惠明朗 姜翠菊 邱海濤 劉磊峰

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 湛江 524000；2.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518104)

鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，近年的發(fā)病率逐年升高，目前鼻咽癌治療手段以放療結(jié)合藥物為主，雖能對局部有較好的控制，但一部分患者在4年內(nèi)仍會發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差[1-2]。因此，探討有效的鼻咽癌治療方法尤為重要。miR-1275是miRNAs家族一員，其可靶向HOXB5抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期[3-4]，但miR-1275對鼻咽癌細(xì)胞凋亡及機(jī)制影響尚未明確。胰島素樣生長因子1受體(Insulin like growth factor 1 receptor，IGF-1R)是一種酪氨酸激酶跨膜蛋白，參與細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡、分化等一系列病理生理過程。目前研究[5-7]證實，在鼻咽癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中IGF-1R存在過表達(dá)，其異?；罨纱龠M(jìn)腫瘤增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。miR-1275是否可調(diào)節(jié)IGF-1R影響鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡尚未清楚。本研究以鼻咽癌HONE-1細(xì)胞為研究對象，旨在探討miR-1275和IGF-1R對鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制，為鼻咽癌診療提供新的研究靶點。

1 材料方法

1.1 試劑和儀器 人鼻咽癌細(xì)胞株HONE-1購自美國ATCC，F(xiàn)BS、RPMI 1640培養(yǎng)基、雙抗均購自美國Gibco，miR-1275 mimics、對照miR-NC、miR-1275 inhibitor、對照anti-miR-NC、IGF-1R特異性siRNA及陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Opti-MEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000試劑盒均購自美國Invitrogen公司，Trizol、MTT試劑盒、PCR儀、酶標(biāo)儀均購自美國Thermo公司，細(xì)胞凋亡試劑盒、流式細(xì)胞儀均購自美國BD，IGF-1R、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)、細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)抗體及HRP標(biāo)記的二抗均購自美國Abcam。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時轉(zhuǎn)染 細(xì)胞在5 %體積分?jǐn)?shù)CO2、飽和濕度及37 ℃恒溫條件下，使用含有10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。整個培養(yǎng)過程保證無菌操作，每2～3 d換液一次。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，以2×105個/孔接種于6孔板，使用無血清及雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)60%左右生長密度時進(jìn)行miR-1275 mimics(miR-1275組)、對照miR-NC、miR-1275 inhibitor(anti-miR-1275組)、對照anti-miR-NC、IGF-1R特異性siRNA(si-IGF-1R組)、陰性對照(si-NC組)、si-IGF-1R+anti-miR-1275的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照LipofectamineTM試劑盒說明操作。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將經(jīng)Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋的脂質(zhì)體2000及質(zhì)粒載體加入6孔板相應(yīng)的孔內(nèi)，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，6 h后添加含雙抗及血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗研究。

1.3 qRT-PCR實驗 Trizol法提取細(xì)胞總RNA，分光光度計檢測其純度及濃度，逆轉(zhuǎn)制備cDNA。依據(jù)試劑盒說明，以U6作為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。引物序列如下：miR-1275正向引物5′-GAACCTGGTA GTGGGGGAGA-3′，反應(yīng)引物 5′-GTGCAGGGTCC GAGGTATTC-3′；U6 正向引物 5′-CTCGCTTCGG CAGCACA-3′，反應(yīng)引物 5′-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3′。反應(yīng)體系為20 μL，其中 SYBR Green Mix 10 μL，正向引物0.5 μL，反應(yīng)引物0.5 μL，cDNA溶液2 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。采用2-△△Ct公式計算miR-1275基因相對表達(dá)水平。設(shè)置5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4 MTT比色實驗 以5×103/孔將生長至對數(shù)期的細(xì)胞接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染的24、48和72 h在每孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL)，每個時間段設(shè)置5個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)4 h，加入150 μL DMSO終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測定波長為490 nm的光密度值(OD)。實驗重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡實驗 采用Annexin V-FITC/PI雙染法聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率。以5×104個/孔密度接種HONE-1細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每孔細(xì)胞中加 Annexin V-FITC和PI各5 μL，混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot檢測蛋白水平 收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，細(xì)胞中添加適量RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度及純度。總蛋白與上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸變性，按照40 μg/孔上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜。膜置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，添加1∶1000稀釋的IGF-1R、t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3一抗，4 ℃孵育過夜，隨后加HRP標(biāo)記的1∶2000稀釋的二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，凝膠成像設(shè)備觀察結(jié)果，Image J軟件定量分析蛋白條帶灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.7 miR-1275和IGF-1R靶向關(guān)系驗證 靶基因預(yù)測軟件顯示miR-1275和IGF-1R有結(jié)合位點。擴(kuò)增IGF-1R基因的3'UTR片段，將miR-1275與IGF-1R結(jié)合部位的野生型(WT)及突變型(MUT)序列插入到螢火蟲熒光素酶基因下游構(gòu)建表達(dá)載體。將miR-1275 mimics與WT/MUT重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000混勻后轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，依據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-1275可抑制HONE-1細(xì)胞活力及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 qRT-PCR、MTT實驗及流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，轉(zhuǎn)染miR-1275 mimics的HONE-1細(xì)胞miR-1275 基因表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞增殖活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；空白組與miR-NC組的miR-1275表達(dá)、細(xì)胞增殖活力及凋亡率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 過表達(dá)miR-1275后HONE-1細(xì)胞增殖、凋亡率的影響

