郭宏偉，趙緒永，李華瑋，張 震，馬 輝，鄭 鳴

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州 450011)

1985年，美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)，使得在體外條件進(jìn)行核酸片段的無(wú)限擴(kuò)增成為可能，但是該方法存在操作繁瑣、交叉污染風(fēng)險(xiǎn)較高等不足。1992年，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的誕生不僅一定程度上避免了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的缺陷，還能夠通過(guò)熒光信號(hào)、Ct值和靶基因的起始濃度3個(gè)參數(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物或基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。但是，由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的絕對(duì)定量依賴(lài)于Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，使得所謂的“絕對(duì)定量”在一定程度上只是相對(duì)的。同時(shí)，盡管實(shí)時(shí)熒光定量PCR在敏感性上能比傳統(tǒng)PCR技術(shù)提高至少1個(gè)數(shù)量級(jí)，但是對(duì)于低拷貝的靶基因、模板差異倍數(shù)不大的情況下，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的檢測(cè)敏感性和精確度會(huì)受到限制。隨著低豐度樣品檢測(cè)、基因突變檢測(cè)應(yīng)用需求的日益增加，真正可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量的數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[1]。本文主要針對(duì)數(shù)字PCR的發(fā)展歷史、技術(shù)原理、與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比的優(yōu)缺點(diǎn)以及在動(dòng)物疫病診斷中的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述，以期為提升動(dòng)物疫病分子診斷能力提供借鑒。

1 數(shù)字PCR的發(fā)展歷史

1999年，美國(guó)約翰·霍普金斯大學(xué)的Vogelstein B等[2]首次提出了數(shù)字PCR(digital polymerase chain reaction)的概念，并在96孔板和384孔板上實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸癌的致癌突變基因Kras進(jìn)行了定量分析。但是此時(shí)的數(shù)字PCR方法是比較原始的、需要大量手工操作的勞動(dòng)密集型技術(shù)，難以廣泛應(yīng)用[1]。隨著微流體技術(shù)和納米制造技術(shù)的進(jìn)步，數(shù)字PCR技術(shù)也迎來(lái)了突破技術(shù)瓶頸的契機(jī)。2006年，F(xiàn)luidigm公司利用其微流控技術(shù)的優(yōu)勢(shì)推出了第一臺(tái)基于芯片的商品化數(shù)字PCR平臺(tái)，可將48個(gè)樣品分布在770個(gè)微反應(yīng)單元中。Quanta Life公司利用油包水微滴生成技術(shù)開(kāi)發(fā)的微滴式數(shù)字PCR技術(shù)也是最早出現(xiàn)的相對(duì)成熟的數(shù)字PCR平臺(tái)。2011年Quanta Life公司被Bio-Rad公司收購(gòu)，其微滴數(shù)字PCR平臺(tái)更名為QX100TM型號(hào)繼續(xù)在市場(chǎng)進(jìn)行銷(xiāo)售。Bio-Rad公司的微滴數(shù)字PCR平臺(tái)也是目前我國(guó)應(yīng)用比較廣泛的一個(gè)品牌。2012年，Rain Dance公司推出的RaindropTM數(shù)字PCR設(shè)備將其原有的二代測(cè)序文庫(kù)制備平臺(tái)技術(shù)移植到數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)，適用于處理更大濃度差異的樣品類(lèi)型。2013年，Life technologies公司推出了Quant Studio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用高密度的納升流控芯片技術(shù)，樣品被均勻分配至20 000個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)孔中，可以有效防止樣品交叉污染，簡(jiǎn)化了操作步驟[3]。在我國(guó)《“十三五”國(guó)家科技創(chuàng)新規(guī)劃》中，已經(jīng)將“突破微流控芯片、單分子檢測(cè)、自動(dòng)化核酸檢測(cè)等關(guān)鍵技術(shù)、開(kāi)發(fā)全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)”作為一項(xiàng)國(guó)家戰(zhàn)略。近年來(lái)，我國(guó)的北京新羿生物科技有限公司、西安天隆科技有限公司、蘇州銳訊生物科技有限公司等多家公司已經(jīng)開(kāi)始了數(shù)字PCR平臺(tái)的研發(fā)工作，相信不久的將來(lái)市場(chǎng)上就會(huì)有國(guó)產(chǎn)品牌的數(shù)字PCR出現(xiàn)。

