耿 天 綜述，孫 發(fā) 審校

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550004；2.貴州省人民醫(yī)院，貴陽 550002)

尿道下裂是一種男性陰莖及前尿道發(fā)育不全及開口位置異常的先天性生殖器畸形，在小兒泌尿系統(tǒng)畸形疾病中比較常見，國外報(bào)道尿道下裂發(fā)病率可達(dá)4‰～8‰[1-2]。目前尿道下裂的病因和機(jī)制尚不明確，已報(bào)道的研究表明多數(shù)尿道下裂與產(chǎn)婦年齡、內(nèi)分泌水平、服用藥物(促排卵藥、抗癲癇藥等)、新生兒體重、先兆子癇及環(huán)境因素相關(guān)，少數(shù)的尿道下裂形成可能是由于單基因突變引起，也可能與各種性染色體或常染色體異常有關(guān)。

Y染色體性別決定區(qū)(sex-determining region Y，SRY)基因與性別分化及生殖器的發(fā)育密切相關(guān)。研究表明SRY基因可能是性別分化某個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)中起開關(guān)作用的因子之一，在哺乳動(dòng)物中SRY基因的作用和地位可能更加明顯[3]。近年來隨著表觀遺傳學(xué)、分子診斷技術(shù)的發(fā)展，有學(xué)者提出SRY基因的改變與先天性尿道下裂的發(fā)生有關(guān)。本文主要對(duì)國內(nèi)外SRY基因在先天性尿道下裂中的作用研究進(jìn)行綜述。

1 SRY基因的結(jié)構(gòu)、功能和分化機(jī)制

1.1 SRY基因的結(jié)構(gòu)

SRY基因位于男性Y染色體短臂Yp11.3，采用逆向遺傳學(xué)方法對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄單位及其啟動(dòng)子進(jìn)行了初步鑒定,及通過對(duì)SRY基因的cDNA序列和基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn),SRY基因無內(nèi)含子結(jié)構(gòu),只含有1個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄單位全長約1.1 kb，該基因有1個(gè)多聚腺苷酸位點(diǎn)(AATAAA)和兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，其間是1個(gè)開放閱讀框架(open reading frame,ORF)，可編碼204個(gè)氨基酸，在基因的5′端和3′端的兩側(cè)分別是長達(dá)1.1和1.0 kb的富含AT區(qū)。在SRY基因上游非翻譯區(qū)及富含GC區(qū)內(nèi)還有2個(gè)SRY蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)SRY-CS+和SRY-CS-。

1.2 SRY基因的功能

SRY基因是編碼睪丸發(fā)育中的一種決定性基因，研究發(fā)現(xiàn)SRY基因在小鼠受精后胚胎發(fā)育的第10～12天于生殖嵴體細(xì)胞表達(dá)，第11天表達(dá)水平最高，一旦生殖嵴發(fā)生性別分化，SRY基因表達(dá)水平就開始降低。小鼠的性別明顯分化發(fā)生在受精后胚胎發(fā)育的第11天，此時(shí)雄性性腺呈條紋狀,SRY基因的表達(dá)正好發(fā)生在睪丸開始形成之前到結(jié)束的2 d內(nèi)，這恰好驗(yàn)證了SRY基因?qū)π詣e分化的調(diào)控，這種極短時(shí)間的表達(dá)峰也表明SRY基因啟動(dòng)睪丸的發(fā)育，但卻不維持睪丸的發(fā)育[4-6]。與小鼠類似，人類SRY基因的表達(dá)也決定了睪丸的形成。人類生殖嵴大約在妊娠后33 d形成，而SRY基因的表達(dá)在妊娠第41天的XY型胚胎內(nèi)可以開始檢測到，表達(dá)水平達(dá)到高峰的時(shí)間為妊娠后第44天，此時(shí)睪丸索剛好可見。但人類SRY基因在性腺中表達(dá)并不消失，成年時(shí)仍有表達(dá)，且存在于許多組織中，且在人類中表達(dá)開始于妊娠的第6周后的整個(gè)妊娠期間[7]。研究發(fā)現(xiàn)，SRY基因是決定性別的遺傳基礎(chǔ)[3]，也是睪丸決定因子(testis determining factor,TDF)之一，能夠啟動(dòng)哺乳動(dòng)物睪丸的發(fā)育與分化，是睪丸發(fā)育負(fù)調(diào)節(jié)的抑制因子[4-5]。有學(xué)者研究的轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)是SRY基因的性別決定功能最好的證明，他們將SRY基因14 kb的DNA片段注射到具有正常XX基因組小鼠的受精卵中，該XX胚胎繼而具有睪丸、雄性附屬器官和陰莖的發(fā)育[8]。SU等[9]研究也證明SRY基因與胎兒睪丸的成熟、雄性附屬器官分化發(fā)育、陰莖的發(fā)育、精子發(fā)生、成熟及早期胚胎發(fā)育都密切相關(guān)?？梢钥闯鯯RY基因存在于Y染色體的性別決定區(qū)內(nèi)，該區(qū)域也調(diào)控哺乳動(dòng)物的雄性發(fā)育[10]，且SRY基因可能除性別決定的功能外還有其他與雄性發(fā)育相關(guān)的廣泛作用。

