白少川,張樂超, 葛琳涵,郭艷麗,王德賀,李蘭會(huì)

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071000)

內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(endogenous retrovirus，ERVs)屬于長末端重復(fù)(LTR)逆轉(zhuǎn)座子中的一類，普遍存在于所有脊椎動(dòng)物的基因組中，是外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒整合在宿主基因組并按孟德爾規(guī)律遺傳的基因序列。脊椎動(dòng)物基因組中ERVs已經(jīng)嵌入數(shù)百萬年，雞[1]、牛[2]、人[3]和鼠[4]基因組中ERVs分別占到1.3%、3.2%、8%和10%。

ERVs是古老病毒感染的“化石”，自侵入宿主生殖細(xì)胞后隨世代進(jìn)化積累了大量突變，以阻止其組裝感染性病毒粒子，不能感染宿主細(xì)胞。雖然多數(shù)ERVs已經(jīng)失活，但是有些仍能在宿主基因組中轉(zhuǎn)座生成大量拷貝。新整合的ERVs對鄰近基因的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用，成為宿主進(jìn)化的“發(fā)動(dòng)機(jī)”，另外，其不受控制的擴(kuò)展和表達(dá)也是對宿主生命的威脅。ERVs整合誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生新的適應(yīng)性遺傳變異和感染抗性，但也產(chǎn)生自發(fā)的免疫缺陷、癌變、神經(jīng)性退行性變化等負(fù)面效應(yīng)[5]。現(xiàn)代全基因測序和重測序技術(shù)積累了大量基因組數(shù)據(jù)，有利推動(dòng)了ERVs的進(jìn)化、功能性、調(diào)控機(jī)制等研究。本文對ERVs的結(jié)構(gòu)、整合機(jī)制、在宿主的表達(dá)調(diào)控及其進(jìn)化對宿主功能影響的研究進(jìn)行綜述，為深入挖掘ERVs與宿主的共進(jìn)化調(diào)控機(jī)制提供借鑒和參考。

1 ERVs的生成及其基因組結(jié)構(gòu)

1.1 ERVs的生成

侵入到宿主的外源病毒，用自身的逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒基因組RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用整合酶將cDNA整合到宿主基因組中，完成自身基因組在宿主細(xì)胞的部署。之后，整合的原病毒轉(zhuǎn)錄為RNA，利用宿主的核糖體機(jī)制繁殖后代，產(chǎn)生更多的病毒形成對宿主的感染。一般情況下，逆轉(zhuǎn)錄病毒僅感染宿主體細(xì)胞，偶爾整合進(jìn)入宿主生殖細(xì)胞，則以原病毒基因組形式永久地與宿主細(xì)胞DNA相結(jié)合，定位保持在染色體組上，并作為宿主基因組的一部分按孟德爾規(guī)律進(jìn)行垂直傳遞遺傳，從而形成了ERVs[4]。ERVs隨宿主基因組世代遺傳，對宿主基因組進(jìn)化具有重要作用。

1.2 ERVs的基因組結(jié)構(gòu)

ERVs全長7～11 kb，其典型結(jié)構(gòu)為5′ LTR-gag-pol-env-LTR 3′。LTR區(qū)在病毒RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄過程中形成，是逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)的調(diào)控中心，包含有調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化位點(diǎn)，以及多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；gag、pol和env是ERV的結(jié)構(gòu)基因，5′LTR區(qū)與gag基因間有引物結(jié)合位點(diǎn)(PBS)，3′LTR區(qū)與env基因間有多嘌呤區(qū)(PPT)。PBS是逆轉(zhuǎn)錄過程中細(xì)胞tRNA的結(jié)合位點(diǎn)，PPT是正鏈DNA生成中引物結(jié)合的位點(diǎn)。由于LTR區(qū)的同源重組或非同源重組，大多數(shù)的ERVs內(nèi)部編碼區(qū)序列缺失，或者只剩下LTR區(qū)(solo-LTR)，只有極少數(shù)整合較晚的ERVs仍保留有完整的基因組結(jié)構(gòu)。

由于ERVs與宿主具有相同的單堿基替換速率(10-9·年-1)，比原外源病毒的進(jìn)化速率(10-3·年-1)慢106，所以保留了外源病毒相似的基因組序列，使ERVs成為逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的“化石記錄”，從而由ERVs的基因組結(jié)構(gòu)變化可以推斷其與宿主的長期進(jìn)化關(guān)系[6]，利用ERVs的整合分析揭示了Kihnu綿羊的古老起源[7]。這些基因序列曾被認(rèn)為是“冗余廢棄物”或“無用”DNA，不具備任何功能，但是，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ERVs參與早期的胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、免疫紊亂以及免疫系統(tǒng)正常功能等生理、病理活動(dòng)。