2 數(shù)字PCR技術(shù)原理

數(shù)字PCR的原理可以理解為分散成無(wú)數(shù)個(gè)獨(dú)立反應(yīng)單元的定量PCR，從而實(shí)現(xiàn)單分子意義上的絕對(duì)定量檢測(cè)，也可以將數(shù)字PCR采用的策略簡(jiǎn)單地理解為對(duì)每個(gè)模板分子分別進(jìn)行“單分子模板PCR擴(kuò)增”。即將1個(gè)樣本稀釋并分成數(shù)百個(gè)甚至數(shù)百萬(wàn)個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元，使得所有獨(dú)立的反應(yīng)單元中包含或者不包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的DNA模板分子，進(jìn)而對(duì)所有獨(dú)立的反應(yīng)單元進(jìn)行平行擴(kuò)增。數(shù)字PCR采用終點(diǎn)定量的方法進(jìn)行分析，即在擴(kuò)增結(jié)束后讀取各個(gè)反應(yīng)單元的陰性或者陽(yáng)性熒光信號(hào)并采用泊松分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，就可以計(jì)算出原始樣本的模板拷貝數(shù)[4]。

3 數(shù)字PCR的優(yōu)缺點(diǎn)

數(shù)字PCR的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在：數(shù)字PCR是一種絕對(duì)定量的PCR技術(shù)，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，其定量過(guò)程不需要依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，當(dāng)在缺乏合適的參考物或校準(zhǔn)物的情況下進(jìn)行定量時(shí)，數(shù)字PCR的這一優(yōu)勢(shì)就愈發(fā)明顯；數(shù)字PCR定量的精確性更高，但是當(dāng)分析物中模板的濃度非常低時(shí)，會(huì)因?yàn)閿?shù)字PCR反應(yīng)體系中不同分區(qū)里模板的隨機(jī)分布差異而引起其精確性降低[5-6]；數(shù)字PCR反應(yīng)體系中，分析物的目的序列被分配到多個(gè)獨(dú)立反應(yīng)體系中，可以顯著降低背景信號(hào)和抑制物(如SDS、EDTA和肝素等)對(duì)反應(yīng)過(guò)程的干擾，基質(zhì)效應(yīng)大大降低。數(shù)字PCR的這一優(yōu)勢(shì)在檢測(cè)環(huán)境樣品和糞便樣品時(shí)最為明顯[3,7-8]。

數(shù)字PCR的不足主要包括：數(shù)字PCR檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍受到最大分區(qū)數(shù)的限制，對(duì)于模板濃度過(guò)高的樣品需要預(yù)先對(duì)檢測(cè)樣品的模板進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)荒承?shù)字PCR平臺(tái)的檢測(cè)通量比實(shí)時(shí)熒光定量PCR低，且操作步驟更加復(fù)雜；某些數(shù)字PCR平臺(tái)(如微滴數(shù)字PCR系統(tǒng))在對(duì)反應(yīng)體系分區(qū)和數(shù)據(jù)讀取的時(shí)候存在引入污染的風(fēng)險(xiǎn)；除此之外，數(shù)字PCR使用過(guò)程中還需要專(zhuān)門(mén)的儀器和耗材，單次檢測(cè)的成本明顯比實(shí)時(shí)熒光定量PCR要高[7]。以Bio-Rad公司的QX200微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)為例，其單次檢測(cè)試劑和耗材的價(jià)格就高達(dá)180元人民幣。昂貴的儀器和試劑耗材是目前阻礙數(shù)字PCR技術(shù)大范圍推廣的主要瓶頸。

4 數(shù)字PCR技術(shù)在動(dòng)物疫病診斷中的應(yīng)用

4.1 病毒檢測(cè)

4.1.1 非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV) 核酸類(lèi)檢測(cè)方法是目前非洲豬瘟診斷的主要方法，當(dāng)檢測(cè)含有較多量病毒的唾液、血液、組織等樣品時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和等溫?cái)U(kuò)增等核酸檢測(cè)技術(shù)尚能夠勝任，但是在檢測(cè)飼料、食品、環(huán)境中微量的ASFV時(shí)，這些方法的敏感性就會(huì)存在一定的局限性。鄔旭龍等[9]以ASFV的K205R基因作為診斷靶標(biāo)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和TaqMan探針，建立了診斷ASFV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR和微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法，該方法最低檢測(cè)限為約20拷貝/反應(yīng)體系，敏感性比使用相同引物探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR高10倍，具有良好的敏感性和特異性，由于文章發(fā)表時(shí)ASFV并未傳入我國(guó)，作者未使用該方法對(duì)臨床陽(yáng)性樣品的檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)估。原霖等[10]基于《OIE陸生動(dòng)物診斷與疫苗手冊(cè)》中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法也建立了ASFV微滴數(shù)字PCR方法，該方法的最低檢測(cè)限可以到達(dá)0.8 copies/μL，敏感性高于OIE推薦的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，與豬瘟病毒(Classical swine fever，CFSV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬圓環(huán)病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)等豬常見(jiàn)的6種病毒均不發(fā)生交叉反應(yīng)，而且重復(fù)性較好。使用該微滴數(shù)字PCR與OIE推薦的實(shí)時(shí)熒光定量PCR同時(shí)對(duì)78份臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，符合率可以達(dá)到100%。鑒于數(shù)字PCR的高敏感性和對(duì)不同樣品中抑制成分的高耐受性，可以充分彌補(bǔ)實(shí)時(shí)熒光定量PCR在檢測(cè)飼料、食品、環(huán)境樣品中極低含量的ASFV時(shí)的不足，對(duì)于非洲豬瘟的防控具有重要意義。