1.3 SRY基因影響性別分化的機(jī)制

雄性胎兒正常的性別分化過程包含3個(gè)階段，且是在連續(xù)、有序和相互級(jí)聯(lián)的關(guān)系下形成的，其正常胚胎分化和發(fā)育的過程以SRY基因?yàn)橹鲗?dǎo)，在一系列基因的共同協(xié)調(diào)表達(dá)下調(diào)控完成。第1階段在受精時(shí)已被確定，即性染色體(XY)。第2階段在SRY基因的誘導(dǎo)下，未分化的生殖腺始基分化成睪丸，即生殖腺性別的確定。第3階段是在睪丸分泌的雄性激素及前睪丸因子等誘導(dǎo)下，內(nèi)外生殖器分化為男性的階段，即性別的表型確定。SRY基因可能是男性性別決定的起點(diǎn)，也是胚胎早期干預(yù)人類性分化的重要樞紐，并在胚胎早期的性分化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起著調(diào)控作用，同時(shí)也對(duì)其下游的基因起著重要的開關(guān)調(diào)節(jié)作用[11]。胚胎發(fā)育的第7周，在SRY基因編碼蛋白的影響下，啟動(dòng)下游的基因表達(dá)，誘導(dǎo)體腔中的上皮細(xì)胞分化出支持細(xì)胞，同時(shí)間質(zhì)分化出間質(zhì)細(xì)胞，睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞共同作用參與睪丸的發(fā)育[12]。約在妊娠8周時(shí)胚胎睪丸發(fā)育中的間質(zhì)細(xì)胞分泌雄激素，雄性激素睪酮在胚胎發(fā)育中主要誘導(dǎo)中腎管的男性化，睪酮在Ⅱ型5α還原酶(steroid 5-reductase,SRD5A2)作用下轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮，雙氫睪酮?jiǎng)t依次誘導(dǎo)外生殖器、尿道和前列腺的形成[13]，所以SRY基因誘導(dǎo)胚胎男性化方向的分化。性發(fā)育障礙是影響性腺或生殖器發(fā)育的條件，已知關(guān)鍵基因SRY的變異是46，XY性發(fā)育障礙的確切原因[14]。因此，SRY基因與先天性尿道下裂的發(fā)生聯(lián)系緊密。

2 SRY基因的改變及與尿道下裂的關(guān)系

SRY基因位于男性性發(fā)育的頂端，是決定睪丸發(fā)育的主要因素。睪丸分泌的雄性激素主要促使胚胎期男性生殖器的發(fā)育,陰莖和尿道在孕6周開始形成，在孕16周陰莖部尿道和陰莖頭開始發(fā)育。由上可知SRY基因的突變、缺失及異位將導(dǎo)致性腺發(fā)育不全、畸形或無性腺等,尿道下裂這種先天性畸形是由于胚胎發(fā)育過程中尿生殖溝未能自后向前在中線完全閉合所造成。因此，尿道下裂的發(fā)生與SRY基因的突變、缺失和異位有一定的相關(guān)性[15]。具體如下。

2.1 SRY基因的突變

SRY基因的突變可引起兩性畸形，這種兩性畸形是由性別分化期間胚胎發(fā)育過程中的調(diào)控性別決定、性腺發(fā)育或激素及其受體表達(dá)的基因異常引起的?，F(xiàn)已有研究通過新西蘭兔的實(shí)驗(yàn)證明了這一結(jié)論，在兔SRY的高遷移率族(HMG)區(qū)域引入了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的突變后，再進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)SRY-突變的嵌合兔被診斷為雌雄同體，其特征是同時(shí)具有卵巢、睪丸和子宮[16]。組織病理學(xué)分析顯示睪丸組織未成熟且缺乏生精細(xì)胞，而卵巢部分表現(xiàn)正常，并在卵巢變化的不同階段都顯示有卵泡存在。因SRY是哺乳動(dòng)物Y染色體上的性別決定基因，負(fù)責(zé)啟動(dòng)男性性別決定，所以高遷移率族(HMG)中的突變(SRY的保守DNA結(jié)合域)誘導(dǎo)XY個(gè)體出現(xiàn)了兩性畸形綜合征[17]。其中尿道下裂是兩性畸形的一種表現(xiàn)形式。