2 ERVs的活性抑制

雖然重組等變異造成ERVs序列的不完整，但宿主基因組仍有具備完整結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)錄活性的ERVs，宿主進(jìn)化出多種機(jī)制嚴(yán)密調(diào)控成年體細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程逆轉(zhuǎn)座和ERVs轉(zhuǎn)錄表達(dá)的發(fā)生[8]。

2.1 ERVs的表觀修飾沉默

ERVs一般陷入在異染色質(zhì)內(nèi)，被宿主的第一道防線表觀修飾機(jī)制沉默，哺乳動(dòng)物5-甲基化胞嘧啶是典型的抑制性表觀修飾方式之一[9]，DNA的甲基化通過胞嘧啶脫氨基酶家族誘導(dǎo)人ERV(HERV)基因組5-甲基化胞嘧啶脫氨基突變?yōu)樾叵汆奏?，?dǎo)致錯(cuò)義突變或失活，從而抑制HERV的復(fù)制，保持宿主基因組的穩(wěn)定性[10]。甲基化水平低的2日齡雞法氏囊和心組織ALV-E1表達(dá)高于甲基化水平高的35日齡雞的表達(dá)，證明了甲基化對ERVs表達(dá)的調(diào)控作用[11]。Kuse等[12]發(fā)現(xiàn)LTR甲基化程度影響貓ERVs的復(fù)制能力，并且LTR區(qū)的A>T突變影響了啟動(dòng)子活性，低活性的T型ERVs在貓基因組中生成了更多拷貝。Chung等[13]發(fā)現(xiàn)雙重miRNA抑制豬ERV-B的表達(dá)效率達(dá)到86%。

組蛋白修飾參與沉默早期胚胎干細(xì)胞的ERVs表達(dá)[14]。組蛋白去甲基化酶(KDM1A)、輔阻抑物(KAP1)和組蛋白去乙?；?HDAC)參與沉默過程，KDM1A沉默ERVs的啟動(dòng)子，而組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(ZFP42)與gag基因表達(dá)有關(guān)[15-17]。小鼠胚胎細(xì)胞的腦池病毒粒子(IAP)沉默是由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(SETDB1)和KAP1介導(dǎo)的，IAP的5′UTR區(qū)可能通過KRAB-ZFPs招募KAP1和SETDB1完成沉默[7,18-19]。

2.2 ERVs的整合位點(diǎn)效應(yīng)

外源病毒傾向于整合在細(xì)胞的開放染色體，尤其是蛋白編碼基因附近，盡管內(nèi)源病毒可能具有相似的生物偏好，但人工或自然選擇可能剔除有害的內(nèi)源病毒元件。Lee等[1]發(fā)現(xiàn)雞全長GGERV10(Gallusgallusendogenous retrovirus 10)偏向定位于高AT含量(59.01%vs57.08%)的低基因密度區(qū)(3.83vs20.41個(gè)基因·Mb-1)。Mason等[20-21]利用obsERVer檢測地方雞基因組974種ALV-E整合，被發(fā)現(xiàn)的雞ALV-E增加到1 300種；但只有1.5%整合在基因編碼區(qū)外顯子中，顯著低于4.9%的隨機(jī)整合頻率。商業(yè)種雞群體中編碼區(qū)的ALV-E有顯著的剔除特征(26.7%vs51.8%的隨機(jī)整合)，在蛋白編碼基因上下游10 kb范圍內(nèi)有8倍的富集特征(32.9%vs4.1%的隨機(jī)整合)，地方雞群體中分別是40.7%和17.5%[21]。這反映了商品雞比地方雞更強(qiáng)的人工選擇，剔除了有害ALV-E整合，增強(qiáng)了有利效應(yīng)。

基因組數(shù)據(jù)分析揭示ERVs一般反向整合于功能基因外部，與隨機(jī)整合理論矛盾，由于正向整合對典型剪切信號的潛在干擾，表明宿主自身強(qiáng)的凈化選擇效應(yīng)[22]。禽EAV-HP反向整合在SLCO1B3基因5′UTR區(qū)形成綠殼蛋表型[23]，TYR基因內(nèi)含子4的ALV反向整合造成雞的隱性白羽表型[24]。另外，整合位點(diǎn)側(cè)翼poly-A重復(fù)與ALV整合連鎖，有色羽不存在poly-A，但紅原雞存在[25]。Poly-A與隱性白羽雞ALV整合的連鎖，側(cè)面證明了負(fù)向選擇作用，poly-A缺失的ALV整合個(gè)體可能由于機(jī)體的嚴(yán)重危害而被凈化。

