許明星 鄭傳東 楊鵬 楊娜

(成都市第三人民醫(yī)院 1.麻醉科；2.病理科，四川 成都 610031)

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少導致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)；心肌缺血與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，嚴重危害人類身體健康[1-2]。研究[3]表明麻醉藥對心肌細胞損傷具有保護作用，如七氟醚對心肌具有保護作用；丙泊酚可減輕高糖缺氧對心肌細胞的損傷[4]。硫噴妥鈉可減輕缺血后大鼠海馬腦片神經(jīng)元的損傷[5]，也可減輕再灌注心律失常[6]，但具體機制尚不清楚。miRNAs在心血管系統(tǒng)疾病如心肌梗死、肥大、纖維化、心力衰竭、心律失常、炎癥和動脈粥樣硬化等病變組織中有差異表達，可能影響疾病的進程[7-8]。研究[9]顯示，miR-664-1-5p在缺氧預處理大鼠心肌細胞中表達水平降低，可能參與缺氧介導的心肌細胞保護作用?；谝陨涎芯拷Y果，本研究假設，硫噴妥鈉通過調控miR-664-1-5p在缺氧大鼠心肌細胞損傷中發(fā)揮保護作用。本課題以大鼠心肌細胞H9c2為研究對象，建立氯化鈷(CoCl2)缺氧模型，研究硫噴妥鈉對CoCl2誘導的H9c2細胞存活、凋亡的作用，及miR-664-1-5p在該保護機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細胞H9c2購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，硫噴妥鈉、氯化鈷(CoCl2)、胰蛋白酶、購自Sigma-Aldrich公司，BCA蛋白檢測試劑盒和CCK8檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司，丙二醛(malondialdehyde,MDA) 和超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD) 檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，miR-664-1-5p的模擬物(miR-664-1-5p)、miR-664-1-5p的干擾物(anti-miR-664-1-5p)、陰性對照(miR-NC、anti-miR-NC)和引物購自上海吉瑪制藥有限公司，Total RNA提取試劑盒、 real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒(RT-PCR)購自寶生物工程(大連)有限公司，P21、Caspase-3和GAPDH抗體購自英國Abcam公司，流式細胞儀購自BD公司，Real-time PCR儀購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將H9c2細胞接種在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待生長至對數(shù)生長期時，洗滌消化傳代。

1.2.2 細胞氯化鈷缺氧模型構建和實驗分組 氯化鈷模型建立：根據(jù)文獻[10]的方法，將對數(shù)生長期的H9c2以1×104個細胞/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)至細胞融合度達到80%左右時，棄培養(yǎng)液，加入含終濃度600 μmol/LCoCl2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h即為模型組，對照組加入不含CoCl2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。將缺氧模型組細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入含硫噴妥鈉終濃度125、250、500 nmol/L的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃ 5%、CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，根據(jù)濃度分別分為藥物1、2、3組。

1.2.3 CCK8法測定細胞存活率 將對數(shù)生長期的H9c2以1×l04個細胞/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)至細胞融合度達到80%時加入含600 μmol/L CoCl2培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h建立模型組，加入10 μLCCK8溶液，培養(yǎng)2 h后于450 nm處測定吸光度(A)值。細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.4 流式細胞術測定細胞存活率和凋亡率 收集培養(yǎng)好的各組H9c2細胞，PBS緩沖液洗滌2次，稀釋細胞濃度為1×106個/mL，根據(jù)凋亡試劑盒說明書進行操作，取100 μL Binding buffer重懸細胞，然后加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和10 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，室溫避光20 min，流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測P21和Caspase-3凋亡相關蛋白水平 收集培養(yǎng)好的各組H9c2細胞，裂解細胞，收集蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，進行SDS-PAGE，轉膜，室溫封閉2 h，加入一抗(P21抗體1∶1000，Caspase-3抗體1∶1000，GAPDH抗體 1∶2000)，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜2次，加入稀釋的二抗,室溫孵育2 h，分析蛋白水平，以GAPDH為內參照。

1.2.6 細胞轉染 將對數(shù)生長期的H9c2細胞，以每孔2×l05個細胞接種于6孔板中，細胞融合為一層時進行轉染，用無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine 2000、miR-664-1-5p、miR-NC、anti-miR-NC、anti-miR-664-1-5p，分別記為miR-664-1-5p組、miR-NC組、anti-miR-NC組、anti-miR-664-1-5p組，將各組載體轉染入培養(yǎng)好的細胞中，培養(yǎng)6 h后換成完全培養(yǎng)液，轉染48 h，進行后續(xù)實驗。

1.2.7 Real-time PCR檢測miR-664-1-5p的表達水平 收集模型組、加藥組和/或轉染的各組H9c2細胞，用試劑盒提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，取cDNA按照 Real-time PCR的說明書進行反應檢測miR-664-1-5p的含量。用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果

2.1 硫噴妥鈉對CoCl2誘導的心肌細胞的細胞存活率和凋亡的影響 與對照組相比，模型組心肌細胞H9c2中P21和Caspase-3含量升高，細胞存活率降低，凋亡率升高(P<0.05)；與模型組相比，藥物2組和藥物3組H9c2細胞P21和Caspase-3含量降低，細胞存活率升高，凋亡率降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1和表1。

