蔣莉 何芳 劉丹 李為民 陳渤江

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 南充 637000； 2.南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；4.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610041)

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt/mTOR信號通路是細(xì)胞內(nèi)主要的信號通路之一，在細(xì)胞內(nèi)基本功能中起著重要作用。 PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長、細(xì)胞大小、代謝和運(yùn)動。這一通路已被廣泛研究，并被證實(shí)在人類腫瘤中普遍被激活。Bad 既是Bcl-2家族的一員，也是PI3K/Akt信號通路下游的調(diào)節(jié)因子。PI3K活化可激活PI3K依賴性的Akt，減少Bad與Bcl-XL和Bcl-2結(jié)合，阻止細(xì)胞色素C釋放入胞漿，而抑制細(xì)胞凋亡[1-2]。EGFR/MEK/MAPK通路激活p90Rsk通過磷酸化Bad，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡[3-4]。除此之外，很多細(xì)胞因子都可通過使Bad失活而抗凋亡[5]。譬如：IL-3、PKA都可以通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使Bad失活，從而抑制Bad的促凋亡活性[6]。由此可見，Bad的調(diào)節(jié)是由多個蛋白之間相互作用而形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)來實(shí)現(xiàn)的。

我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，Bad過表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)的增殖，促進(jìn)NSCLC尤其是肺腺癌細(xì)胞株H1299、SPC-A1、H292及大細(xì)胞肺癌H460的凋亡[7]。靶向沉默Akt2的表達(dá)也可以抑制NSCLC細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡[8]。然而在NSCLC中，是否通過Akt2/Bad信號通路的形式來實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，目前尚不清楚。因此，我們構(gòu)建了Bad過表達(dá)同時穩(wěn)定干擾Akt2的NSCLC細(xì)胞株，通過檢測體外細(xì)胞凋亡及凋亡信號通路下游蛋白，并選擇肺腺癌細(xì)胞株H1299、SPC-A1構(gòu)建移植瘤模型，探討Akt2/Bad信號通路在NSCLC中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1、肺癌細(xì)胞株(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)NCI-H292、人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460、人肺腺癌細(xì)胞株NCI-H1299、肺鱗癌細(xì)胞株SK-MES-1，以上細(xì)胞株購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；慢病毒載體及包裝系統(tǒng)載體pLOV.UBC. EGFP載體、膜蛋白外殼質(zhì)粒和反式包裝質(zhì)粒三種質(zhì)粒購于紐恩(上海)生物科技有限公司；Enhanced infection solution(ENI．S)、polybrene、含無義序列的shRNA及綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記對照慢病毒載體、小干擾序列和引物購于上海吉凱基因技術(shù)公司；2000DMEM、FBS購于hyclone；primer(R&F)、Trizol、Lipofectamine、positive clone 測序及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Invitrogen公司；BamHI、EcoRI等限制性內(nèi)切酶購于New England Biolabs；SYBR TAQ Real-time試劑盒購于Bio-Rad公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購于Qiagen公司；Cell Counting kit-8 (CCK-8)購于Dojindo公司；V-APC/7AAD、蛋白抽提試劑盒購于南京凱基生物科技公司，BCA protein assay kit購于Pierce公司；兔抗人AKT2抗體、抗兔二抗購于 Cell Signaling Technology；Luminata Western HRP substrate、PVDF膜購于Millipore公司；預(yù)染蛋白Marker購于Fermentas公司。

1.2 制備實(shí)驗(yàn)所用NSCLC細(xì)胞株 制備穩(wěn)定干擾Akt2表達(dá)的同時穩(wěn)定過表達(dá)Bad基因的NSCLC細(xì)胞株(Akt2+Bad)，具體方法詳見課題組之前的研究[7-9]。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 未感染慢病毒載體的H1299、H292、SPC-A1、H460及SK-MES-1細(xì)胞為NSCLC組。陰性對照病毒轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞為NC組； shAkt2組：穩(wěn)定干擾Akt2的NSCLC細(xì)胞；Bad組：穩(wěn)定過表達(dá)Bad的NSCLC細(xì)胞；shAkt2+Bad組：穩(wěn)定干擾Akt2表達(dá)同時穩(wěn)定過表達(dá)Bad基因的NSCLC株。