3 ERVs與宿主的共生關(guān)系

ERVs在宿主體內(nèi)的相對穩(wěn)定性，以及不同宿主同源序列的保守性表明ERVs和宿主間存在長期進(jìn)化共生關(guān)系。ERVs表達(dá)參與哺乳動(dòng)物的胎盤生成和胚胎發(fā)育是被研究最典型的宿主征用功能，其與宿主表型、胚胎發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系正被逐漸揭示。

3.1 ERVs整合與胎盤的融合性早期胚胎發(fā)育

被甲基化、乙?；纫种苹钚缘腅RVs在生殖細(xì)胞生成和受精卵發(fā)育的重編程時(shí)期，轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座活性失控，ERVs編碼蛋白合胞素就是被哺乳動(dòng)物馴化為自身細(xì)胞功能的很好案例[26]。胎盤形成過程中HERV-W和HERV-FRD的env基因分別生成合胞素1和合胞素2，對胎盤合胞體的形成和維持滋養(yǎng)層細(xì)胞的融合起關(guān)鍵作用，合胞素發(fā)揮病毒編碼蛋白與宿主細(xì)胞膜融合的功能。這一功能被哺乳動(dòng)物征用，使胎盤對母體子宮更具“侵略性”，并且使母體失去對胎兒的免疫排斥，從而為胚胎發(fā)育提供了進(jìn)化優(yōu)勢[27]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究揭示了HERV表達(dá)與早期胚胎發(fā)育的復(fù)雜互作關(guān)系，LTR被征用為啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，提供如LBP9、NANOG、OCT4、GCM1、Sp1和GATA等轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)控附近胚胎發(fā)育和多潛能維持的功能基因[28]。人和小鼠ES細(xì)胞25%的NANOG和OCT4結(jié)合位點(diǎn)是由轉(zhuǎn)座子提供的，并且結(jié)合位點(diǎn)附近的基因是這些轉(zhuǎn)錄因子的功能靶標(biāo)[6]。早期胚胎干細(xì)胞中ERVs轉(zhuǎn)錄生成lncRNA與OCT4(POU5F1)的反式激活互作，協(xié)同促進(jìn)了特異ERVs表達(dá)[29-30]，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)精細(xì)調(diào)控早期胚胎發(fā)育。

3.2 ERVs整合與宿主表型變化

ERVs的LTR被公認(rèn)為宿主儲(chǔ)備的潛在順式調(diào)控元件，在進(jìn)化過程被招募參與鄰近基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。雞的隱性白羽、綠殼蛋、公雞henny性反轉(zhuǎn)羽毛等表型都是由于ERVs整合影響功能基因表達(dá)形成的。TYR基因內(nèi)含子4中7.5 kb的ALV反向插入引起雞隱性白羽，TYR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有多種3′UTR區(qū)被截短的異常剪接體，外顯子5缺失，影響了跨膜域的翻譯?？赡苄纬闪税麧{型而非跨膜型的TYR，不能正確定位至黑素小體，具有功能活性的黑色素催化合成受損[24]。Chang等[25]發(fā)現(xiàn)隱性白羽雞Tyr酶的表達(dá)水平明顯低于野生型，但在胚胎皮膚中表達(dá)差異不顯著，而10周齡皮膚表達(dá)差異極顯著，這說明ALV對宿主細(xì)胞基因的表達(dá)調(diào)控受到細(xì)胞環(huán)境的影響。長4 250 bp的EAV-HP反向整合在雞1號染色體SLCO1B3基因5′UTR區(qū)，發(fā)揮增強(qiáng)子作用，SLCO1B3轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5′末端增加了EAV-HP的24 bp LTR序列[23]，并且在雞卵巢和蛋殼腺中的表達(dá)量分別增加180和19倍[31]，轉(zhuǎn)運(yùn)更多的膽綠素到蛋殼，表現(xiàn)綠殼蛋表型。SLCO1B3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與其表達(dá)水平及蛋殼綠色深度呈顯著負(fù)相關(guān)，隨著甲基化水平的提高，CpG5和CpG8位點(diǎn)的甲基化會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而在產(chǎn)蛋后期降低SLCO1B3的表達(dá)并導(dǎo)致蛋殼顏色更淺[32]。Li等[33]發(fā)現(xiàn)7 524 bp的ERV整合在雞10號染色體CYP19A1基因的5′UTR區(qū)，3′LTR區(qū)的TATA box參與CYP19A1的轉(zhuǎn)錄，形成包含99 bp 3′LTR的CYP19A1轉(zhuǎn)錄本，并在皮膚組織異位表達(dá)，導(dǎo)致公雞性反轉(zhuǎn)產(chǎn)生henny羽毛特征。ev21整合在雞PRLR基因5′UTR區(qū)，PRLR和SPEF2的重復(fù)基因與慢羽連鎖[34]，但ev21是否與該重復(fù)區(qū)域的形成有關(guān)，是否影響PRLR的轉(zhuǎn)錄還有待挖掘。

