袁麗英，王娟，鄧勝朝，李 菲，王貴平，賈愛卿

（廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣州 511400）

與傳統(tǒng)接種方式的疫苗相比，無針接種疫苗具有接種方便、成本低、易于管理和處理等優(yōu)點。目前，有幾種無針接種方法，如經(jīng)皮接種和黏膜接種，其中黏膜接種已在人體成功地應用。許多黏膜通道，通常被認為是疫苗接種的潛在部位，如口腔、鼻腔、肺臟、結膜、直腸和陰道黏膜。出于理論和實踐操作的原因，研究人員更傾向于關注口腔、鼻腔和肺臟途徑給藥。

生物機體擁有龐大的黏膜免疫系統(tǒng)，專門監(jiān)視外來抗原，保護黏膜表面和機體免受其侵入，尤其是鼻腔黏膜系統(tǒng)是呼吸道系統(tǒng)的對外開放窗口。因為大多數(shù)感染是從黏膜表面開始的，所以通過鼻腔黏膜途徑接種疫苗具有非常重要的意義。

1 鼻腔黏膜免疫系統(tǒng)

黏膜免疫活性與黏膜淋巴組織（mucosalassociated lymphoid tissue，MALT）有關。鼻腔黏膜免疫系統(tǒng)為機體提供局部保護，防止病原體經(jīng)黏膜進入機體。黏膜免疫細胞游走于黏膜表面、上皮細胞和黏液物理阻隔病原侵入。

1.1 鼻腔黏膜的物理屏障系統(tǒng) 在病原侵入皮下組織時，上皮細胞和黏液起到物理屏障的作用。上皮細胞層覆蓋在黏膜表面，是阻止病原侵入的黏液和纖毛的主要組成部分。此外，上皮細胞通過非特異性胞吞或受體介導（如Toll樣受體，toll-like teceptors，TLRs）識別和吞噬病原體及抗原成分，或者僅識別抗原成分。上皮細胞與淋巴細胞、基礎抗原遞呈細胞（如樹突狀細胞和巨噬細胞）、細胞因子和趨化因子一起，對接觸的病原體或免疫物質產(chǎn)生非特異性和特異性免疫應答。

1.2 鼻腔黏膜活化的免疫系統(tǒng) 鼻咽淋巴組織（nasopharynx-associated lymphoid tissue，NALT）是鼻黏膜上活躍的黏膜免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)由淋巴組織、B細胞、T細胞和抗原遞呈細胞組成，并覆以含有記憶細胞（M細胞）的上皮層。每當病原或抗原組分接觸到鼻黏膜時，即會激活黏膜免疫系統(tǒng)。病原體或免疫原通過鼻腔黏膜和相互作用的抗原遞呈細胞（antigen presenting cells，APCs）（如：巨噬細胞、樹突狀細胞等）時被識別，他們游走于鼻腔黏膜表面保護免疫系統(tǒng)。這些抗原遞呈細胞將抗原運送到淋巴結，淋巴結將抗原呈遞給T細胞，這標志著免疫級聯(lián)反應被激活?？扇苄钥乖杀籄PCs識別，而顆粒抗原通常被M細胞吸收后被運輸?shù)絅ALT。

1.3 鼻腔黏膜的免疫抗體免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA） 鼻腔黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的IgA，是免疫反應中的一種重要的抗體，其主要存在于支氣管的黏液中。而大部分IgA位于外分泌液中，被稱為分泌型的IgA（secretory IgA，sIgA）。黏膜分泌的IgA，具有多種防御功能，如吸附黏液中的抗原或毒素，阻止他們直接接觸黏膜表面。此外，sIgA還可以阻斷致病分子與上皮細胞的附著，在漿細胞和上皮細胞共同作用下，使得IgA在黏膜區(qū)域具有主導性優(yōu)勢[1]。

2 鼻腔免疫系統(tǒng)的主要結構及作用

鼻腔直接與外界連通，主要負責調節(jié)空氣流量。因鼻腔是許多病原體的主要入口，通過鼻腔接種疫苗為機體免疫提供了一條便捷的途徑。鼻腔的第一道保護屏障是鼻孔入口處的鼻毛，能夠完全擋住較大的顆粒。鼻腔的整個表面覆蓋著一層黏液層，鼻腔分泌的黏液中含有多種類型的黏液素，可以吸附較小的顆粒。當黏膜表面的纖毛通過以每分鐘5～6毫米的速度擺動，可以將病原體通過打噴嚏和或咳嗽咳痰的機械方式清除，或者通過含有黏液素的黏液層輸送到咽喉后部，進入胃中的病原體被消化，此功能最大程度減少病原粒子進入黏膜表面。

