曲 栗, 古淑青, 張嘉麒, 趙超敏, 鄧曉軍

(1. 上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心, 上海 200135; 2. 復旦大學, 上海 200032)

氨基酸(amino acids, AA)是大分子蛋白質的基本組成單位,是生物代謝過程中的重要物質,氨基酸的種類及含量影響蛋白質的形態(tài)、特性和營養(yǎng)價值。牛乳營養(yǎng)豐富,是嬰幼兒階段重要的營養(yǎng)來源,但是其中含有20多種過敏蛋白質,其中酪蛋白和乳清蛋白可引起大多數(shù)過敏反應[1]。羊奶和羊奶制品似乎具有潛在的低致敏性,因此成為牛乳不耐受人群,尤其是嬰幼兒的母乳替代品[2,3]。駱駝奶的蛋白質組成和結構與牛乳不同,具有不同的功能和藥用特性[4],駱駝奶與母乳相似,駱駝奶具有較高的消化率和較低的嬰兒過敏發(fā)生率[5]。Navarrete-Rodríguez等[6]證實駱駝奶對一歲以上患有牛乳蛋白過敏癥(CMPA)的患者是安全和可耐受的,被認為是一種很好的母乳替代品。由于上述這些優(yōu)勢,近年來羊奶粉和駱駝奶粉備受消費者青睞,其價格也比牛奶粉高。為了探究3種不同乳品的差異,本研究從氨基酸角度進行氨基酸成分分析和含量比較,為研究3種來源乳品營養(yǎng)價值差異奠定了基礎。

目前氨基酸檢測的方法有分光光度法[7]、氨基酸分析儀法[8]、高效液相色譜法[9]、液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[10,11]等,其中我國國家標準GB/T 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》以茚三酮為柱后衍生劑,采用氨基酸分析儀測定。該方法所需衍生劑、色譜柱及配套流動相的采購成本較高,且該儀器普及性低,檢測時間較長。LC-MS/MS可以解決多種氨基酸分離度差以及引入衍生試劑后分離難度大等問題[12],常用于血液[13]、尿液[14]、煙草[15,16]等樣品基質的分析。針對乳制品,高效液相色譜法比較普遍,由于選取的衍生試劑不同,大多衍生時間和分析時間較長,本研究利用6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯(AQC)作為衍生化試劑,大大縮短前處理時間,在22 min內可以分離18種氨基酸。方法靈敏度高,重復性好,結果可靠,可用于不同基底乳粉中18種氨基酸的定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters ACQUITY UPLC型超高效液相色譜儀,配有PDA檢測器和Empower色譜數(shù)據(jù)工作站(美國Waters公司); ME104T電子分析天平(精度為0.1 mg,美國Mettler Toledo公司); Vortex-Genie2渦旋振蕩儀(美國Scientific Industries公司); DKN 812C烘箱(日本Yamato公司)。

組氨酸(His)、絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、賴氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)、甲硫氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Iso)、亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸(Phe)、L-胱氨酸(L-Cys-Cys)、?；撬?Tau)、苯酚、3,3′-二硫代二丙酸、甲酸銨均購自美國Sigma公司;氫氧化鈉、鹽酸、硼酸均購自國藥集團化學試劑有限公司;AQC(Cas號:148757-94-2)購自美國TRC公司;Waters AccQ·TagTM流動相購自美國Waters公司;0.22 μm濾膜購自上海安譜科技股份有限公司;實驗室用水均由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制得。

牛奶粉和羊奶粉均購自上海市場,駱駝奶粉購于網(wǎng)絡;標準參考物質SRM 1849a奶粉樣品購自美國國家標準與技術研究院(NIST)。

1.2 樣品前處理

1.2.1水解

采用酸水解法,準確稱取2.0 g樣品,加入16 g水,充分溶解后,準確稱取200 mg樣液,置于10 mL帶螺紋玻璃瓶中,依次加入800 μL水、600 μL 1% 3,3′-二硫代二丙酸、600 μL 0.2 mol/L鹽酸、2.8 mL 0.1%苯酚鹽酸,混勻后持續(xù)充入氮氣1 min,置于110 ℃烘箱中24 h,于第2天取出并冷卻至室溫,待帶螺紋玻璃瓶的殘渣沉到瓶底,吸取0.2 mL澄清樣液至1.5 mL離心管中,依次加入0.2 mL 6 mol/L NaOH和0.4 mL 0.1 mol/L鹽酸,混合均勻,過水相濾膜后待衍生。

1.2.2衍生

衍生試劑的配制:稱取1.0 mg AQC粉末,置于1.5 mL離心管中,而后加入1 mL純乙腈,渦旋混勻,于55 ℃加熱,使其全部溶解,在變色硅膠容器中密封儲存一周。

