王玨, 胡麗麗, 李桂蘭, 吳娜, 張育敏

山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 山西 晉中 030600

植物病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins, PR)是植物體被病原體侵害及受到外界壓力時(shí)產(chǎn)生的[1]。這些PR蛋白主要被劃分為17個(gè)家族，具有廣泛的功能[2]，其中PR-10不僅僅參與植物的抗病機(jī)制反應(yīng)，同時(shí)在其自身發(fā)育中也起作用[3]。有文獻(xiàn)指出蒙古黃芪病程相關(guān)蛋白AmPR-10由158個(gè)氨基酸組成，理論大小為16.8 kD，且具有核酸酶活性[4-5]。并有研究證明，PR-10類蛋白的核酸酶活性可能在植物防御病原體感染中起作用，和其抗RNA類病毒相關(guān)[6]。因此體外研究AmPR-10的性能對(duì)深入探討黃芪抗病機(jī)制具有重要意義，然而從天然黃芪中提取蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)方法成本較高，蛋白得率較少，后續(xù)研究不便。

大腸桿菌表達(dá)體系遺傳背景清楚、操作簡便，對(duì)外源基因表達(dá)研究是一條高效、經(jīng)濟(jì)的途徑[7]，但因其缺少蛋白質(zhì)表達(dá)后的修飾體系，使來源于真核生物的外源基因表達(dá)后不能正確折疊，常以不溶的包涵體形式存在[8]。針對(duì)這一現(xiàn)象，目前有多種方式可提高外源基因的可溶性表達(dá)量，如與標(biāo)簽融合表達(dá)[9-10]、分子伴侶修飾表達(dá)[11-13]、提高周質(zhì)蛋白表達(dá)[14]或更換宿主菌等[15-16]。本研究試圖建立AmPR-10基因在大腸桿菌內(nèi)的可溶性表達(dá)體系，選擇融合標(biāo)簽以及分子伴侶修飾的方法以期高效表達(dá)具有活性的蒙古黃芪病程相關(guān)蛋白，為進(jìn)一步探索AmPR-10核酸酶活性機(jī)制，研究蒙古黃芪生長發(fā)育抗病過程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 蒙古黃芪葉片(山西中醫(yī)藥大學(xué)種植)；大腸桿菌k12購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；感受態(tài)大腸桿菌EscherichiacoliBL21購于生工生物工程(上海)有限公司；克隆表達(dá)載體pET-28a、pET-30a由山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶、細(xì)菌基因組提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠純化試劑盒、Ni2+純化蛋白試劑盒、酵母tRNA等均購于生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 PCR儀購自杭州科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自北京六一生物科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)購自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；恒溫?fù)u床購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；超聲破碎儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 重組子構(gòu)建

1.2.1蒙古黃芪總RNA提取 稱取蒙古黃芪葉片0.2 g，在冰上研磨，轉(zhuǎn)移至離心管。加入Trizol試劑室溫放置5 min。加入氯仿和異丙醇離心抽提，室溫晾干加入緩沖液溶解RNA。

1.2.2目的基因PCR 以蒙古黃芪總RNA為模板，利用RT-PCR試劑盒，得到AmPR-10的擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)體系(共50 μL)為：模板RNA 15.5 μL，緩沖液5 μL，上、下游引物各2 μL，反轉(zhuǎn)錄酶混合物0.5 μL, RNA酶抑制劑0.5 μL,TaqDNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 24 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸5 min。提取大腸桿菌k12基因組，以其為模板，通過PCR得到skp的擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)體系(共50 μL)為：模板2 μL，上、下游引物各2.5 μL，TaqDNA Mix 25 μL, ddH2O 18 μL。反應(yīng)程序同上。引物設(shè)計(jì)以NCBI公布的基因序列為模板(AmPR-10 Gene ID: KY419098.1，skpGene ID: 000913.3)，見表1所示。