ERVs整合引起其他脊椎動(dòng)物表型變化。小鼠Agouti基因1C外顯子下游內(nèi)含子中反向整合5 357 bp 內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒VL30，VL30內(nèi)部有另一種內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒β4，兩種內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒嵌套整合在Agouti基因的5′UTR區(qū)，抑制Agouti基因的正常轉(zhuǎn)錄，形成純黑色被毛表型[35]。鼠內(nèi)源白血病毒Emv-3整合在肌球蛋白重鏈基因Myh內(nèi)含子區(qū)，其轉(zhuǎn)錄剪切發(fā)生變化導(dǎo)致小鼠無被毛表型。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入到PMEL基因?qū)е掳拇罄麃喣裂蛉咨幻硇蚚36]；7 125 bp的ERV插入KIT基因形成顯性白貓表型[37]。ERVs整合改變插入位點(diǎn)附近功能基因的正常表達(dá)，導(dǎo)致宿主表型發(fā)生變化。

3.3 ERVs整合與宿主免疫調(diào)節(jié)

ERVs進(jìn)化出多種機(jī)制參與宿主免疫調(diào)節(jié)。人、貓、水貂、大鼠、小鼠等宿主胚胎發(fā)育以及生長發(fā)育階段ERVs編碼的env蛋白有抵抗外源逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染功能[38-40]。env蛋白通過與外源病毒蛋白競爭細(xì)胞表面受體，阻止外源病毒的感染，也能有效塑造T細(xì)胞庫和體液反應(yīng)的抗原[41]，還具有超抗原誘發(fā)非特異T細(xì)胞激活功能[42]；gag蛋白能干擾外源病毒侵入后的感染周期，影響病毒粒子的組裝或釋放從而發(fā)揮抗病毒感染作用，F(xiàn)v1蛋白通過與鼠ERVs衣殼結(jié)合，阻止衣殼分解和ERVs整合進(jìn)入細(xì)胞染色質(zhì)[43]。

整合到宿主基因組的ERVs片段，尤其是LTR與誘導(dǎo)干擾素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合，增強(qiáng)免疫基因的表達(dá)。整合在TP63基因上游的HERV-9的LTR起到增強(qiáng)子的作用，增強(qiáng)雄性生殖干細(xì)胞抗腫瘤能力，并保持生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄保真性[44-45]。TP53是重要的腫瘤抑制基因，其編碼的蛋白質(zhì)p53作為轉(zhuǎn)錄因子，在體細(xì)胞中參與DNA損傷的細(xì)胞凋亡過程，因此被視為“基因組的守護(hù)者”，人基因組中1/3以上的p53結(jié)合位點(diǎn)位于ERVs的LTR區(qū)域[46]。綜上表明，宿主招募ERVs的LTR豐富細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

另外，ERVs產(chǎn)生的非編碼序列發(fā)揮抗病毒或抗感染基因的增強(qiáng)子作用，尤其是其雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生成，活化雙鏈RNA沉默途徑發(fā)動(dòng)I型干擾和細(xì)胞凋亡。Chen等[47]發(fā)現(xiàn)去甲基化試劑處理雞CEF細(xì)胞后，ALV-E1轉(zhuǎn)錄激活，生成反義產(chǎn)物lncRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)與TLR3結(jié)合并活化其信號途徑，誘導(dǎo)IFN-β相關(guān)基因表達(dá)發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。雞睪丸中有特異piRNA的表達(dá)，piRNA序列與ERV mRNA互補(bǔ)配對形成雙鏈，沉默ERVs轉(zhuǎn)錄后翻譯，因此逆轉(zhuǎn)座子誘發(fā)的病毒到宿主的基因流動(dòng)可能產(chǎn)生RNA介導(dǎo)的、序列特異性反義免疫記憶，類似CRISPR/Cas系統(tǒng)[48-49]。piRNA生成是ERVs與宿主共進(jìn)化的結(jié)果，家雞ERVs轉(zhuǎn)錄生成的一類piRNA在原雞中并無表達(dá)[50]。ERV轉(zhuǎn)錄的RNA增加，導(dǎo)致細(xì)胞溶質(zhì)中核酸的堆積，被核酸傳感器識別，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒和炎癥反應(yīng)的雙鏈RNA和cDNA[51]。Hu等[52]發(fā)現(xiàn)miR-155抑制了病毒感染過程中env的過表達(dá)，從而激發(fā)自然免疫。

