邢美毅，王欣悅，王 璐，關(guān)國(guó)平

(東華大學(xué) a. 紡織學(xué)院；b. 紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620)

心血管疾病每年造成全球死亡人數(shù)高達(dá)1 730萬(wàn)人，其中因冠狀動(dòng)脈阻塞造成的死亡占50%[1]，冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)是治療嚴(yán)重缺血性疾病的有效手段[2-3]。目前臨床應(yīng)用的小口徑(直徑<6 mm)血管仍以自體移植物為主[4]。但自體血管來源不足、血管尺寸不匹配以及原有疾病的限制，迫切需要研發(fā)替代品[5]。此外，存在現(xiàn)有的小口徑人工血管產(chǎn)品易誘發(fā)血栓、通暢率低，與天然血管的力學(xué)性能不匹配，影響移植物遠(yuǎn)期通暢率[6-8]等問題，適用于冠狀動(dòng)脈搭橋的小口徑人工血管產(chǎn)品不多。因此，開發(fā)綜合性能優(yōu)良的小口徑人工血管仍是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)水凝膠是一種具有高強(qiáng)度、高彈性的醫(yī)用水凝膠，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[8-9]。聚丙烯酰胺(polyacrylamide，PAAm)水凝膠具有生物惰性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，其生物相容性好，在體內(nèi)移植物、藥物控制釋放等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到應(yīng)用[10-11]。因此，開發(fā)具有互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的PVA/PAAm水凝膠，有望獲得綜合性能更好的生物醫(yī)用水凝膠材料。本研究設(shè)計(jì)并編織了一種PET管道，以增強(qiáng)PVA/PAAm水凝膠人工血管材料的力學(xué)性能，并系統(tǒng)表征了其與血液的相容性。

1 材料與方法

1.1 試劑

PVA，丙烯酰胺(acrylamide, AAm)，N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)，過硫酸銨(APS)，N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)，氯化鈉(NaCl)，氯化鉀(KCl)，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，磷酸二氫鉀(KH2PO4)，氯化鈣(CaCl2)，無(wú)水乙醇，戊二醛，多聚甲醛。

1.2 方法

1.2.1 編織管的設(shè)計(jì)成型

本研究選擇直徑為0.25 mm的滌綸單絲在32錠編織機(jī)上編織增強(qiáng)管，使用直徑為4 mm聚四氟乙烯管作為內(nèi)撐管，編織角分別為60°、65°和70°。編織管的管徑變化率[12]計(jì)算如式(1)所示。

(1)

式中:R為管徑變化率，%；D1和D2分別為編織管拉伸前和伸長(zhǎng)率為50%時(shí)的管內(nèi)徑，mm。

1.2.2 編織管增強(qiáng)的小口徑水凝膠人工血管的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[13]中的方法，先將PVA和AAm按照5∶8的質(zhì)量比在去離子水中混合成均勻的溶液。利用一次性注射器將混合溶液緩慢澆注至組裝好的管狀模具中，得到管狀預(yù)凝膠(若制備增強(qiáng)水凝膠人工血管需要先將滌綸編織管固定于模具中)。然后使管狀凝膠在室溫下干燥并在真空干燥箱中退火，80 ℃下3 h，120 ℃下1 h。將干凝膠浸泡在去離子水中達(dá)到吸水平衡以獲得小口徑水凝膠人工血管(hydrogel vascular graft, HVG)和編織管增強(qiáng)的小口徑水凝膠人工血管(reinforced hydrogel vascular graft, RHVG)。這兩種人工血管采用文獻(xiàn)[14]中優(yōu)化后的水凝膠材料制備，即PVA與PAAm質(zhì)量比為5∶8的水凝膠。

1.2.3 HVG和RHVG的拉伸性能

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)ISO 7198: 2016，使用YG(B)026G-500型單軸向拉伸強(qiáng)力儀對(duì)HVG和RHVG進(jìn)行軸向定伸長(zhǎng)拉伸強(qiáng)度和周向拉伸斷裂強(qiáng)度測(cè)試。軸向拉伸定伸長(zhǎng)率為50%，試樣的長(zhǎng)度為70 mm，隔距為50 mm，拉伸速度為50 mm/min，樣本重復(fù)數(shù)n=3。定伸長(zhǎng)停留時(shí)間為5 s。采用直徑為3 mm的血管周向拉伸夾頭，試樣長(zhǎng)度為20 mm，拉伸速度為50 mm/min，樣本重復(fù)數(shù)n=3。試驗(yàn)后計(jì)算并取平均值。