1.2.3目的基因克隆 使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)AmPR-10基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切，將得到的酶切產(chǎn)物割膠純化后，與使用相同限制性內(nèi)切酶酶切的載體pET28a與pET30a分別連接，轉(zhuǎn)化宿主BL21(DE3)，得到重組子pET28a-AmPR-10和pET30a-AmPR-10；使用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和EcoRⅠ對(duì)重組子pET30a-AmPR-10質(zhì)粒酶切，將產(chǎn)物與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理后的分子伴侶skp相連接，轉(zhuǎn)化宿主BL21(DE3)，得到重組子pET30a-skp-AmPR-10(分子伴侶skp位于目的基因AmPR-10上游)。

1.3 目的蛋白表達(dá)和純化

將重組子于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200 r·min-1，至菌體濃度OD600達(dá)到0.5～0.6時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)(IPTG終濃度達(dá)0.1 mmol·L-1)，于37 ℃培養(yǎng)4 h及16 ℃培養(yǎng)12～16 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。通過超聲破碎獲得目標(biāo)蛋白的粗蛋白液(溶于Tris-HCl緩沖液中)，然后通過Ni2+蛋白純化試劑盒純化目標(biāo)蛋白，并用SDS-PAGE檢測(cè)純化前后的蛋白樣品，確定正確表達(dá)。通過考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定純蛋白的濃度。

表1 用于目的基因PCR的引物序列Table 1 The primers for gene cloning

1.4 目的蛋白活性檢測(cè)

稱取2 mg酵母tRNA溶于1 mL緩沖液( 100 mmol·L-1MES，pH 6.0)中，加入100 μL含有目標(biāo)蛋白AmPR-10的上清液，50 ℃保溫30 min。反應(yīng)完成后立即加入1 mL預(yù)冷的氯化鋰終止反應(yīng)，冰浴3 h，12 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，取上清液于260 nm處測(cè)定其吸光度，以未加酶液的樣品為對(duì)照。酶活定義為在50 ℃、pH 6.0反應(yīng)條件，2 mL反應(yīng)體系中，在30 min內(nèi)使A260吸收值變化1.0的酶量定義為一個(gè)活性單位U(活性定義參照上海翊圣生物科技有限公司Benzonase Nuclease全能核酸酶使用說明書)。

1.5 目的蛋白結(jié)構(gòu)模擬分析

對(duì)目的蛋白AmPR-10(單獨(dú)表達(dá))、S-tag+AmPR-10(與標(biāo)簽融合表達(dá))、skp+S-tag+AmPR-10(標(biāo)簽基礎(chǔ)上，通過分子伴侶修飾表達(dá))分別進(jìn)行SWISS-MODE建模(http://swissmodel.expasy.org/)，獲得PDB文件。使用軟件SOPMA對(duì)目的蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，使用軟件Chimera對(duì)目的蛋白空間三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行局部分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組子的克隆

本研究選擇利用表達(dá)載體pET-28a與pET-30a構(gòu)建重組子pET28a-AmPR-10與pET30a-AmPR-10；選擇利用分子伴侶skp對(duì)重組子pET30a-AmPR-10中的外源基因進(jìn)行修飾，構(gòu)建重組子pET30a-skp-AmPR-10，以建立AmPR-10在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)體系。

2.1.1目的基因PCR 如圖1所示，以大腸桿菌k12基因組為模板，通過PCR得到分子伴侶skp，長度為483 bp(條帶1、條帶2)，符合預(yù)期大?。灰悦晒劈S芪葉片總RNA為模板，通過RT-PCR得到目的基因AmPR-10，長度為474 bp(條帶3、條帶4)，符合預(yù)期大小。

注：M—Marker；1、2—分子伴侶skp擴(kuò)增結(jié)果；3、4—目的基因AmPR-10擴(kuò)增結(jié)果。圖1 目的基因AmPR-10和分子伴侶skp的PCR結(jié)果Fig.1 The PCR result for target gene AmPR-10 and molecular chaperone skp