表1 過表達(dá)miR-1275后HONE-1細(xì)胞miR-1275表達(dá)及細(xì)胞增殖、凋亡率變化

2.2 miR-1275對HONE-1細(xì)胞t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達(dá)的影響 Western blot檢測各組細(xì)胞t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達(dá)結(jié)果顯示，與空白組比較，轉(zhuǎn)染miR-1275 mimics的HONE-1細(xì)胞p-AKT和PCNA水平明顯降低，cleaved caspase3水平明顯升高(P<0.05)，3組t-AKT水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.3 miR-1275靶向下調(diào)IGF-1R表達(dá) 靶基因預(yù)測軟件顯示IGF-1R是miR-1275的潛在靶基因。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，過表達(dá)miR-1275可明顯抑制IGF-1R野生型熒光素酶活性(P<0.05)，而對IGF-1R突變型熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，見表2；Western blot結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-1275可明顯抑制HONE-1細(xì)胞IGF-1R水平，而抑制miR-1275表達(dá)后細(xì)胞IGF-1R水平增加(P<0.05)，見圖3。

圖2 miR-1275對HONE-1細(xì)胞t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達(dá)的影響

圖3 miR-1275和IGF-1R結(jié)合位點及上調(diào)及下調(diào)miR-1275表達(dá)后IGF-1R表達(dá)變化

2.4 miR-1275通過上調(diào)IGF-1R促進(jìn)HONE-1細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡 Western blot檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較HONE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染IGF-1R siRNA后，IGF-1R水平降低，細(xì)胞增殖活力降低，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；將si-IGF-1R與miR-1275抑制物共同轉(zhuǎn)染至HONE-1細(xì)胞后，與 si-IGF-1R+anti-miR-NC組比較，IGF-1R水平明顯升高，細(xì)胞增殖能力明顯升高，凋亡率降低(P<0.05)，見圖4。

表2 雙熒光報告基因?qū)嶒灆z測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞雙熒光素酶活性

圖4 miR-1275通過上調(diào)IGF-1R促進(jìn)HONE-1細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡

2.5 miR-1275靶向IGF-1R對HONE-1細(xì)胞t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達(dá)的影響 Western blot檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達(dá)結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-IGF-1R組p-AKT和PCNA水平明顯降低，cleaved caspase3水平明顯升高(P<0.05)；與si-IGF-1R+anti-miR-NC組，si-IGF-1R+anti-miR-1275組p-AKT和PCNA水平明顯升高，cleaved caspase3水更新明顯降低(P<0.05)，4組細(xì)胞t-AKT水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

圖5 Western blot檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達(dá)

3 討論

microRNAs(miRNAs)是一類非編碼的小分子RNA，可通過與靶mRNA的3'-UTR直接作用來調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的生物學(xué)過程[8]。多項研究[9-10]表明，miRNAs在腫瘤細(xì)胞生長、分化、凋亡、生命體發(fā)育等過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用，這預(yù)示著miRNAs可能成為腫瘤診療的生物標(biāo)志物。有研究[11]顯示， miR-1275可通過調(diào)節(jié)LZTS3促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移；LncRNA miR143HG可通過miR-1275/AXIN2 分子軸抑制膀胱癌發(fā)展[12]。既往研究[3-4]表明，鼻咽癌中miR-1275表達(dá)降低，過表達(dá)miR-1275可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖及阻滯細(xì)胞周期。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-1275可抑制鼻咽癌HONE-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但miR-1275調(diào)控鼻咽癌具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

IGF-1R已被證明在一些惡性腫瘤生長、增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其過度表達(dá)已成為多種惡性腫瘤細(xì)胞的普遍特征[13-14]。因此，IGF-1R是一個有前景的腫瘤治療靶點[15-16]。有研究[17]顯示，miR-1275可通過靶向IGF2BP1、IGF2BP3和IGF-1R三種IGF2 mRNA結(jié)合蛋白抑制肝癌細(xì)胞生長。本研究通過生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)miR-1275和IGF-1R有結(jié)合位點，并通過Western blot證實miR-1275可負(fù)向調(diào)控IGF-1R的表達(dá)。進(jìn)一步的細(xì)胞增殖、凋亡實驗顯示，抑制IGF-1R表達(dá)可降低HONE-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而同時抑制IGF-1R和miR-1275表達(dá)可減弱抑制IGF-1R對細(xì)胞增殖、凋亡的影響。提示miR-1275可靶向調(diào)節(jié)IGF-1R影響鼻咽癌細(xì)胞增殖及凋亡。

PI3K/AKT信號通路是一條重要的信號通路，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡過程，對腫瘤演進(jìn)、預(yù)后發(fā)揮重要作用[18-19]。PI3K/AKT信號在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，主要原因是AKT過度活化。AKT是一種原癌基因，是PI3K下游的直接靶蛋白，AKT活化可通過調(diào)節(jié)下游mTOR、PCNA、caspase3等靶基因，經(jīng)過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞存活[20-21]。IGF-1R可結(jié)合于IGF和IGF2配體，活化細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶，促進(jìn)細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化，啟動PI3K/AKT信號通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖及腫瘤惡化[22]。抑制IGF-1R/PI3K/AKT信號通路可明顯減弱鼻咽癌細(xì)胞生長[23]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-1275及抑制IGF-1R均可明顯下調(diào)p-AKT和PCNA水平，上調(diào)cleaved caspase3水平，而抑制miR-1275表達(dá)可減弱抑制IGF-1R對p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達(dá)的影響。

4 結(jié)論

過表達(dá)miR-1275可抑制鼻咽癌HONE-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制AKT信號途徑。IGF-1R是miR-1275的靶基因，miR-1275可靶向IGF-1R并調(diào)控AKT信號途徑影響鼻咽癌細(xì)胞增殖和凋亡，miR-1275/IGF-1R分子軸可能成為鼻咽癌治療的重要靶點。