，也是基因表達(dá)調(diào)控強(qiáng)有力的手段，且在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)現(xiàn)DNA甲基化調(diào)控BDNF或TrkB表達(dá)的現(xiàn)象［7］。此外，有研究顯示HPC可能對(duì)DNA甲基化產(chǎn)生影響［8］。因此本綜述在HPC條件下探討DNA甲基化調(diào)控BDNF和TrkB的機(jī)制，為后續(xù)HPC的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究提供參考資料。

1 HPC與BDNF和Trk B的關(guān)系

1.1 HPC對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制HPC神經(jīng)保護(hù)作用的研究于1986年開(kāi)始，研究表明HPC可在新生兒缺氧缺血、炎癥［9］、腦卒中［1］、腦外傷性損傷［10］、應(yīng)激等低氧/缺血刺激中產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用［4］。Xu等［11］的研究得出，HPC通過(guò)增加白質(zhì)中神經(jīng)纖維束單束的面積來(lái)減輕新生兒低氧/缺血損傷導(dǎo)致的白質(zhì)神經(jīng)纖維束數(shù)量減少；還可以通過(guò)激活少突膠質(zhì)祖細(xì)胞的成熟并抑制過(guò)度的小膠質(zhì)細(xì)胞活化來(lái)部分恢復(fù)白質(zhì)的異常發(fā)育，從而促進(jìn)新生兒感覺(jué)運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能礙的長(zhǎng)期功能恢復(fù)。由創(chuàng)傷性腦損傷引起的腦缺氧缺血會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，HPC通過(guò)上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3蛋白水平升高，從而改善神經(jīng)元的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力，最終抑制神經(jīng)元的凋亡［12］。多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）是中青年人群中常見(jiàn)的自身免疫性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，HPC可通過(guò)抑制血管細(xì)胞黏附分子1和細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)，增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管完整性，并減輕MS導(dǎo)致的感覺(jué)異常［13］。還有研究表明，HPC通過(guò)上調(diào)縫隙連接蛋白43表達(dá)，抑制c-Src蛋白活性，維持海馬CA1區(qū)中星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和谷氨酰胺合成酶的活性，以對(duì)抗短暫全腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元谷氨酸過(guò)度釋放，防止細(xì)胞外谷氨酸積累，減輕短暫全腦缺血造成的神經(jīng)元死亡［14］。總之，HPC可能通過(guò)低氧誘導(dǎo)因子1α或其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制而上調(diào)“好基因”表達(dá)或下調(diào)“壞基因”表達(dá)，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用［15］。

1.2 BDNF和TrkB在神經(jīng)系統(tǒng)功能中的作用BDNF是德國(guó)神經(jīng)生物學(xué)家Barde在1982年首次從豬腦中分離純化出的一種堿性蛋白，是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一［16］。BDNF在下丘腦、杏仁核、海馬、新皮質(zhì)等腦區(qū)高表達(dá)，參與各種神經(jīng)活動(dòng)［17-18］。BDNF通過(guò)2種不同的受體系統(tǒng)發(fā)揮作用，即高親和力的TrkB受體和低親和力的p75受體，p75是所有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白的常見(jiàn)非特異性受體［16，19］。TrkB在學(xué)習(xí)、記憶、獎(jiǎng)勵(lì)等各種生理過(guò)程中起重要作用［20-21］。BDNF與TrkB結(jié)合后能激活3個(gè)主要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，分別是Ras-絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-Akt途徑和磷脂酶Cγ（phospholipase Cγ，PLCγ）-Ca2+途徑［21-23］。以上信號(hào)途徑可以增加BDNF的表達(dá)和分泌，提升海馬錐體神經(jīng)元的樹(shù)突狀棘密度，并誘導(dǎo)海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）產(chǎn) 生［5，24-25］。此 外，BDNF和TrkB的表達(dá)變化與多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，BDNF水平降低和TrkB信號(hào)丟失在阿爾茨海默病、亨廷頓氏病和其他神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［16，22］。BDNF和TrkB及其信號(hào)通路被認(rèn)為是正常神經(jīng)系統(tǒng)生理功能實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵因子，因此調(diào)整其表達(dá)或信號(hào)通路活性可能是預(yù)防和治療一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要靶點(diǎn)。