圖1 凋亡及P21、Caspase-3蛋白的表達

表1 硫噴妥鈉對CoCl2誘導的心肌細胞的細胞存活率和凋亡的影響

2.2 硫噴妥鈉對CoCl2誘導的心肌細胞中miR-664-1-5p、SOD、MDA表達的影響 與對照組相比，模型組H9c2細胞中miR-664-1-5p含量下降(P<0.05)，MDA含量增多(P<0.05)，SOD活性降低(均P<0.05)；與模型組相比，藥物2組和藥物3組H9c2細胞的miR-664-1-5p含量升高，細胞中MDA含量減少，SOD活性升高(均P<0.05)，見表2。提示CoCl2可誘導心肌細胞miR-664-1-5p含量降低，抗氧化能力減弱；硫噴妥鈉可減輕CoCl2誘導的心肌細胞H9c2損傷，提高心肌細胞的抗氧化能力。綜上，后續(xù)實驗選擇藥物3組濃度進行。

表2 硫噴妥鈉對CoCl2誘導的心肌細胞中miR-664-1-5p、SOD、MDA表達的影響

2.3 過表達miR-664-1-5p對CoCl2誘導的心肌細胞的細胞存活率和凋亡及SOD、MDA的影響 Westernblot和流式細胞術結果顯示，與miR-NC組相比，miR-664-1-5p組H9c2細胞中miR-664-1-5p含量升高，細胞存活率升高，凋亡率降低，細胞中MDA、P21和Caspase-3含量減少，SOD活性升高(均P<0.05)，見圖2和表3。

2.4 抑制miR-664-1-5p能減弱硫噴妥鈉對CoCl2誘導的心肌細胞的細胞存活率和凋亡的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-664-1-5p組的miR-664-1-5p含量降低，細胞存活率降低，凋亡率升高，細胞中P21和Caspase-3含量增多，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3和表4。

圖2 凋亡及P21、Caspase-3蛋白的表達

表3 過表達miR-664-1-5p對CoCl2誘導的心肌細胞的細胞存活率和凋亡及SOD、MDA的影響

圖3 凋亡及P21、Caspase-3蛋白的表達

表4 抑制miR-664-1-5p能減弱硫噴妥鈉對CoCl2誘導的心肌細胞的細胞存活率和凋亡的影響

2.5 抑制miR-664-1-5p能減弱硫噴妥鈉對CoCl2誘導的H9c2細胞中SOD、MDA的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-664-1-5p組的H9c2細胞中MDA含量增多，SOD活性降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表5。

表5 抑制miR-664-1-5p能減弱硫噴妥鈉對CoCl2誘導的心肌細胞中SOD、MDA的影響

3 討論

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)及時進行再灌注治療恢復缺血心肌的血液供應，被認為是阻止心肌壞死最有效的治療手段，但其又會引發(fā)心肌缺血再灌注損傷[11-12]。減少心肌細胞凋亡是減輕心肌損傷的重要途徑之一[13-14]。研究[15]表明，硫噴妥鈉等麻醉劑可能通過鈣鉀通道電流減輕心肌缺氧損傷。miRNA可與心肌細胞損傷的過程，且miRNA在胎兒心肌細胞、心臟成熟和成人心臟病中均發(fā)揮調節(jié)作用，可能是促進損傷后心臟修復的有價值靶點[16-17]。韓正怡[18]發(fā)現(xiàn)，miR-664-1-5p在嗎啡預處理的缺氧/復氧H9c2心肌細胞中表達減少。miR-664-1-5p在缺氧預處理和嗎啡預處理的慢性心力衰竭模型細胞中也表達下調，可能通過調節(jié)靶基因Fas在嗎啡預處理的心臟保護作用中起著重要作用[9]。

SOD是細胞內氧自由基清除劑，可降低細胞內的氧化應激水平[19]；MDA是脂質過氧化物的終產(chǎn)物，其水平可間接反映細胞氧化損傷程度[20]。本研究通過建立大鼠心肌細胞H9c2的CoCl2化學缺氧模型，檢測發(fā)現(xiàn)，H9c2經(jīng)CoCl2化學缺氧處理后，細胞存活率降低，凋亡率升高，SOD含量降低，MDA及P21和Caspase-3蛋白含量升高；miR-664-1-5p在CoCl2處理后的H9c2細胞中表達下降，與上述研究結果一致。模型組H9c2細胞經(jīng)過125、250、500 nmol/L的硫噴妥鈉處理后，細胞中miR-664-1-5p水平升高，細胞存活率升高，凋亡率降低，SOD含量升高，MDA含量降低。

為了確認硫噴妥鈉通過miR-664-1-5p發(fā)揮對缺氧H9c2細胞存活和凋亡的調控作用，轉染實現(xiàn)過表達和抑制miR-664-1-5p。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-664-1-5p可抑制CoCl2誘導的H9c2細胞凋亡，提高細胞存活率，提高SOD含量，降低MDA及P21和Caspase-3蛋白含量；抑制miR-664-1-5p則結果相反，減弱硫噴妥鈉對CoCl2誘導的心肌細胞的細胞存活率、凋亡及細胞中SOD和MDA含量的影響。

4 結論

硫噴妥鈉可能通過上調miR-664-1-5p在CoCl2誘導的大鼠心肌H9c2細胞損傷中發(fā)揮保護作用，抑制細胞凋亡，提高細胞存活率，減輕細胞損傷，對心肌細胞缺氧損傷具有潛在的保護作用。