2.1.2重組子鑒定 圖2A為重組子pET28a-AmPR-10的鑒定結(jié)果，重組子經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后電泳有2條條帶，分別與對(duì)照位置相同，確定得到陽性克?。粓D2B為重組子pET30a-AmPR-10的鑒定結(jié)果，重組子經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后電泳有2條條帶，分別與對(duì)照位置相同，確定得到陽性克隆。

注：A：重組子pET28a-AmPR-10鑒定結(jié)果，M—Marker；1—AmPR-10的PCR結(jié)果；2—質(zhì)粒pET28a鑒定結(jié)果；3—重組子pET28a-AmPR-10雙酶切鑒定結(jié)果；B：重組子pET30a-AmPR-10鑒定結(jié)果，1—AmPR-10的PCR結(jié)果；2—質(zhì)粒pET30a鑒定結(jié)果；3—重組子pET30a-AmPR-10雙酶切鑒定結(jié)果。圖2 重組子鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of the recombinants

如圖3所示，以重組質(zhì)粒pET30a-skp-AmPR-10為模板，對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。條帶1、2為平行樣品，是對(duì)skp和AmPR-10構(gòu)成的全基因進(jìn)行PCR的鑒定結(jié)果，全長為957 bp，條帶位置符合預(yù)期大??；另將重組基因進(jìn)行測(cè)序，成功鑒定重組子。

注：M—Marker；1、2—skp與AmPR-10全基因PCR鑒定結(jié)果；3—skp PCR鑒定結(jié)果；4—AmPR-10 PCR鑒定結(jié)果。圖3 重組子pET30a-skp-AmPR-10鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of the recombinant pET30a-skp-AmPR-10

2.2 目的蛋白表達(dá)

通過比較重組子pET28a-AmPR-10和pET30a-AmPR-10的目的基因表達(dá)量，可分析標(biāo)簽S-tag在外源基因表達(dá)中的作用；根據(jù)重組子pET30a-skp-AmPR-10中目的基因可溶性表達(dá)量的變化，探討分子伴侶skp在外源基因表達(dá)中的作用。

圖4中，條帶1、2、3為pET28a-AmPR-10 蛋白表達(dá)情況，位置在17 kD附近，與文獻(xiàn)報(bào)道AmPR-10蛋白大小一致(16.8 kD)[5]，但可溶性表達(dá)量并不樂觀，大部分蛋白質(zhì)以包涵體形式存在(條帶3)；條帶4、5、6為pET30a-AmPR-10的表達(dá)情況，與前者相比，在相同條件下目的蛋白可溶性表達(dá)量有所提高，同時(shí)包涵體蛋白減少(條帶6)，因載體pET30a有S-tag標(biāo)簽修飾，故蛋白條帶位置高于前者，大小約為19 kD。

注：M—Marker；1、2—重組子pET28a-AmPR-10于37、16 ℃誘導(dǎo)可溶性蛋白表達(dá)結(jié)果；3—重組子pET28a-AmPR-10于16 ℃誘導(dǎo)包涵體蛋白表達(dá)結(jié)果；4、5—重組子pET30a-AmPR-10于37、16 ℃誘導(dǎo)可溶性蛋白表達(dá)結(jié)果；6—重組子pET30a-AmPR-10于16 ℃誘導(dǎo)包涵體蛋白表達(dá)結(jié)果；7—未誘導(dǎo)對(duì)照。圖4 重組子pET28a-AmPR-10與重組子pET30a-AmPR-10蛋白表達(dá)結(jié)果比較Fig.4 Comparison of protein expression between recombinant pET28a-AmPR-10 and pET30a-AmPR-10

由圖4可確定16 ℃低溫誘導(dǎo)條件下，各重組子的可溶性蛋白表達(dá)量更高，故在此條件下，對(duì)重組子pET30a-AmPR-10和pET30a-skp-AmPR-10的外源蛋白可溶性表達(dá)情況進(jìn)行比較，如圖5所示，重組子pET30a-skp-AmPR-10的可溶性蛋白表達(dá)量進(jìn)一步提高，蛋白大小在34 kD附近(條帶2)，符合分子伴侶skp與目的基因AmPR-10融合表達(dá)的結(jié)果。