1.4 Western blot檢測蛋白水平 根據(jù)凱基生物蛋白抽提試劑盒操作說明抽提細(xì)胞蛋白。經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，120 V恒定電壓轉(zhuǎn)膜，封閉過夜，Akt2一抗、Bad一抗工作濃度1∶1000，二抗工作濃度1∶5000，β-actin一抗工作濃度1∶10 000，二抗工作濃度1∶10 000。采用Millipore公司Luminata Crescendo Western HRP substrate顯色液孵育3 min，放入暗盒(感光時間根據(jù)熒光條帶的強(qiáng)弱來判定)曝光，取出X光片，放入自動洗片機(jī)顯影定影后用柯達(dá)掃描儀將條帶掃描至電腦保存。Quantity one分析軟件測定條帶灰度。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化收集各組細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次(2000 rpm離心5 min)收集1～5×105細(xì)胞。加入500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-APC混勻后，加入5 μL 7-AAD染液，混勻。室溫、避光、反應(yīng)5～15 min。在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。激發(fā)波長633 nm，最大發(fā)射波長660 nm，Annexin V-APC的紅色熒光使用FL4通道檢測；激發(fā)波長Ex=546 nm；發(fā)射波長Em=647 nm，7-AAD紅色熒光使用FL3通道檢測。

1.6 細(xì)胞成瘤能力檢測 準(zhǔn)備雌雄各半、5～8周及體重匹配裸鼠18只，每組6只，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)。各組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次，PBS重懸。調(diào)整細(xì)胞濃度，每100 μL約含1×106細(xì)胞。無菌操作下，按2×106細(xì)胞/只比例，將已制備的細(xì)胞懸液經(jīng)皮下注射于裸鼠的右側(cè)背部，觀察細(xì)胞成瘤能力。4周后，摘除瘤體，稱重、采集照片，將每個瘤體組織分成兩部分，一部分10%福爾馬林固定，石蠟包埋，另一部分-80℃凍存。

1.7 Tunel細(xì)胞凋亡檢測 使用紅色熒光素(Tetramethylrhodamine，TRITC)標(biāo)記凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3-OH末端，并用熒光顯微鏡檢測。石蠟切片按常規(guī)方法脫臘，用二甲苯60 ℃浸洗5 min×2次。梯度乙醇各浸洗1次，每次3 min。1×PBS漂洗3次，每次5 min。0.1%Triton X-100處理8 min。PBS洗兩遍。取出100 μL Label Solution用于陰性對照；陽性對照使用1500 U/mL Dnase I于15～25℃處理10 min，使DNA斷裂。每個樣本加入50 μL TUNEL reaction mixture，陰性對照加入50 μL label solution。置于濕盒中防止干燥，37°C避光孵育60 min。PBS洗3遍。50 μL DAPI復(fù)染核10 min，PBS洗3遍?？篃晒獯銣鐒┞?lián)合中性樹脂封片。10 min后熒光顯微鏡檢測：激發(fā)波長543 nm，發(fā)射波長571 nm(紅)。DAPI最大吸收波長為358 nm，最大發(fā)射波長為461 nm。Image pro plus 6.0軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 各組Bad、Akt2的蛋白水平的比較 shAkt2+Bad組Bad蛋白水平表達(dá)顯著高于NSCLC組和NC組(均P<0.05)。Akt2蛋白水平表達(dá)顯著低于NSCLC細(xì)胞組和NC組(均P<0.05),見圖1。

2.2 對體外體內(nèi)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞成瘤能力的影響

2.2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) shAkt2+Bad組組織切片TUNEL染色與NSCLC、NC、Bad、shAkt2組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)，這與體外Annexin V/7-AAD流式分析結(jié)果一致，見圖2A、圖3。提示沉默Akt2基因表達(dá)與過表達(dá)Bad在促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡方面具有協(xié)同作用。