1.2.4 縫合線固位強(qiáng)力

根據(jù)ISO 7198: 2016，使用YG(B)026G-500型單軸向拉伸強(qiáng)力儀對(duì)HVG和RHVG進(jìn)行縫合線固位強(qiáng)力測(cè)試。試樣長(zhǎng)度為20 mm，隔距為15 mm，試樣重復(fù)測(cè)試數(shù)n=3，試驗(yàn)后計(jì)算平均值。試驗(yàn)時(shí)，將試樣一端固定于夾具的下夾頭，另一端在距邊緣2 mm的位置，被5-0帶針縫合線穿過后，將縫合線固定于上夾頭。上夾頭以50 mm/min的速度勻速運(yùn)動(dòng)，向上拉伸縫合線直到試樣破裂。

1.2.5 徑向順應(yīng)性

動(dòng)脈順應(yīng)性[15]是血管壁的內(nèi)在彈性特性。順應(yīng)性不匹配易在人工血管內(nèi)形成血栓，并導(dǎo)致吻合口內(nèi)膜異常增生。故本研究采用BioDynamic Test Instrument (BOSE公司)平臺(tái)對(duì)HVG、RHVG及商用e-PTFE管進(jìn)行徑向動(dòng)態(tài)順應(yīng)性測(cè)試。樣本重復(fù)測(cè)試數(shù)n=3，結(jié)果取平均值。其中，水流流速為100 mL/min，頻率為1 Hz，測(cè)試壓強(qiáng)分別為6.65～11.97 kPa(50～90 mmHg)、10.64～15.96 kPa(80～120 mmHg)、14.63～19.95 kPa(110～150 mmHg)。按照式(2)計(jì)算徑向順應(yīng)性[16]。

(2)

式中：C為順應(yīng)性，%/13.3 kPa；Rp1、Rp2和R分別表示低壓、高壓和不加壓時(shí)對(duì)應(yīng)的試樣外半徑值，mm；p1和p2分別為低壓和高壓值，kPa。

1.2.6 溶血試驗(yàn)

血樣取自健康新西蘭大白兔耳動(dòng)脈，通過多次洗滌抗凝全血并離心后得到沉淀的紅細(xì)胞。將紅細(xì)胞與磷酸鹽緩沖液(PBS)按1∶34比例混合均勻得到富含紅細(xì)胞的溶液(red blood cells, RBC)。RBC用于測(cè)試RHVG的溶血性能，并與PVA水凝膠和PAAm水凝膠的溶血性能進(jìn)行對(duì)比。將3種材料切成1 cm3的試樣，用去離子水將其充分洗滌干凈，自然風(fēng)干表面后，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精蒸汽滅菌12 h。試驗(yàn)時(shí)，需將3種試樣分別浸泡在1 mL RBC和4 mL PBS的混合溶液中，并在37 ℃的恒溫箱中孵育2 h后，再于5 000 r/min條件下對(duì)溶液離心5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定上清液在540 nm處的吸光度。陽(yáng)性對(duì)照組為1 mL RBC和4 mL去離子水的混合溶液，陰性對(duì)照組為1 mL RBC和4 mL PBS的混合溶液。溶血率(H)按照式(3)計(jì)算[17-18]。

(3)

式中：H為溶血率，%；Dt、Dnc和Dpc分別為試樣、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度。

1.2.7 凝血試驗(yàn)

將PVA、PAAm和RHVG 3種水凝膠剪成直徑為14 mm、厚度為3 mm的圓形試樣置于24孔板中。取載玻片作為陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)孔中加入100 μL全血和20 μL的CaCl2溶液(0.2 mol/L)。試樣在37 ℃條件下，分別孵育5、10、30、60 min后取出。每孔中再加入2.5 mL去離子水，繼續(xù)在37 ℃下孵育5 min。將上清液取出，置于離心管中振蕩混勻，在室溫下靜置15 min后，測(cè)試上清液的吸光度為540 nm。凝血指數(shù)(B)[19]計(jì)算如式(4)所示。