鼻腔上皮包裹著毛囊相關的淋巴組織，這些淋巴組織在誘導黏膜免疫反應中起著重要作用。免疫細胞（如附近的B淋巴細胞）可以在呼吸道病原體侵入的黏膜部位產(chǎn)生IgA?；诒乔坏慕Y構特點，已有預防呼吸道感染和性傳播疾病的疫苗通過鼻腔途徑進行接種免疫，可有效預防治療相應的疾病[2]。

3 現(xiàn)有的鼻腔疫苗制品

3.1 預防性鼻腔免疫疫苗

3.1.1 使用于人類的鼻腔疫苗 目前經(jīng)批準的人類鼻腔接種的疫苗包括流感疫苗FluMist/FluenzTM（MedImmune，MD，USA）和印度血清研究所生產(chǎn)的鼻用減毒流感活疫苗（NasovacTM）。FluMist（鼻內(nèi)流感疫苗）被認為是最成功的鼻內(nèi)免疫疫苗之一，具有良好的耐受性并且表現(xiàn)出良好的療效[3]。盡管目前還沒有足夠的數(shù)據(jù)表明NasovacTM的安全性，但也沒有關于使用NasovacTM相關的嚴重副作用報道[4]。

人類使用的鼻腔免疫疫苗結合相應的給藥設備會增加疫苗的免疫效果。如MucoTM系統(tǒng)的網(wǎng)站展示了鼻腔流感疫苗在非人類靈長類動物上的免疫原性研究，數(shù)據(jù)表明，與注射和鼻腔液體噴霧相比，MucoTM系統(tǒng)在黏膜中產(chǎn)生了更多的sIgA（比液體噴霧的高了4倍）[5]。

3.1.2 使用于動物的鼻腔疫苗 目前商品化鼻腔免疫疫苗較多使用在禽類，如已在臨床應用多年的新城疫疫苗和傳染性法氏囊疫苗，采用滴鼻進行黏膜免疫[6]。用豬偽狂犬病病毒活疫苗對1～3日齡乳豬噴鼻免疫，是豬場凈化豬偽狂犬病的第一步，能有效抵御偽狂犬病野毒的入侵。由于偽狂犬病病毒主要定植在三叉神經(jīng)，使用gE缺失的弱毒疫苗可以在黏膜表面占位，從而抵抗野毒的感染。同時，黏膜免疫可以避免母源抗體對免疫產(chǎn)生的影響。豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗與LT蛋白通過滴鼻免疫小鼠，可產(chǎn)生理想的黏膜免疫應答及系統(tǒng)的體液免疫和細胞免疫反應[7]；鴨瘟活疫苗滴鼻誘導的黏膜免疫效果與肌注免疫效果同等[8]；重組剛地弓形蟲抑制蛋白滴鼻免疫小鼠可誘導脾淋巴細胞增殖和Th1型細胞免疫應答[9]。在人和其他動物上，鼻腔免疫的疫苗研究也越來越廣泛。

3.2 治療性鼻腔免疫疫苗 雖然目前針對鼻腔疫苗研究多集中在預防性疫苗上，但經(jīng)鼻腔免疫疫苗也被用于治療疾病。目前，引起更多關注的是鼻腔免疫療法治療人的各種癌癥和阿爾茨海默病，以及使用治療性疫苗治療自身免疫性疾?。ㄈ纰裥吞悄虿　用}粥樣硬化、多發(fā)性硬化、類風濕性關節(jié)炎、紅斑狼瘡和克羅恩病[10]）。這種家族疾病的治療通常是非特異性的，或者使用免疫抑制劑來降低對感染的易感性。有效的治療性疫苗可調整機體對自身抗原的耐受性，避免不良免疫反應。近期研究表明鼻腔免疫疫苗通過激活引流淋巴結中的樹突狀細胞來增強Foxp3+T細胞的誘導能力也可以實現(xiàn)類似的耐受性誘導[11]。

目前在人體上經(jīng)鼻腔接種成功的案例有動脈粥樣硬化和關節(jié)炎的治療。而在動物生產(chǎn)中，黏膜免疫疫苗如豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV）、傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis of pigs virus，TGEV）、輪狀病毒疫苗等正處于體外試驗研究階段，即將應用于臨床[12]。