2.2.2 體外實(shí)驗(yàn) shAkt2+Bad組的細(xì)胞凋亡率明顯高于NSCLC、NC、shAkt2和Bad組細(xì)胞(P<0.05)，說明靶向沉默Akt2、Bad過表達(dá)在對NSCLC細(xì)胞凋亡的影響方面存在協(xié)同作用。而NSCLC與NC 組凋亡率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2B。說明慢病毒載體本身不會影響NSCLC的凋亡。

圖1 Western blot分析3組細(xì)胞Bad蛋白及AKT2蛋白表達(dá)水平

2.2.3 細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn) 4周后shAkt2+Bad組移植瘤重量較NSCLC、NC、Bad及shAkt2組明顯降低(P<0.05)，而NSCLC及NC組重量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2C、D。說明靶向沉默Akt2、Bad過表達(dá)在對抑制NSCLC細(xì)胞成瘤能力的影響存在協(xié)同作用，且慢病毒載體本身不會影響NSCLC的成瘤能力。

2.3 對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制 shAkt2+Bad組瘤體組織中shAkt2蛋白表達(dá)水平明顯下降，Bad蛋白表達(dá)水平明顯升高(圖4A)，提示轉(zhuǎn)染雙病毒的NSCLC細(xì)胞構(gòu)建的瘤體組織中， Akt2蛋白穩(wěn)定沉默且Bad蛋白穩(wěn)定過表達(dá)。與NSCLC及NC組比較，shAkt2細(xì)胞株中Caspase-9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，cyto-c顯著升高(均P<0.05)，而BCL-2和BCL-XL蛋白表達(dá)水平均無明顯差異(P>0.05)；與NSCLC及NC組比較，Bad組細(xì)胞株中cyto-c顯著升高(P<0.05)，而Caspase-9、BCL-2和BCL-XL蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NSCLC及NC組比較，Bad+shAkt2組中Caspase-9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，cyto-c顯著升高(均P<0.05)，且cyto-c的增高程度強(qiáng)于Bad和shAkt2組(P<0.05)(圖4B)。

圖2 靶向沉默Akt2、Bad過表達(dá)對體外體內(nèi)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞成瘤能力的影響

圖3 各細(xì)胞組移植瘤組織內(nèi)的細(xì)胞凋亡水平(×200)

3 討論

Akt/Bad信號通路在腫瘤和非腫瘤領(lǐng)域的作用逐漸得到證實(shí)：Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)黃楊酮能抑制Akt/p70s6k1通路，下調(diào)Bcl-2家族抗凋亡蛋白表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bad表達(dá)，使Caspase3裂解活化，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而促進(jìn)凋亡；在非腫瘤領(lǐng)域， Quan等[11]在弓形蟲感染模型中發(fā)現(xiàn)，弓形蟲感染激活PI3K-PKB/Akt，使Bad磷酸化，抑制宿主細(xì)胞凋亡，而用PI3K抑制劑LY294002 和渥曼青霉素能阻止寄生蟲誘導(dǎo)的PKB/Akt磷酸化，促進(jìn)宿主細(xì)胞凋亡。李爽等[12]研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白能夠通過細(xì)胞周期S期阻滯,調(diào)控細(xì)胞周期,凋亡和遷移相關(guān)基因的表達(dá)而抑制非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞的生長和遷移,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但Akt/Bad信號通路是否參與，以何種形式參與NSCLC的發(fā)病目前還鮮有報(bào)道。

圖4 Western blot檢測下游分子

細(xì)胞色素c(cyto-c)是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，研究表明細(xì)胞凋亡的一個關(guān)鍵步驟是細(xì)胞色素C 從線粒體釋放。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的cyto-c 在dATP 存在的條件下能與凋亡蛋白酶活化因子1(apoptosis protease activating factor 1，Apaf-1) 結(jié)合形成多聚體，并使含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-9)與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，并激活其他caspase如caspase-3等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13-14]。本研究體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，靶向沉默Akt2聯(lián)合Bad過表達(dá)，較單一過表達(dá)Bad或敲出Akt2細(xì)胞凋亡率明顯增加，提示Akt2/Bad信號通路可能以促進(jìn)凋亡的形式參與NSCLC發(fā)病機(jī)制。在對凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測中，本研究結(jié)果顯示，Akt2靶向沉默和Bad過表達(dá)的NSCLC細(xì)胞cyto-c顯著升高，共感染的NSCLC cyto-c也顯著升高，且cyto-c升高的程度大于單病毒感染組。因此，我們的研究提示Akt2/Bad信號通路可能通過線粒體途徑調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞凋亡。但與公認(rèn)的線粒體促凋亡途徑可能矛盾的是，我們的結(jié)果顯示，靶向沉默Akt2能使caspase-9明顯減少。我們采用的caspase-9抗體僅檢測細(xì)胞總caspase-9含量，有必要在后續(xù)的研究中做相關(guān)的活性鑒定。