(4)

式中：It為試樣的吸光度；Iw為2.5 mL去離子水加100 μL全血所得混合溶液的吸光度值。

1.2.8 血小板黏附試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[20]中的試驗(yàn)方法，將含有抗凝劑的全血在1 500 r/min的條件下離心10 min，取上下兩層中間的薄弱層，獲得富含血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)。將3種試樣分別裁剪成直徑為14 mm的圓片，厚度為3 mm，置于24孔板內(nèi)。將500 μL PRP滴加在試樣表面，37 ℃靜置2 h后用生理鹽水浸洗3次，并用PBS清洗3次，每次5 min。再用1 mL 體積分?jǐn)?shù)為2%的戊二醛溶液固定黏附在材料表面的血小板，室溫下固定24 h。然后，依次用體積分?jǐn)?shù)分別為55%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精溶液進(jìn)行梯度脫水(加入1 mL酒精溶液，脫水時(shí)間為5 min)。試樣冷凍干燥后運(yùn)用SEM觀察血小板在材料表面的黏附情況。

1.2.9 全血凝固試驗(yàn)

參照血小板黏附試驗(yàn)操作，將試樣置于24孔板中，加入1 mL的PBS浸潤(rùn)試樣，置于37 ℃搖床中，靜置2 h。取0.2 mL含有凝血?jiǎng)┑娜糜?4孔板中的試樣上，靜置于37 ℃的搖床中1 h。然后，取出24孔板，用PBS對(duì)試樣進(jìn)行輕柔清洗，重復(fù)3次。試樣經(jīng)清洗后，每孔加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液，置于4 ℃冰箱中，進(jìn)行固定12 h。再依次用體積分?jǐn)?shù)分別為50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精溶液進(jìn)行梯度脫水(加入3 mL酒精溶液，脫水時(shí)間為5 min)。脫水后的試樣經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行SEM觀察。

1.2.10 血漿復(fù)鈣試驗(yàn)

將3種試樣分別裁剪成1 cm2的小塊，置于24孔板的孔中，試樣重復(fù)數(shù)為3?？瞻卓鬃鳛閷?duì)照組。向試驗(yàn)組和對(duì)照組的每孔中分別滴加500 μL貧血小板血漿，在37 ℃下100 r/min振蕩1 h，之后將血漿轉(zhuǎn)移至96孔板中。每個(gè)試樣取3次。試驗(yàn)組每孔加入100 μL的CaCl2溶液(0.1 mol/L)，對(duì)照組每孔加入100 μL的PBS。用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。每30 s測(cè)1次吸光度，連測(cè)45 min后獲得血漿復(fù)鈣動(dòng)力學(xué)曲線[21]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 編織管的管徑變化率

不同編織角的滌綸編織管的管徑變化率如表1所示。由表1可知，當(dāng)編織角為(65.0±0.5)°時(shí)，編織管的管徑變化率與HVG的最為接近。為了最大限度地保證二者在形變過程中的同步性、避免RHVG在拉伸過程中的兩相分離。最終選擇編織角為(65.0±0.5 )°、內(nèi)徑為4 mm、長(zhǎng)度為9 cm的滌綸編織管作為增強(qiáng)體。

表1 編織角對(duì)管徑變化率的影響

2.2 編織管、HVG和RHVG的外觀形態(tài)

編織管、HVG和RHVG的外觀形態(tài)如圖1所示。由圖1可知，HVG與RHVG結(jié)構(gòu)均勻、表面光滑，編織管結(jié)構(gòu)規(guī)整、孔徑均勻。RHVG的內(nèi)徑為3 mm， 外直徑為5 mm，編織管直徑約為4 mm。

(a) HVG

(b) 編織管

(c) RHVG

2.3 拉伸性能

HVG和RHVG的周向拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖2所示。由圖2可知，RHVG的斷裂應(yīng)力明顯比HVG更高，但斷裂應(yīng)變不如HVG。這表明編織管的復(fù)合顯著增強(qiáng)了水凝膠的徑向拉伸應(yīng)力，但限制了其伸長(zhǎng)。但是，二者的斷裂應(yīng)變?nèi)匀欢荚?00%以上，說明HVG與RHVG都具有良好的徑向彈性。