4 鼻腔疫苗免疫的前景

4.1 鼻腔免疫系統(tǒng)活躍，提升免疫效率的潛力大 鼻腔內(nèi)的淋巴組織在誘導黏膜免疫反應中起著重要作用。同時免疫細胞（如附近的B淋巴細胞）可以在病原體侵入呼吸道黏膜部位時產(chǎn)生IgA。因此鼻腔接種的疫苗不但可誘導血清產(chǎn)生IgG，而且還誘導黏膜分泌IgA，這對于提升疫苗的免疫效力很重要。在中和肺炎鏈球菌和麻疹病毒等病原體和防止進一步感染方面，鼻腔接種疫苗可增強誘導黏膜產(chǎn)生IgA具有重要作用[13]。

4.2 鼻腔疫苗免疫可降低接種成本 鼻腔內(nèi)免疫可同時誘導系統(tǒng)和黏膜免疫應答，產(chǎn)生交叉免疫保護效應，利用該效應可以減少所需疫苗的數(shù)量，從而降低生產(chǎn)多種抗原的成本，同時也提高了鼻腔疫苗的免疫效力，這是鼻腔免疫疫苗較其他免疫方式的明顯優(yōu)勢所在。

其次，接種方法較注射免疫操作簡單，無需接種針頭，更容易被接種對象接受，不良反應少，接種成功率較高，損耗成本降低，也間接降低了疫苗免疫成本。

4.3 鼻腔疫苗的免疫效率高 鼻腔粘膜免疫可以避免胃腸道降解和肝臟首過效應，具有生物降解低，粘膜表面吸收快，可迅速引起免疫反應，利用率高，患者順應性強。同時通過鼻腔給藥可提高藥物在腦組織的分布，治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病。

5 鼻腔免疫疫苗面臨的挑戰(zhàn)

5.1 科學合理的鼻腔疫苗劑型 目前的鼻腔免疫疫苗劑型有溶液（液滴或氣霧劑）、粉末、凝膠和固體填充物。選用科學合理的劑型對于鼻腔疫苗的接種至關重要。以下是目前常用的疫苗劑型，不同劑型在免疫過程中存在不同的優(yōu)缺點。

5.1.1 溶液制劑 常見的溶液型的鼻腔疫苗，是體內(nèi)研究或臨床試驗中最簡單的疫苗制劑方法，也最容易接種，但人或動物接種疫苗時，必須躺下或把頭后仰一段時間，這在大規(guī)模疫苗接種時是不現(xiàn)實的。噴霧劑型更容易接種，也易于疫苗深入鼻腔。不過，有可能會從鼻孔泄漏或流進口腔，另外液體劑型較容易降解。

5.1.2 固體制劑 常見的固體劑型如粉末或固體填充劑，其優(yōu)點包括易于制造和穩(wěn)定。但由于疫苗通常只接種一到兩次，不像定期服用的藥片需要長期服用。一部分固體填充劑被設計成片劑，一接觸到黏膜即溶解。這種劑型已被廣泛應用于人類陰道給藥和家畜鼻腔給藥，與舌下含服劑型有諸多相似之處[14]。

5.1.3 粉末制劑 粉末狀疫苗的優(yōu)點是比液體形態(tài)具有更好的穩(wěn)定性，能夠靶向鼻腔深部。例如，炭疽干粉霧化疫苗已在發(fā)達國家和發(fā)展中國家大規(guī)模使用[15]。粉末劑型的劣勢主要是成本問題，因為需要專門設備進行接種。

5.1.4 顆粒制劑 目前有更多的證據(jù)支持這樣的假設，即小于300 nm的粒子穿過黏液的效率最高，但也有證據(jù)表明較大的粒子也能夠穿透[16]。對接種鼻腔內(nèi)凝膠微粒的研究結果表明，整個顆粒的滲透可能不是誘導免疫應答所必需的。顆粒的大小和所帶電荷的全面組合，也許是實現(xiàn)最好免疫效果的關鍵[17]?？扇苄钥乖拿庖咴酝陀陬w粒制劑，但抗原包囊可加速抗原透過鼻腔黏膜。因此，研發(fā)疫苗微粒載體系統(tǒng)受到極大青睞。

在研制新疫苗時，劑型和接種方式非常重要，這是為了有效地誘導針對靶病原的先天免疫應答和適應性免疫應答?？赡M病原體的微粒接種系統(tǒng)（納米粒聚合物和脂質體），被認為是一種很有前途的鼻腔疫苗接種方法。