4.1.2 豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV) 原霖等[11]以PCV1的ORF1基因作為診斷靶標(biāo)，建立了可以對(duì)該病毒準(zhǔn)確定量的微滴數(shù)字PCR方法，該方法的最低檢測(cè)限可達(dá)到7.8拷貝/20 μL，且與豬常見(jiàn)的病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，在臨床樣品的檢測(cè)中檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果一致。趙珊[12]以PCV2的ORF2基因?yàn)樵\斷靶標(biāo)，建立了一種微滴數(shù)字PCR方法，不僅可用于豬血清和豬內(nèi)臟組織等樣品的檢測(cè)，還可用于PCV2疫苗半成品中PCV2病毒含量的測(cè)定。該方法的最低檢測(cè)限為25拷貝/μL，其敏感性比實(shí)時(shí)熒光定量PCR高4倍，且不與PCV1、PRV、PPV、PRRSV和CSFV等豬易感的常見(jiàn)病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。使用上述兩種方法對(duì)PCV2疫苗半成品中的病毒含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，微滴數(shù)字PCR的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的TCID50方法測(cè)定的結(jié)果一致性更高。石磊等[13]針對(duì)PCV3的ORF2基因序列建立了用于該病毒檢測(cè)的微滴數(shù)字PCR方法。該方法的最低檢測(cè)限達(dá)到4.4拷貝/μL，且與PCV1、PCV2、PRRSV、APP、PRV、PPV和CSFV等常見(jiàn)豬病病原無(wú)交叉反應(yīng)。在進(jìn)行臨床樣品的檢測(cè)時(shí)，PCV3微滴數(shù)字PCR方法比實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的靈敏度高10倍，其檢測(cè)結(jié)果不僅與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定性結(jié)果一致，還能夠?qū)梢傻臉颖具M(jìn)行定量分析，從而實(shí)現(xiàn)確診。除此之外，Liu Y等[14]和Zhang U等[15]也采用了微滴數(shù)字PCR平臺(tái)建立了針對(duì)PCV3的高敏感性檢測(cè)方法，最低檢測(cè)限分別達(dá)到1.68拷貝反應(yīng)體系± 0.29拷貝/反應(yīng)體系和1拷貝/μL。鑒于這些PCV3的檢測(cè)方法與前文中提到的類(lèi)似，敏感性都優(yōu)于相應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR并有良好的特異性，在此不做展開(kāi)論述。

在多重檢測(cè)方面，Liu Y等[16]應(yīng)用微滴數(shù)字PCR平臺(tái)建立了同時(shí)可以PCV2和PCV3的二重微滴數(shù)字PCR方法，該方法對(duì)于PCV2和PCV3的最低檢測(cè)限分別為2拷貝/μL和1拷貝/μL，比對(duì)應(yīng)的二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)要分別敏感3倍和10倍。在對(duì)300份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)PCV2的檢測(cè)結(jié)果微滴數(shù)字PCR方法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR一致，而對(duì)PCV3的檢測(cè)，微滴數(shù)字PCR方法多檢測(cè)到了3份臨床樣品。由于PCV對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害較大，以及新發(fā)現(xiàn)的PCV3引起人們的高度重視，在各種動(dòng)物疫病的數(shù)字PCR檢測(cè)方法中，PCV數(shù)字PCR檢測(cè)方法的研究數(shù)量是最多的。這些單項(xiàng)和多重?cái)?shù)字PCR的建立，也為未來(lái)PCV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平的提升提供了有力的技術(shù)保障。