2.2 SRY基因的缺失

在XY性腺中，SRY基因的缺失可以導(dǎo)致涉及RSPO1/WNT4/CTNNB1和FOXL2的卵巢促進(jìn)途徑的激活。目前，性腺發(fā)育的調(diào)節(jié)與成熟的發(fā)生機(jī)制有一個(gè)較為公認(rèn)的學(xué)說是：在NR5A1等基因的作用下，首先形成雙潛能生殖嵴，XY性腺在GATA4/FOG2/NR5A1/WT1通路的調(diào)節(jié)下表達(dá)SRY，并抑制SOX9表達(dá)；在XX性腺中，因RSPO1/WNT4和SOX9通路被激活，支持細(xì)胞的前體細(xì)胞積聚β-連環(huán)蛋白，一旦SOX9達(dá)到閾值水平，即啟動(dòng)正性調(diào)節(jié)通路，F(xiàn)GF9或PGD2形成前饋環(huán)；后期，F(xiàn)OXL2抑制SOX9表達(dá)。但在睪丸中，SOX9促進(jìn)AMH活化，抑制卵巢WNT4與FOXL2的作用。因此SRY基因的缺失，會(huì)導(dǎo)致XY染色體的胚胎體細(xì)胞前體細(xì)胞在無負(fù)性調(diào)節(jié)的RSPO1/WNT4/β-catenin和FOXL2信號(hào)傳導(dǎo)的影響下分化為顆粒細(xì)胞,從而導(dǎo)致XY染色體的胚胎體生殖器脊形成卵巢[18]，這種情況稱之為XY染色體性腺逆轉(zhuǎn)。已有研究證明在小鼠XX染色體胚胎性腺中，通過SRY與NR5A1(SF1)協(xié)同直接上調(diào)Sox9(SRY相關(guān)HMG9)的表達(dá)和SOX9激活基因調(diào)控網(wǎng)，是可以控制支持細(xì)胞的分化和睪丸形成所需的形態(tài)發(fā)生事件的[19]。

2.3 SRY基因的異位

SRY基因的異位在生物個(gè)體中對(duì)器官的發(fā)育和生理學(xué)進(jìn)程卻有很大的影響。為了確定SRY異位表達(dá)在發(fā)育和生理學(xué)進(jìn)程的全局影響，KIDO等[20]通過使用轉(zhuǎn)基因激活系統(tǒng)，人類SRY基因在小鼠的單細(xì)胞胚胎中被激活的實(shí)驗(yàn)方法。建立Cre-LoxP轉(zhuǎn)基因激活系統(tǒng)，并評(píng)估轉(zhuǎn)基因小鼠中人類SRY基因的異位激活所出現(xiàn)的情況。其結(jié)果表明，在單細(xì)胞胚胎階段有異位SRY激活(SRY ON)幼崽的出生時(shí)間與非轉(zhuǎn)基因或Ddx4-Cre轉(zhuǎn)基因同窩小鼠相比，在生長中顯著延遲，且在出生前均死亡。該研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的后續(xù)組織病理學(xué)分析顯示SRY ON中的心臟、肺、肝和腦發(fā)育嚴(yán)重受損，包括：胸腺分化受抑制，心肌細(xì)胞壞死、凋亡，心臟纖維化，肺泡發(fā)生遲緩，大腦神經(jīng)發(fā)生受損，肝臟脂肪變性等病變結(jié)果，出生后死亡率顯著升高，這些器官的損傷和不足可能相互交織，共同促成各種器官中觀察到的表型。也有研究通過對(duì)哺乳動(dòng)物有性別差異的測序，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)Y染色體(MSY)基因都在X染色體上存在同源基因，并有可能在轉(zhuǎn)錄、翻譯、染色質(zhì)修飾、RNA加工和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性上有著相似的功能[21]。非性腺細(xì)胞中位于Y染色體(MSY)的SRY異常激活可破壞或修改正常的基因調(diào)控程序，從而對(duì)受影響的細(xì)胞或組織的發(fā)育，生理或病理進(jìn)程施加雄性的特異性作用[22]。當(dāng)SRY基因異位表達(dá)時(shí)，SRY可以差異性地影響體細(xì)胞，組織或器官的正常發(fā)育和生理學(xué)進(jìn)程，且可能是導(dǎo)致具有顯著男性傾向的眾多疾病[23-24]。所以SRY基因異位是導(dǎo)致SRY基因在男性個(gè)體生命的不同階段中異常激活的方式之一，時(shí)間，地點(diǎn)和程度的改變，導(dǎo)致的異常激活會(huì)在性別分化方面有所異常，當(dāng)影響尿道海綿體的發(fā)生、分化時(shí)就會(huì)導(dǎo)致尿道下裂的形成，也可能會(huì)導(dǎo)致除外尿道下裂的其他各種生殖畸形的發(fā)生。