注：M—Marker；1—未誘導(dǎo)對(duì)照；2、3—重組子pET30a-skp-AmPR-10、pET30a-AmPR-10于16 ℃誘導(dǎo)可溶性蛋白表達(dá)結(jié)果。圖5 重組子pET30a-AmPR-10與重組子pET30a-skp-AmPR-10蛋白表達(dá)結(jié)果比較Fig.5 Comparison of protein expression between recombinant pET30a-AmPR-10 and pET30a-skp-AmPR-10

2.3 目的蛋白結(jié)構(gòu)模擬分析

2.3.1S-tag對(duì)蛋白外源表達(dá)的影響 載體pET30a和pET28a的區(qū)別是前者含有S-tag標(biāo)簽，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)源于地衣芽孢桿菌的漆酶N端融合S-tag構(gòu)建于pET-22b 載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)后可顯著提高其在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)量，大約提高20倍[17]。本研究對(duì)S-tag修飾前后的AmPR-10分別進(jìn)行建模分析，通過chimera軟件分析發(fā)現(xiàn)目的蛋白空間構(gòu)象的變化：①圖6顯示AmPR-10在經(jīng)S-tag修飾后，第一段α螺旋結(jié)構(gòu)得以延長，增加了2個(gè)氨基酸，為39位Val和40位Thr，Val是疏水性氨基酸，Thr是極性氨基酸易形成氫鍵，二者加強(qiáng)了α螺旋的穩(wěn)定性；②圖7顯示原91位Asp、92位Ala及93位Asn是連接2段β折疊的linker，經(jīng)S-tag修飾表達(dá)后，該部分形成了1段短α螺旋，且Ala為疏水性氨基酸，同樣有利于增強(qiáng)此段α螺旋的穩(wěn)定性[18]。有文獻(xiàn)表明，α螺旋結(jié)構(gòu)有利于提高蛋白穩(wěn)定性[19]，因此，重組子pET30a-AmPR-10表達(dá)量高于pET28a-AmPR-10，可能是由于載體pET30a上的S-tag與目標(biāo)蛋白融合，增加了α螺旋結(jié)構(gòu)的比例，由此提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高可溶性表達(dá)量。

2.3.2分子伴侶skp對(duì)蛋白外源表達(dá)的影響

圖8A所示為AmPR-10的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖，通過SOPMA分析，其α螺旋占比約為36.08%；圖8B為skp與AmPR-10融合表達(dá)的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖，圖中Ⅰ部分表示AmPR-10的三級(jí)結(jié)構(gòu)，Ⅱ部分表示skp的三級(jí)結(jié)構(gòu)，2個(gè)部分由“l(fā)inker”相連，如圖中虛線所示，且skp與AmPR-10的N末端結(jié)合。分子伴侶幫助目標(biāo)蛋白正確折疊，在天然宿主體內(nèi)，最后會(huì)被切去，并不成為成熟蛋白的一部分。由圖8B顯示，模擬結(jié)果符合分子伴侶的定義，skp與AmPR-10各自獨(dú)立表達(dá)，skp不影響AmPR-10的空間結(jié)構(gòu)。由于在外源大腸桿菌宿主內(nèi)，缺失切除分子伴侶skp的酶催化系統(tǒng)，因此2個(gè)部分以linker連接的方式融合表達(dá)，而skp主要由α螺旋結(jié)構(gòu)組成，因此使得由其與AmPR-10共同構(gòu)成的全蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋比例提高，根據(jù)軟件計(jì)算分析，可達(dá)78.87%，進(jìn)而提高全蛋白的疏水性，使蛋白空間構(gòu)象更加穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)重組子pET30a-skp-AmPR-10可溶性蛋白表達(dá)量提高的目的。

圖6 S-tag修飾前、后39位Val、40位Thr空間構(gòu)象Fig.6 Spatial conformations of 39 Val and 40Thr before and after the S-tag modification