4 ERVs的宿主致病性和生產(chǎn)性能影響

ERVs主要定位于異染色質(zhì)，被表觀遺傳沉默而保持穩(wěn)定狀態(tài)，在人體正常組織中沒有轉(zhuǎn)錄活性，但在癌變細(xì)胞、神經(jīng)性病變組織中，有不正?；虿皇芸刂频腅RVs表達(dá)[53-55]。Montesion等[56]對8個(gè)HERVs的LTR區(qū)序列多態(tài)性及其腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)整合位點(diǎn)附近啟動(dòng)子的通讀引發(fā)ERVs的轉(zhuǎn)錄，70%的乳腺腫瘤細(xì)胞中ERVs具有轉(zhuǎn)錄活性，并且其轉(zhuǎn)錄活性與LTR序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合性的改變一致，特別是HOX-PBX、RFX3等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的形成。說明整合位點(diǎn)、細(xì)胞環(huán)境對ERVs轉(zhuǎn)錄表達(dá)的重要性，LTR的序列結(jié)構(gòu)與宿主存在共進(jìn)化關(guān)系。另外，外源病毒生成病毒蛋白增加轉(zhuǎn)錄因子與LTR的結(jié)合性，反式激活ERVs的表達(dá)，加重病變[41,57]。

家雞[58]、豬[59]ERVs整合較晚，仍具備轉(zhuǎn)錄活性和感染性，并能與宿主基因或外源病毒重組形成新的病毒。ALV-E與內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒EAV-HP整合形成ALV-J亞型，導(dǎo)致肉雞骨髓性白血病、蛋雞廣譜性腫瘤[60]。MDV疫苗注射能誘導(dǎo)處于沉默狀態(tài)的ALV-E1、ALV-E21的表達(dá)，誘導(dǎo)淋巴瘤的較高發(fā)生率[61]。ALV-E的表達(dá)不僅能重組形成新的病毒，還引起家禽肌肉生長率和產(chǎn)蛋率等生產(chǎn)性能的下降。含有產(chǎn)生完整病毒粒子ALV-E10、ALV-E19或ALV-E12的來航雞造成年產(chǎn)蛋率降低8%～9%，蛋重降低2.2 g[62]。Ka等[63]對經(jīng)過45代選育的高體重和低體重白洛克雞cDNA芯片分析，發(fā)現(xiàn)低體重比高體重具有更多的ALV-E整合位點(diǎn)和表達(dá)，并且ALV-E高表達(dá)與母雞低體重存在保守的相關(guān)關(guān)系。Chen等[64]對18種ALVEs在我國地方雞、商品蛋雞、肉雞等8個(gè)品種中的群體分布檢測發(fā)現(xiàn)，ALVEs的整合多態(tài)性與家雞的選育方向和選育程度存在關(guān)聯(lián)。ERVs在越南豬的拷貝數(shù)低于西方豬，并存在品種特異性[65]。Chiu和Vanderwoude[66]發(fā)現(xiàn)家貓ERVs通過直接或間接的基因調(diào)控對外源病毒感染具有宿主保護(hù)作用，表明內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒的進(jìn)化效應(yīng)。

5 展 望

ERVs與宿主進(jìn)化發(fā)育關(guān)系研究的難點(diǎn)之一在于：宿主基因組中存在高相似度的ERVs多拷貝序列。雖然測序技術(shù)的提高，增加了ERVs定位和序列檢測的準(zhǔn)確度，但開展ERVs活性、與鄰近基因的表達(dá)關(guān)系、表觀調(diào)控和染色質(zhì)狀態(tài)等研究首先要明確ERVs的特異性。ERVs作為宿主基因組序列的整合成分，與宿主基因組的長期進(jìn)化過程中被宿主征用為自身功能，參與免疫調(diào)節(jié)抑制外源病毒感染、對宿主的健康、疾病等多種生物過程發(fā)揮重要作用。探究ERVs在宿主基因組的進(jìn)化及其調(diào)控表達(dá)對外源病毒的防控具有指導(dǎo)意義，通過PCR或RFLP技術(shù)對宿主ERVs進(jìn)行檢測，利用基因敲除技術(shù)建立無ERVs的家雞或家豬，對轉(zhuǎn)基因雞、豬器官移植、雞胚疫苗或成纖維細(xì)胞制備具有重要意義。