1.3 HPC與BDNF和TrkB的關(guān)系HPC可通過(guò)調(diào)控BDNF和TrkB的表達(dá)發(fā)揮其內(nèi)源性保護(hù)作用［26］。HPC小鼠神經(jīng)元中的BDNF表達(dá)上調(diào)可激活BDNF/TrkB信號(hào)通路，修復(fù)神經(jīng)元損傷并增加神經(jīng)元突觸可塑性［27］。HPC可使神經(jīng)干細(xì)胞中BDNF表達(dá)升高，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病灶中植入HPC處理過(guò)的神經(jīng)干細(xì)胞可以促進(jìn)神經(jīng)再生并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能的恢復(fù)［6］。同樣，經(jīng)過(guò)HPC處理的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）也產(chǎn)生了類(lèi)似的反應(yīng)，HPC可以上調(diào)人UCMSCs中BDNF的水平，將人UCMSCs移植入損傷的脊髓可以促進(jìn)細(xì)胞存活，減少細(xì)胞凋亡，抑制損傷脊髓的炎癥浸潤(rùn)，同時(shí)改善脊髓損傷后的功能恢復(fù)［28］。另外，HPC可以通過(guò)激活BDNF/TrkB信號(hào)通路下游的PI3K/AKT途徑，上調(diào)內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管狀形成，最終抑制由缺血刺激引起的間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡［29］。還有研究指出，在大腦海馬膠質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BDNF，可增強(qiáng)HPC對(duì)氧糖剝奪損傷的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用［30］。此外，HPC同樣引起TrkB的表達(dá)變化，在HPC處理24 h內(nèi)，小鼠海馬中全長(zhǎng)型TrkB的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)BDNF/TrkB信號(hào)通路的活性升高；HPC處理3 d后截短型TrkB表達(dá)下降，而且BDNF/TrkB信號(hào)的活性升高，神經(jīng)功能改善，梗死體積減小，受損神經(jīng)元得以修復(fù)［22］。Lee等［31］發(fā)現(xiàn)，HPC后BDNF和TrkB的水平幾乎可以恢復(fù)到致死性缺血損害前的正常水平，BDNF和TrkB的表達(dá)與神經(jīng)元對(duì)缺血性損傷的耐受力有關(guān)，有助于神經(jīng)元對(duì)致死性缺血損傷的抵抗。雖然HPC可能通過(guò)上調(diào)BDNF和TrkB的表達(dá)同時(shí)激活BDNF/TrkB信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用，但是HPC調(diào)控BDNF和TrkB表達(dá)的機(jī)制還需深入研究。

2 HPC與DNA甲基化的關(guān)系

2.1 DNA甲基化DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化下，將甲基轉(zhuǎn)移至DNA分子的堿基上，通過(guò)CpG島的甲基化控制靶基因特異性表達(dá)［7］。DNA甲基化是不改變DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)而調(diào)控組織特異性基因表達(dá)的可逆過(guò)程［32］。生理狀態(tài)的DNA甲基化在細(xì)胞分化、基因表達(dá)［33］、胚胎發(fā)育［34］、生長(zhǎng)、遺傳［35］、免疫調(diào)節(jié)［36］、衰老［37］等過(guò)程中起著重要作用，而異常的DNA甲基化與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［38］。DNMTs在哺乳動(dòng)物中主要是DNMT1、DNMT3a和DNMT3b：DNMT3a和DNMT3b的主要作用是從頭合成DNA甲基化；DNMT1的主要作用是維持DNA甲基化，負(fù)責(zé)維持分裂過(guò)程中子細(xì)胞基因組的DNA甲基化模式［39-40］。

2.2 HPC與DNA甲基化已有證據(jù)顯示DNA甲基化廣泛參與了HPC的內(nèi)源性保護(hù)作用［8］。在研究HPC小鼠海馬組織中DNMTs的表達(dá)和活力時(shí)發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，HPC小鼠的DNMT3a和DNMT3b表達(dá)降低，而DNMT1的表達(dá)則不受影響［41］。在胚胎期神經(jīng)元遷移和定位的研究中得出，HPC可以降低DNMTs活性而使RELN基因（reelin的基因）啟動(dòng)子區(qū)CpG島位點(diǎn)甲基化水平發(fā)生不同程度降低，進(jìn)而促進(jìn)RELN基因的表達(dá)，提高小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力［42］。有研究表明，HPC可以通過(guò)下調(diào)DNMTs表達(dá)激活外泌體microRNA-126的表達(dá)，提高神經(jīng)元的低氧/缺血耐受性［8］。有研究證實(shí)，HPC可以上調(diào)多種腦內(nèi)神經(jīng)保護(hù)性基因的表達(dá)并廣泛去DNA甲基化，通過(guò)啟動(dòng)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成而增加神經(jīng)元對(duì)低氧/缺血的耐受性，為腦卒中提供新的治療策略［43］。在移植心臟祖細(xì)胞治療充血性心力衰竭的研究中觀察到，HPC還能通過(guò)激活PI3K-Akt途徑上調(diào)DNMT1和DNMT3b活性，抑制p53基因表達(dá)，且不會(huì)使p53基因啟動(dòng)子超甲基化；能增強(qiáng)心臟祖細(xì)胞的抗凋亡能力并提高其生存率［44］?？傊?，HPC上調(diào)“好基因”表達(dá)或下調(diào)“壞基因”表達(dá)的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，很可能是通過(guò)雙向調(diào)控靶基因的甲基化水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