目前被用于鼻腔疫苗的顆粒制劑的凝膠劑，是一系列天然、合成和半合成的聚合物。含有凝膠吸附劑（或有粘性或可以透過黏膜粘液）的制劑能夠延長疫苗釋放的時間。雖然關于正電荷或陰離子聚合物能否促進更好的吸收尚存在爭議，但用凝膠緩釋給藥可以改善疫苗作用時間毋庸置疑。Jesus等[18]研究表明，能粘附在黏膜表面并可選擇性靶向M細胞或APCs細胞的凝膠是最有效的。

5.2 有效的疫苗佐劑 佐劑是由添加的一些材料將抗原形成凝膠或顆粒的形式，或作為單獨的組分添加到疫苗產(chǎn)品中，是非特異性免疫增強劑，其可以減少免疫應答所需的抗原量。傳統(tǒng)疫苗常用的氫氧化鋁佐劑，在黏膜接種免疫時無效。顆粒輸送系統(tǒng)被認為既有利于優(yōu)化通過黏液或黏膜組織的輸送，又起到內(nèi)在的輔助作用。如前所述，選擇合適的佐劑是提高免疫效力的有效手段。

經(jīng)驗證的鼻腔黏膜接種疫苗所用佐劑包括：MF59乳劑（含角鯊烯油、司班85、吐溫80和檸檬酸緩沖液）、脂多糖、TLR激動劑（toll-like receptor，TLR）、殼聚糖、三甲基殼聚糖、細菌外膜蛋白和霍亂毒素或大腸桿菌不耐熱腸毒素（heatlabile enterotoxin，LT）等。但研究發(fā)現(xiàn)，在鼻內(nèi)接種以細菌毒素為佐劑的疫苗時會引起一些副作用，如面部神經(jīng)麻痹（俗稱貝爾麻痹）和其他與面部神經(jīng)紊亂，因此，LT不再被推薦使用作為人用疫苗的佐劑。肥大細胞活化劑如化合物C48/80等在炭疽疫苗中顯示了良好的佐劑作用。佐劑具有雙面性，在考慮特定疫苗類型的佐劑時，也應考慮其帶來的不良反應。例如，用含TLR-4增強劑的流感疫苗經(jīng)鼻腔接種小鼠，其IL-17A病理癥狀表現(xiàn)為短暫增強，同時體重減輕和發(fā)病率特征明顯高于不含佐劑組的小鼠[19]。在佐劑選擇中還應注意佐劑對誘導耐受性的影響，Zonnveld-Huijssoon等[20]的報道表明，通過鼻內(nèi)聯(lián)合接種卵溶菌酶和TLR2配體增強了機體的Th1型抗體，TLG2配體PAM3cys增加了自身免疫性疾病的風險。

5.3 大動物鼻腔疫苗的推廣普及 通過鼻腔免疫途徑接種疫苗，不但可以阻止條件性致病菌及外源性病原微生物在黏膜上皮定居、繁殖，還可以阻止病原微生物釋放的毒素及代謝產(chǎn)物損害機體細胞引起病理性損傷，可有效地預防一些人及畜禽傳染病的發(fā)生。

FluMist?重組減毒活疫苗已被人們廣泛應用，在禽類鼻腔疫苗免疫也早已應用[21]。但對于體格較大的動物，鼻腔疫苗的普及應用仍面臨較大的挑戰(zhàn)，需要克服疫苗免疫時動物的不配合，也需要考慮在大面積疫苗接種時，對應接種疫苗的輔助設備以及接種者易接受度。

6 小結與展望

本文主要敘述鼻腔接種預防性疫苗，及鼻腔接種疫苗在疾病治療過程中發(fā)揮的作用。目前，本文所述的許多制備方案在人或動物上尚未建立安全規(guī)范文件。但越來越多的臨床試驗表明，基于疫苗生產(chǎn)成本和接種可操作性等方面考慮，鼻腔免疫比其他黏膜免疫途徑更有優(yōu)勢，因此迫切需要鼻腔接種疫苗產(chǎn)品。就目前生產(chǎn)的鼻腔免疫疫苗產(chǎn)品免疫效果來看，直接刺激黏膜免疫反應的優(yōu)勢是顯而易見的。伴隨著免疫需求的增加，尤其對禽流感、豬流感和埃博拉等傳染病，如何快速產(chǎn)生免疫應答的需求增加，亟需制定相應的解決對策；更亟需對制劑或載體與佐劑之間在誘導免疫應答中的相互作用機理的研究。