3 SRY基因診斷在尿道下裂診斷臨床應(yīng)用中的研究進(jìn)展

SRY基因檢測在兒童性發(fā)育疾病診斷中提供的信息對(duì)于大致評(píng)估Y染色體的結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)提供了一定的幫助，并對(duì)兒童性發(fā)育疾病的明確診斷及下一步診療方向的確定起到一定的促進(jìn)作用。SRY基因作為性別決定基因?qū)τ谛苑只欠裾＞哂胁豢商娲淖饔?，?duì)于臨床上性發(fā)育障礙疾病(如尿道下裂、隱睪癥、小陰莖、兩性畸形等)的治療也具有指導(dǎo)意義。通過對(duì)SRY基因的診斷，廣泛用于臨床診斷、產(chǎn)前診斷、法醫(yī)鑒定，使對(duì)于性發(fā)育障礙疾病的診斷水平上升至分子水平，并對(duì)研究性反轉(zhuǎn)、性發(fā)育異常病因、優(yōu)生優(yōu)育政策提供了有價(jià)值的資料[25]。

3.1 套式PCR檢測

在性發(fā)育障礙的患者中有很大一部分患者表現(xiàn)形式為尿道下裂。在常規(guī)的基因診斷的過程中，可以從患者的外周血中提取DNA，采用套式PCR的方法(加入Y染色體SRY基因核心片段引物)使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外線熒光顯像技術(shù)檢測，與正常的對(duì)照做對(duì)比。有研究發(fā)現(xiàn)，SRY基因的存在與否是判斷患者生物學(xué)性別的最重要的客觀指標(biāo)之一，如果SRY基因有缺失或突變則直接影響到性分化的過程，引起性逆轉(zhuǎn)或性分化不良，因此對(duì)于重型尿道下裂，性別判斷有困難的，應(yīng)行SRY基因檢測，為臨床性別取向提供生物學(xué)依據(jù)[26]。且套式PCR檢測SRY基因的缺失和雙重PCR檢測SRY基因的突變的方法穩(wěn)定可靠，簡單便捷迅速，可在臨床檢驗(yàn)中推廣應(yīng)用。

傳統(tǒng)的診斷方式主要通過臨床表現(xiàn)來診斷，但對(duì)于一些特殊型的尿道下裂，一時(shí)無法準(zhǔn)確診斷。所以，通過染色體或SRY基因診斷有助于鑒別。

3.2 基因探針檢測

在不孕癥的患者中通過檢測SRY基因以明確不孕癥的原因，目前在不孕癥的男性患者中可以通過基因探針的方式檢測SRY基因的位置，檢測基因是否異位或缺失，同時(shí)通過多重PCR技術(shù)進(jìn)行SRY基因的DNA測序，明確該基因是否突變[27-28]。當(dāng)前通過PCR技術(shù)檢測SRY基因的方法已廣泛使用于患有男性不育(如46，XX男性綜合征)的遺傳學(xué)診斷上，并具有一定的臨床意義[29]。

3.3 其他新出現(xiàn)的基因檢測技術(shù)

在產(chǎn)前檢查領(lǐng)域的診斷中也應(yīng)用到檢測SRY基因的方法來預(yù)防性連鎖遺傳病和單基因疾病，其中有傳統(tǒng)的常規(guī)核型分析(采用羊膜穿刺技術(shù)抽取羊水提取DNA)，原位熒光雜交基因探針和PCR技術(shù)的方法來進(jìn)行基因檢測。目前，采用抽取孕母的外周血提取DNA通過基因探針和PCR技術(shù)可以達(dá)到無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的標(biāo)準(zhǔn)，通過此條途徑檢測胎兒SRY基因來預(yù)防性染色體疾病具有無創(chuàng)、安全、快速、有效、簡便等優(yōu)點(diǎn)[30]。當(dāng)前新出現(xiàn)的基因檢測技術(shù)也是可以很好快速地檢測SRY基因的，例如：熒光素酶報(bào)告基因、基因組高通量測序等，對(duì)于基因檢測來說更準(zhǔn)確、更便捷。

4 小 結(jié)

SRY基因作為男性的性別決定基因，在男性生殖系統(tǒng)中起到起點(diǎn)的作用。隨著對(duì)SRY基因認(rèn)識(shí)的深入，發(fā)現(xiàn)SRY基因與男性生殖系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育及疾病有密切的關(guān)系。當(dāng)前，SRY基因的檢測已被用于常規(guī)的檢測基因之一，也為研究更多與SRY基因介導(dǎo)有關(guān)疾病機(jī)制的層面做出了推動(dòng)的作用。因此，通過多方面的研究探索SRY基因與尿道下裂的相關(guān)性，有利于為臨床上男性相關(guān)的先天性疾病的診斷和治療提供新思路。期望未來可以通過基因的層面提前診斷、干預(yù)并治療尿道下裂，造福人類。