吸取70 μL 0.4 mol/L硼酸緩沖液(pH 8.8),置于1.5 mL離心管中,吸取10 μL 1.2.1節(jié)制備的待衍生的樣液,混合均勻后,邊渦旋邊加入20 μL配制好的AQC衍生試劑,充分混合后,于55 ℃加熱10 min,將衍生好的試樣裝入內插管中,超高效液相色譜儀檢測,外標法定量。

1.3 色譜條件

色譜柱:BEH C18柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:50 ℃;流速:0.4 mL/min;流動相A: AccQ·TagTM流動相;流動相B: 0.2‰甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序:0～5.5 min, 0.1%B; 5.5～15.2 min, 0.1%B～9.1%B; 15.2～20.5 min, 9.1%B～21.2%B; 20.5～21.26 min, 21.2%B～59.6%B; 21.26～21.29 min, 59.6%B～90%B; 21.29～22.84 min, 90%B; 22.84～26.00 min, 90%B～0.1%B; 26.00～32.00 min, 0.1%B。進樣量:1 μL;檢測波長:260 nm。

2 結果與討論

2.1 色譜方法優(yōu)化

本方法考察了BEH C18柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和T3柱(150 mm×3.0 mm, 1.8 μm)。結果表明,雖然兩者都是耐高水相色譜柱,但是采用T3柱分離后,目標物色譜峰峰形較差,響應較低,而BEH C18柱柱效高,目標物色譜峰峰形窄且尖銳,能夠達到較好的分離度,可以實現(xiàn)22 min內18種氨基酸的基線分離(見圖1a)。在酸水解過程中,氨基酸經(jīng)過AQC衍生后,谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)分別轉化為Glu和Asp。因此,Glu值表示Glu和Gln的組合值;Asp值表示Asp和Asn的組合值。Barkholt等[17]研究表明在水解過程中加入3,3′-二硫代二丙酸可以將Cys和L-Cys-Cys轉化為S-2-羧乙基硫半胱氨酸(xCys),所得到的xCys可與其他氨基酸分離,從而進行定量。如圖1b所示,xCys值表示Cys和L-Cys-Cys的組合值。

2.2 衍生試劑的選擇

蛋白質在鹽酸環(huán)境下110 ℃水解24 h,其中添加0.1%苯酚的目的是防止酪氨酸鹵化;55 ℃烘箱中加熱10 min,目的是將酪氨酸衍生時的副產物快速轉化為單一產物。氨基酸不具有紫外吸收性質,需要經(jīng)過衍生化過程才能被儀器捕捉到,異硫氰酸苯酯(PITC)和2,4-二硝基氟苯(DNFB)均可與一級胺、二級胺反應,是氨基酸常用的柱前衍生劑[18,19],使用這兩種試劑衍生的時間大約需要1 h左右,而使用AQC衍生僅需要1 s,這大大縮短了衍生化時間。也正是因為AQC的衍生化時間非常短,所以樣品中加入衍生化試劑時,需要一邊低速渦旋一邊加入,使衍生化試劑與樣品接觸面積最大,確保樣品中氨基酸全部衍生。否則會導致樣品還未完全與衍生試劑反應,衍生試劑就水解了。AQC極容易水解所以配制好后應當密封保存在干燥容器內。

圖 1 (a)18種氨基酸和(b)xCys的色譜圖

表 1 18種氨基酸的相對分子質量、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

2.3 方法學驗證

2.3.1標準曲線、線性范圍和檢出限

除Cys外,配制其他17種氨基酸標準溶液,濃度分別為0、0.5、1.0、5.0、10、20 nmol/mL;同時配制0、0.5、1.0、2.5、5.0、10 nmol/mL Cys標準溶液,按上述色譜條件進行分析。

以18種氨基酸換算后的質量濃度為橫坐標(X, μg/L)、峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線。以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),各組分的線性方程、相關系數(shù)(r2)見表1。結果表明,各組分的線性關系良好,可滿足實際檢測的需要。

2.3.2方法可行性驗證

為了驗證方法的可行性,以奶粉標準參考物質1849a為對象進行測定,平行測定6次。實驗表明,測定結果符合證書中范圍值,6次平行測定值的RSD為2.04%～3.65%,說明該方法準確可靠。

2.4 實際樣品檢測

采用建立的方法分別對上海市售及電商銷售的11個批次的牛奶粉、羊奶粉和駱駝奶粉進行18種氨基酸分析,并對其總氨基酸(TAA)、必需氨基酸(EAA)和總必需氨基酸(TEAA)進行統(tǒng)計。結果表明,牛奶粉、羊奶粉和駱駝奶粉中均檢測到豐富的氨基酸,種類齊全,基本覆蓋18種氨基酸,但是個別羊奶粉和駱駝奶粉未檢出?；撬?。