圖2 HVG和RHVG的周向拉伸斷裂應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig.2 Stress-strain curves of circumferential tensile breaking of the HVG and the RHVG

HVG和RHVG在軸向拉伸應(yīng)變?yōu)?0%時(shí)的拉伸應(yīng)力如圖3所示。由圖3可知，HVG和RHVG的軸向拉伸應(yīng)力分別為(79.29±5.25) 和(273.28±15.08) kPa，而對(duì)照材料豬頸總動(dòng)脈拉伸應(yīng)力約為176 kPa[12]。因此，編織管不僅明顯增強(qiáng)了HVG的力學(xué)性能，而且表明RHVG的軸向拉伸性能足以滿足臨床移植要求。

圖3 HVG和RHVG的軸向拉伸應(yīng)力 (*, P<0.05)Fig.3 The axial tensile stress of the HVG and the RHVG (*, P<0.05)

2.4 縫合線固位強(qiáng)力

HVG和RHVG的縫合線固位強(qiáng)力測(cè)試結(jié)果如圖4所示。RHVG的縫合線固位強(qiáng)力為(8.65±0.33) N，明顯高于HVG的縫合線固位強(qiáng)力(3.74±0.41) N。該結(jié)果表明，編織管提高了水凝膠的縫合線固位強(qiáng)力。臨床上使用的血管移植物的縫合線固位強(qiáng)力的最低要求不得低于1 N[22]，說明本研究制備的RHVG能夠滿足臨床的縫合要求。

圖4 HVG和RHVG的縫合線固位強(qiáng)力 (*, P<0.05)Fig.4 Suture retention forces of the HVG and the RHVG (*, P<0.05)

圖5 HVG、RHVG和商用e-PTFE人工血管的徑向順應(yīng)性 (*, P<0.05)Fig.5 Radial compliance of the HVG, the RHVG and the commercial e-PTFE vascular prosthesis (*, P<0.05)

2.5 徑向順應(yīng)性

HVG、RHVG和商用e-PTFE人工血管的徑向順應(yīng)性測(cè)試結(jié)果如圖5所示。在各測(cè)試壓強(qiáng)范圍下，RHVG的徑向順應(yīng)性都比商用的e-PTFE人工血管的高，但低于HVG。由此表明，水凝膠用作人工血管材料，在提高徑向順應(yīng)性方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)。編織管的復(fù)合可明顯提高水凝膠人工血管材料的力學(xué)性能，包括軸向和周向抗拉伸性能和縫合線固位強(qiáng)力，但是限制了HVG的自由變形，導(dǎo)致伸長(zhǎng)率和順應(yīng)性降低。在人體正常血壓范圍下，RHVG的順應(yīng)性也達(dá)到了(4.58±0.76)%/13.3 kPa，最高為(4.82±0.57)%/13.3 kPa，非常接近天然血管的順應(yīng)性值，更是商用e-PTFE人工血管的5.1倍。力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果均表明，本研究制備的RHVG的力學(xué)性能優(yōu)異，能夠滿足臨床移植的力學(xué)要求。

2.6 溶血試驗(yàn)

溶血試驗(yàn)是材料與血紅細(xì)胞接觸時(shí)對(duì)紅細(xì)胞的破壞作用。材料的血液相容性越好，溶血率越小。PVA、RHVG、PAAm試樣的溶血率測(cè)試結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，3種試樣的溶血率均小于ASTM F 76-08標(biāo)準(zhǔn)中的2%，說明三者均具有良好的血液相容性。

表2 3種試樣的溶血率Table 2 Hemolysis rate of three samples

2.7 凝血試驗(yàn)

根據(jù)凝血指數(shù)的計(jì)算式可知，凝血指數(shù)高，表明材料具有更好的血液相容性。PVA、RHVG和PAAm 3種試樣的凝血指數(shù)與時(shí)間的關(guān)系如圖6所示。由圖6可知，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3種試樣的凝血指數(shù)均高于對(duì)照材料，由此表明3種試樣的抗凝血性能都好于對(duì)照材料。在相同的試驗(yàn)條件下，對(duì)照材料的凝血時(shí)間明顯較短，60 min后，對(duì)照材料的凝血指數(shù)低至0.071，而其他3種試樣的凝血指數(shù)均大于0.3,仍能維持較高的抗凝血能力。試樣的凝血反應(yīng)開始前5 min，血液凝固主要是由于添加了促凝劑Ca2+。從第10 min開始，3種試樣的凝血反應(yīng)逐漸飽和，凝血指數(shù)在60 min內(nèi)保持穩(wěn)定，表明三者在試驗(yàn)期間均表現(xiàn)出良好的抗凝性能。