通常情況下，Bad與14-3-3蛋白結(jié)合，以磷酸化的失活形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，抑制細(xì)胞凋亡[15]。外來凋亡信號刺激激活Bad上游信號蛋白，誘導(dǎo)Bad去磷酸化，與BCL-2和BCL-XL結(jié)合形成異源二聚體，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。我們在對凋亡信號通路相關(guān)蛋白的檢測中發(fā)現(xiàn)，沉默Akt2及Bad過表達(dá)后，雖然能促進(jìn)NSCLC凋亡，但BCL-2和BCL-XL的含量均無明顯變化，提示調(diào)節(jié)Akt2及Bad可能只是影響B(tài)CL-2和BCL-XL的聚合及解聚而不會改變上述蛋白的總量，或者可能在NSCLC中，凋亡調(diào)節(jié)并不主要通過上述途徑。另外我們發(fā)現(xiàn)，靶向抑制Akt2也不會改變其下游蛋白Bad的含量，提示Akt并不依靠改變Bad劑量來調(diào)控它的活性。

Chorner等[17]研究發(fā)現(xiàn)Akt-1抑制劑a-674563相對于泛Akt抑制劑mk-2206，在降低NSCLC細(xì)胞存活率方面更有效。Akt1的缺失可抑制肺癌的發(fā)展，而Akt2的缺失則促進(jìn)了肺癌的發(fā)展。p-Akt2是Akt2磷酸化的活性形式。但本研究組既往的研究[18]發(fā)現(xiàn)， p-Akt2陽性患者5年生存率明顯降低，而p-Akt1與預(yù)后無關(guān)，推測在NSCLC腫瘤進(jìn)展中，Akt2發(fā)揮更重要的作用。本次研究體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)，靶向沉默Akt2能夠促進(jìn)NSCLC的凋亡，抑制NSCLC細(xì)胞株在裸鼠體內(nèi)成瘤。

研究[19]發(fā)現(xiàn)，miR-137過表達(dá)抑制了順鉑作用下的A549和 H520細(xì)胞的Akt2蛋白的表達(dá)，增加了caspase-3活性，增加了bax 蛋白的表達(dá)，并抑制了cyclin d1蛋白的表達(dá)。Akt2抑制劑mk2206可抑制akt2蛋白的表達(dá)，抑制順鉑誘導(dǎo)的A549和H520細(xì)胞增殖。Akt2的抑制還可以增加caspase-3活性和bax蛋白的表達(dá)，該研究結(jié)果間接證實(shí)了Akt2信號通路在肺癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，并提示這一發(fā)現(xiàn)可以轉(zhuǎn)化為抗癌耐藥機(jī)制的研究。

本研究提示，Akt2/Bad信號通路可能通過線粒體途徑參與NSCLC的凋亡，參與NSCLC的發(fā)病機(jī)制，此外還有多種蛋白構(gòu)成相當(dāng)復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)參與其中。今后我們將會聚焦在這些網(wǎng)絡(luò)中尋找關(guān)鍵環(huán)節(jié)及調(diào)控點(diǎn)，并將其轉(zhuǎn)化為抗癌靶向藥物的研發(fā)和抗癌藥物耐藥機(jī)制的研究。

4 結(jié)論

靶向沉默Akt2聯(lián)合Bad過表達(dá)在促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡方面有協(xié)同作用,能顯著增加cyto-c表達(dá)，下調(diào)caspase-9的表達(dá)；Akt2/Bad信號通路可能通過線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡參與NSCLC的發(fā)病機(jī)制。