圖7 S-tag修飾前、后91位Asp、92位Ala、93位Asn空間構(gòu)象Fig.7 Spatial conformations of 91 Asp 、92 Ala and 93 Asn before and after the S-tag modification

2.4 目的蛋白純化與活性測(cè)定

標(biāo)簽S-tag和分子伴侶skp的修飾可提高AmPR-10在大腸桿菌內(nèi)的可溶性表達(dá)量，為進(jìn)一步探討融合表達(dá)是否對(duì)目的蛋白生物活性有影響，研究對(duì)3種重組子表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，按照洗脫液(咪唑)濃度分別為62.5、125及250 mmol·L-1進(jìn)行梯度洗脫，通過SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，如圖9所示。

A：AmPR-10三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模擬圖；B：skp與AmPR-10融合表達(dá)圖8 AmPR-10以及skp與AmPR-10融合表達(dá)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模擬圖Fig.8 The prediction for the 3D structure of AmPR-10 and the fusion protein of skp and AmPR-10

注：M—Marker；1～3—重組子pET28a-AmPR-10表達(dá)蛋白純化結(jié)果；4～6—重組子pET30a-AmPR-10表達(dá)蛋白純化結(jié)果；7～9—重組子pET30a-skp-AmPR-10表達(dá)蛋白純化結(jié)果；洗脫液濃度均依次為62.5、125、250 mmol·L-1。圖9 目標(biāo)蛋白梯度洗脫結(jié)果Fig.9 Gradient elution results of target protein

圖9中顯示洗脫液較高濃度時(shí)，目標(biāo)蛋白純化效果較好。測(cè)定各蛋白濃度，檢測(cè)出目的蛋白均對(duì)酵母tRNA有催化活性，平均值為1.1 U·mg-1，相差不大。說明AmPR-10外源可溶性表達(dá)量的提高是以不影響蛋白質(zhì)生物活性為基礎(chǔ)的。

3 討論

植物病程相關(guān)蛋白PR-10是植物體防御體系的重要組成部分，很多蛋白質(zhì)都已被外源表達(dá)，如辣椒病程相關(guān)蛋白PR-10體外重組后，可抑制辣椒疫霉菌的菌絲生長[20]；刺茄重組病程相關(guān)蛋白PR-10可以抑制稻瘟病菌菌絲的生長[21]；外源表達(dá)的三七病程相關(guān)蛋白對(duì)腐皮鐮刀菌和壞損柱孢菌具有抑制作用[22]；本生煙病程相關(guān)蛋白經(jīng)原核表達(dá)后成功進(jìn)行了抗血清制備[23]等。蒙古黃芪病程相關(guān)蛋白AmPR-10具有核酸酶活性，與其抗RNA類病毒相關(guān)，因此獲得大量的具有活性的外源蛋白，有利于后期生物性能的相關(guān)研究。目前有關(guān)AmPR-10的報(bào)道還局限于從天然蒙古黃芪中提取，本研究首次建立目標(biāo)蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)體系，通過更換載體，提高AmPR-10的外源表達(dá)量，探討并確定了載體標(biāo)簽S-tag和分子伴侶skp的生物學(xué)功能，利用S-tag和skp的累加效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)獲得大量外源可溶性AmPR-10的目標(biāo)，為其活性研究做基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他同源相關(guān)蛋白的體外表達(dá)提供可參考策略。需要注意的是，目前AmPR-10展現(xiàn)的核酸酶活性并不理想，也沒有文獻(xiàn)報(bào)道其有關(guān)抑菌作用的活性，因此后期可考慮深入其生物學(xué)活性的探索。通過基因進(jìn)化等相關(guān)技術(shù)獲得高活性或?qū)Φ孜镉袕V譜性催化作用的目的蛋白，不僅有利于理解黃芪生長發(fā)育、抗病免疫的機(jī)制，對(duì)于抗病毒抗菌制劑的開發(fā)也具有重要意義。