4.1.3 偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV) 為建立用于PRV檢測(cè)的微滴數(shù)字PCR方法，陳亞娜等[17]以PRV的gB基因作為靶基因，建立了可對(duì)其準(zhǔn)確定量的微滴數(shù)字PCR方法。該方法的最低檢測(cè)限為6.1拷貝/μL，比實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的敏感性高25倍，且特異性良好。在對(duì)臨床樣品的檢測(cè)中，該微滴數(shù)字PCR方法與病毒分離相比，符合率為97%。蘭德松等[18]分別針對(duì)PRV的gD和gE基因，設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物和探針，建立了分別針對(duì)PRV gD和gE基因的微滴數(shù)字PCR方法。該方法的對(duì)gD和gE基因的最低檢測(cè)限分別為3.9拷貝/μL和2.3拷貝/μL，比相應(yīng)的檢測(cè)gD和gE基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性分別高10倍和5倍。同時(shí)，該方法的特異性好，批內(nèi)和批間重復(fù)性的變異系數(shù)都較小，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的符合率為95.6%。值得注意的是，蘭德松等建立的針對(duì)gD和gE基因的檢測(cè)方法是兩個(gè)獨(dú)立的微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行的，如果能夠進(jìn)一步優(yōu)化建立同時(shí)檢測(cè)這兩個(gè)基因的二重微滴數(shù)字PCR方法，將具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

4.1.4 其他動(dòng)物病毒 Yang Q等[19]基于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ORF7建立了微滴數(shù)字PCR方法，該方法比實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感10倍左右，對(duì)125份疑似感染PRRSV的臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果中，微滴數(shù)字PCR方法比實(shí)時(shí)熒光定量PCR多檢測(cè)出9份陽(yáng)性樣品。

Wu X等[20]建立了用于日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)檢測(cè)的微滴數(shù)字PCR方法，該方法的最低檢測(cè)限可以達(dá)到2拷貝/20 μL，比實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR敏感100倍，且具有較好的特異性。在對(duì)103份豬臨床樣品的檢測(cè)中，微滴數(shù)字PCR的陽(yáng)性檢出率比實(shí)時(shí)熒光定量PCR高了10.7%，這意味著該方法能夠檢測(cè)出更高效的對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。

除目前已發(fā)表的上述用于檢測(cè)動(dòng)物病毒的數(shù)字PCR方法，中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心等單位也起草了《高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒微滴式數(shù)字RT-PCR檢測(cè)方法(T/CVMA6-2018)》《豬繁殖與呼吸綜合征病毒微滴式數(shù)字RT-PCR檢測(cè)方法(T/CVMA7-2018)》《動(dòng)物A型流感病毒微滴式數(shù)字RT-PCR檢測(cè)方法(T/CVMA8-2018)》和《豬圓環(huán)病毒1型微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法(T/CVMA9-2018)》《豬圓環(huán)病毒2型微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法(T/CVMA10-2018)》《偽狂犬病病毒微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法(T/CVMA11-2018)》等多個(gè)中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)。這些團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布，說(shuō)明數(shù)字PCR技術(shù)在動(dòng)物疫病診斷中的重要作用正在得到整個(gè)行業(yè)越來(lái)越多的認(rèn)可。

4.2 細(xì)菌檢測(cè)

和病毒檢測(cè)的數(shù)字方法相比，用于細(xì)菌檢測(cè)的數(shù)字PCR的報(bào)道較少。石磊等[21]針對(duì)鏈球菌(Streptococcussuis，SS)中g(shù)dh基因的保守序列建立了可以對(duì)該細(xì)菌精確定量的微滴數(shù)字PCR方法，使用陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)該方法最低檢測(cè)限測(cè)定的結(jié)果為2.69拷貝/μL。同時(shí)該方法也具有較好的特異性，與常見(jiàn)的病原菌如大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌、豬傳染性胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌、副豬嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌以及豬圓環(huán)病毒2型和偽狂犬病病毒等均無(wú)交叉反應(yīng)。

為了建立高敏感性的豬傳染性胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)檢測(cè)方法，石磊等[22]針對(duì)該細(xì)菌特異性基因apxⅣ的保守序列建立了微滴數(shù)字PCR方法，其最低檢測(cè)限為153.8拷貝/μL，比實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性提高兩倍，與其他常見(jiàn)豬病原無(wú)交叉反應(yīng)。110份臨床樣品的檢測(cè)中，該方法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的Kappa系數(shù)為0.952 9，表明這兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性高，并且微滴數(shù)字PCR可對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)法判定的可疑樣本進(jìn)行定量分析。