3 HPC條件下的DNA甲基化及其對(duì)BDNF和Trk B的調(diào)控

3.1 DNA甲基化對(duì)BDNF和TrkB的調(diào)控BDNF和TrkB在突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶中的作用已經(jīng)被證實(shí)是不可或缺的［16］，而最新研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化可以通過(guò)調(diào)控BDNF表達(dá)來(lái)影響學(xué)習(xí)記憶［45］。在大鼠海馬神經(jīng)元中，DNA甲基化水平顯著降低，伴隨BDNF基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)大鼠的學(xué)習(xí)能力也明顯提升［46］。還有研究指出，DNMT抑制劑RG108可以在短時(shí)間內(nèi)增加BDNF表達(dá)量，而且伴隨著基因啟動(dòng)子中特定CPG島甲基化的增加，可以增強(qiáng)神經(jīng)元的突觸可塑性，提高認(rèn)知能力［47］。一部分腦卒中患者會(huì)同時(shí)患有焦慮障礙，而腦卒中患者BDNF基因的高甲基化則與焦慮有關(guān)；BDNF作為卒中后焦慮障礙的易感性標(biāo)靶，應(yīng)受到密切監(jiān)測(cè)，以明確焦慮是否發(fā)生，特別是在卒中恢復(fù)期［48］。還有研究表明，纈氨酸可以降低小鼠海馬中DNA甲基化水平，并且上調(diào)TrkB表達(dá)，從而發(fā)揮其抗抑郁樣作用［49］。應(yīng)激可引起大鼠行為異常，并伴有BDNF外顯子IV啟動(dòng)子區(qū)甲基化增加，引起海馬中BDNF表達(dá)降低［50］。除了在神經(jīng)系統(tǒng)，DNA甲基化對(duì)TrkB的調(diào)節(jié)還表現(xiàn)在腫瘤方面。肝癌的發(fā)病可能與TrkB基因啟動(dòng)子的高度甲基化有關(guān)，TrkB上調(diào)可能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［51］。另有研究顯示，慢性疲勞綜合征患者BDNF蛋白水平較高，但BDNF基因甲基化水平較低，可能與患者痛覺(jué)過(guò)敏有關(guān)［52］。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一些神經(jīng)疾病和精神疾病的治療過(guò)程中，抑制DNA甲基化可以使BDNF和TrkB的表達(dá)升高而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，從而產(chǎn)生良好的預(yù)后。

3.2 HPC條件下DNA甲基化對(duì)BDNF和TrkB的調(diào)節(jié)在HPC條件下，DNA甲基化對(duì)BDNF和TrkB表達(dá)調(diào)控的研究比較少。對(duì)精神分裂癥的研究表明，低氧會(huì)使BDNF的甲基化水平升高，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降；低氧還會(huì)讓前額葉的DNA甲基化水平降低，造成前額葉活動(dòng)度降低，這可能是造成精神分裂癥的原因［53］。然而HPC的神經(jīng)保護(hù)作用是明確的，我們正在進(jìn)行的研究顯示，HPC可顯著提升小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，而B(niǎo)DNF和TrkB及其信號(hào)通路與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)。有趣的是，我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)HPC條件下BDNF的表達(dá)水平也顯著升高，因此BDNF很可能參與了HPC改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的過(guò)程。此外，HPC可降低DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)，同時(shí)在BDNF啟動(dòng)子區(qū)域有大量CpG島，HPC狀態(tài)下這些CpG島的甲基化水平降低。因此，DNA甲基化可能是HPC上調(diào)BDNF表達(dá)的機(jī)制，HPC可能通過(guò)降低BDNF啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平上調(diào)BDNF表達(dá)，從而提升小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。后續(xù)的研究將要通過(guò)注射DNMT抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷從側(cè)面驗(yàn)證我們的推測(cè)。此外，BDNF/TrkB信號(hào)通路及其及其下游途徑是如何參與HPC提升小鼠學(xué)習(xí)記憶的過(guò)程中，也是我們下一步研究的重點(diǎn)內(nèi)容。