表 2 同一品牌不同階段牛奶粉、同品牌同階段牛奶粉和羊奶粉、3種不同品牌羊奶粉、不同產地駱駝奶粉中18種氨基酸占總氨基酸的百分含量

2.4.1同一品牌不同階段牛奶粉氨基酸組成

此次測試的上海市售的同一品牌不同階段牛奶粉中均檢測到了18種氨基酸,各氨基酸含量占總氨基酸含量的百分比(以下簡稱含量百分比)見表2。His、Ser、Arg、Glu、Pro、Tyr、Phe隨段數(shù)增加含量百分比逐漸升高;Tau、Gly、Asp、Ala、Leu和xCys隨段數(shù)升高,含量百分比逐漸下降;Thr、Lys、Met、Val、Iso的含量百分比趨勢和段數(shù)并無關聯(lián)。在3個階段牛奶粉中,Tau含量百分比差別最小,Glu差別最大。牛奶粉一段至三段的TEAA占TAA的比例分別為40.2%、39.4%和38.2%,均大于聯(lián)合國糧食組織(FAO)和聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦標準(36.0%),屬于優(yōu)質蛋白質資源。

2.4.2同一品牌1段牛奶粉和羊奶粉氨基酸組成

在同一品牌一段牛奶粉和羊奶粉中均檢測到了18種氨基酸,羊奶粉中的必需氨基酸里只有His、Val和Phe的含量百分比高于牛奶粉。在非必需氨基酸中,羊奶粉中Tau、Asp、Ala、Tyr、Lys和xCys的含量百分比均低于牛奶粉,只有Glu和Pro高出牛奶粉。

一段嬰兒奶粉是嬰兒營養(yǎng)的重要來源,牛奶粉和羊奶粉中TEAA占TAA的比例分別為39.8%和38.6%,屬于優(yōu)質蛋白質資源,但未見羊奶粉氨基酸成分含量的明顯優(yōu)勢。

2.4.33種不同品牌羊奶粉氨基酸組成

分析了3種不同品牌的羊奶粉,TEAA占TAA的比例為:品牌一38.8%、品牌二39.0%、品牌三38.0%,說明3種羊奶粉屬于優(yōu)質蛋白質資源。有兩個品牌均檢測到18種氨基酸;另一品牌沒有檢測到Tau,但其Glu的含量百分比較其他兩品牌高2.0%。

2.4.4駱駝奶粉氨基酸組成

此次分析的3種駱駝奶粉中,新疆產兩款駝奶粉的18種氨基酸含量百分比比較接近,可能與駱駝品種、生長環(huán)境和飼料有關。迪拜產駱駝奶中必需氨基酸Lys含量百分比較新疆駝奶低1%,其他必需氨基酸較新疆駝奶沒有太大差異。迪拜產駱駝奶中非必需氨基酸Arg、Glu和Pro含量百分比均高于新疆駝奶粉1%～2%,而Ser、Gly、Asp、Ala、xCys含量百分比均低于新疆駝奶粉0.2%～1%。新疆1號、新疆2號和迪拜駝奶粉中TEAA占TAA的比例較為相近,分別為38.6%、38.7%和38.2%,屬于優(yōu)質蛋白質資源。但是進口的迪拜產駱駝奶粉中,沒有檢出Tau。

2.4.53種基質奶粉中氨基酸組成

根據(jù)上述實驗數(shù)據(jù),選擇牛奶粉、羊奶粉和駱駝奶粉進行氨基酸含量比對。結果表明,牛奶粉中TEAA占TAA百分比較駱駝奶粉和羊奶粉要稍高,駱駝奶粉和羊奶粉的比較接近,當然奶粉種類眾多,未能全部抽檢,該結果僅針對受試樣品。部分品牌駱駝奶粉和部分品牌羊奶粉沒有檢出Tau,它是母乳中含量豐富的游離氨基酸,被認為是具有神經(jīng)保護作用,能夠促進寶寶的大腦發(fā)育[20],提高寶寶自身抵抗力,同時還能預防疾病,缺乏?；撬釀t會造成多種危害,比如智力發(fā)育不全,可能引起神經(jīng)發(fā)育障礙疾病,例如天使綜合征[21]。胎兒需要從母體獲取所需的?；撬?如果母乳不足,需要依靠配方奶粉維持營養(yǎng),選擇羊奶粉和駱駝奶粉時,應當看清營養(yǎng)標簽中是否強化了?；撬?以保證營養(yǎng)均衡。

3 結論

本研究利用基于AQC衍生的超高效液相色譜法在22 min內可同時測定18種氨基酸成分。與傳統(tǒng)方法相比,該方法采用AQC衍生,衍生時間大大縮短,前處理步驟簡便。方法學考察及利用該方法對上海市售和網(wǎng)絡銷售的牛奶粉、羊奶粉和駱駝奶粉進行氨基酸成分分析后表明,該方法具有實用性和特異性強、結果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點,能夠滿足乳粉中氨基酸成分分析需求,為我國口岸進口的進境奶制品進行監(jiān)測,檢驗檢疫行業(yè)的監(jiān)控、篩查和確證、風險評估等研究提供了技術支持。