石磊等[23]學(xué)者還基于副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)中OMP P2基因的保守序列建立了可對(duì)該細(xì)菌準(zhǔn)確定量的微滴數(shù)字PCR方法。該方法的敏感性高，最低檢測(cè)限可達(dá)到2.65拷貝/μL，高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。特異性方面，該微滴數(shù)字PCR方法與多種豬常見(jiàn)的細(xì)菌性和病毒性病原均無(wú)交叉反應(yīng)。通過(guò)對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，該微滴數(shù)字PCR方法具有敏感性高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，其檢出率高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。

除此之外，郭瑛等[24]基于布魯氏菌的IS711插入基因的保守序列還建立了針對(duì)布魯氏菌檢測(cè)的微滴式數(shù)字PCR方法。通過(guò)使用該方法對(duì)從一名在布魯氏菌病急性期感染期且經(jīng)過(guò)抗生素治療6周后仍有臨床癥狀的患者的血清中檢測(cè)到了布魯氏菌的核酸，而對(duì)該患者的血液進(jìn)行分離培養(yǎng)也顯示為陽(yáng)性。鑒于血清中數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果與血液樣品分離培養(yǎng)結(jié)果吻合，可以看出數(shù)字PCR技術(shù)在布魯氏菌病患者治療效果判定中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。由于布魯氏菌是一種人獸共患病原，該方法在動(dòng)物布魯氏菌病的診斷中，尤其是在檢測(cè)大罐奶樣品、養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境樣品等病原含量較低的樣品時(shí)也具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

4.3 寄生蟲(chóng)檢測(cè)

近年來(lái)，寄生蟲(chóng)病數(shù)字PCR診斷方法的研究也較多，但是絕大多數(shù)研究是針對(duì)人類(lèi)易感的寄生蟲(chóng)病原的檢測(cè)[25]。在動(dòng)物疫病相關(guān)寄生蟲(chóng)的數(shù)字PCR檢測(cè)技術(shù)中，研究最多的日本血吸蟲(chóng)(Schistosomajaponicum)。Weerakoon K G等[26]基于日本血吸蟲(chóng)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子sjR2和nad1基因建立了一種用于日本血吸蟲(chóng)核酸檢測(cè)的雙重微滴數(shù)字PCR方法。該方法的最低檢測(cè)限可以達(dá)到0.05 fg模板DNA，遠(yuǎn)低于單個(gè)日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵的總DNA含量(約50 pg)。該方法與曼氏血吸蟲(chóng)(Schistosomamansoni)、豬帶絳蟲(chóng)(Taeniasolium)、肝片吸蟲(chóng)(Fascioliasishepatica)、縮小膜殼絳蟲(chóng)(Hymenolepisdiminuta)和細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusgranulosus)均無(wú)交叉反應(yīng)。VAN Dorssen C E等[27]采用數(shù)字PCR方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)山羊糞便中的日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵的核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果數(shù)字PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為46.4%，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR僅為6.9%。這說(shuō)明數(shù)字PCR技術(shù)可以作為日本血吸蟲(chóng)診斷和檢測(cè)的重要技術(shù)手段，尤其是流行率較低的地區(qū)。相比于低敏感性的顯微鏡觀察蟲(chóng)卵法和低特異性的血清學(xué)檢測(cè)方法，數(shù)字PCR方法可以對(duì)多種宿主樣品(如糞便、血清、尿液和唾液)中微量的寄生蟲(chóng)DNA進(jìn)行檢測(cè)，極大地提高了檢測(cè)的敏感性和準(zhǔn)確性。數(shù)字PCR技術(shù)的出現(xiàn)為提高寄生蟲(chóng)病診斷水平提供了必要的技術(shù)手段。

5 展望

作為最新一代的PCR檢測(cè)技術(shù)，數(shù)字PCR相比實(shí)時(shí)熒光定量PCR有著無(wú)以比擬的巨大優(yōu)勢(shì)，比如更高的敏感性和準(zhǔn)確度，能夠?qū)崿F(xiàn)絕對(duì)定量等。目前該技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)診斷、轉(zhuǎn)基因定量分析、物種鑒定、食品安全等越來(lái)越多的領(lǐng)域得到應(yīng)用。盡管由于較高的成本和比較繁瑣的操作步驟使得數(shù)字PCR目前還無(wú)法完全替代實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，但是隨著技術(shù)的進(jìn)步和商品化的發(fā)展，相信不久的將來(lái)，數(shù)字PCR技術(shù)一定能夠在動(dòng)物疫病診斷領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。