圖6 試樣的凝血試驗(yàn)結(jié)果 (***, P<0.001)Fig.6 Anticoagulation test results of the samples (***, P<0.001)

2.8 血小板黏附試驗(yàn)

血小板的黏附與變形能夠激活凝血因子，促使纖維蛋白的形成，進(jìn)而形成血栓而凝血，因此，表面血小板的黏附是材料抗凝血性能的重要標(biāo)志之一。PVA、PAAm和RHVG 3種試樣表面血小板黏附試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，PVA和PAAm水凝膠表面可以看到明顯的血小板黏附，而在RHVG表面上幾乎看不到血小板黏附。這說明PVA與PAAm的混合改變了RHVG的表面結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，使血小板的黏附較少。

2.9 全血凝固試驗(yàn)

PVA、PAAm和RHVG 3種試樣表面全血凝固試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：PVA水凝膠表面黏附了較多的紅細(xì)胞，并且呈聚集的狀態(tài)；PAAm水凝膠表面同樣黏附了較多數(shù)量的紅細(xì)胞，但大多以分散的狀態(tài)黏附在水凝膠表面；在RHVG表面，僅可見極少的紅細(xì)胞黏附。試驗(yàn)結(jié)果表明，RHVG表面對(duì)于紅細(xì)胞的黏附具有一定的抑制作用，從而有利于延長(zhǎng)全血凝固時(shí)間。據(jù)文獻(xiàn)[23]研究，制備RHVG的PVA/PAAm水凝膠實(shí)際上是一種互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠，其表面結(jié)構(gòu)和化學(xué)性能不同于PVA水凝膠和PAAm水凝膠。

(a) PVA

(b) PAAm

(c) RHVG

(a) PVA

(b) PAAm

(c) RHVG

2.10 血漿復(fù)鈣時(shí)間

血漿復(fù)鈣曲線是表征血液內(nèi)源性凝血的方法，血漿復(fù)鈣時(shí)間是指去鈣血漿加入鈣源后凝固所需的時(shí)間[24]。因此，血漿復(fù)鈣時(shí)間越長(zhǎng)就說明血液凝固所需時(shí)間更長(zhǎng)。對(duì)于生物材料，血漿復(fù)鈣時(shí)間越長(zhǎng)就意味著材料具有一定的抗凝性能。PVA、RHVG和PAAm 3種試樣與陰性對(duì)照樣的血漿復(fù)鈣動(dòng)力學(xué)曲線如圖9所示。由圖9可知，與PVA和PAAm水凝膠相比，RHVG的凝血時(shí)間發(fā)生右移，凝血時(shí)間延長(zhǎng)。這表明RHVG的抗凝血性能更好。與前述其他凝血相關(guān)試驗(yàn)的結(jié)果一致。

圖9 試樣的血漿復(fù)鈣時(shí)間Fig.9 Plasma recalcification time of the samples

3 結(jié) 論

為了進(jìn)一步提高水凝膠人工血管材料的力學(xué)性能，本研究設(shè)計(jì)并編織了一種PET管道，利用自主設(shè)計(jì)的管道器官澆注成型模具，制備了編織管增強(qiáng)的水凝膠人工血管材料，并對(duì)其力學(xué)性能進(jìn)行了全面的考察，同時(shí)進(jìn)行了系統(tǒng)的血液相容性表征。研究表明，PET編織管增強(qiáng)的PVA與PAAm的質(zhì)量比5∶8水凝膠人工血管材料具有優(yōu)異的力學(xué)性能和血液相容性，尤其其徑向動(dòng)態(tài)順應(yīng)性達(dá)到了現(xiàn)有商用e-PTFE人工血管的5.1倍，體現(xiàn)了水凝膠材料在人工血管研究方面的巨大優(yōu)勢(shì)和潛力，其力學(xué)性能可以滿足臨床移植要求，為進(jìn)一步開展動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。