張進(jìn)軍，張作法，呂國英，陸玫丹，方立林

(1.浙江武義匯美中藥材有限公司，浙江 武義 321200； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州 310021；3.武義縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 武義 321200； 4.武義縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 武義 321200)

三葉青為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤，是我國特有的珍稀藥用植物[1]。三葉青主要分布于我國浙江、福建、廣西、云南等地，主要以地下塊根入藥，于2018年2月入選新“浙八味”中藥材[2]。主要用于各種癌癥、熱癥、炎癥等治療，已列入浙江省公費報銷中藥名錄。前期研究發(fā)現(xiàn)， 三葉青具有抗腫瘤[3]、抗炎鎮(zhèn)痛[4]、抗病毒[5]、護(hù)肝[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]等廣泛的藥理活性。

相對于塊根，三葉青地上部分極少得到合理利用，存在大量的資源浪費。近年來，研究者多集中于對三葉青塊根組成成分和藥效的研究[8-9]，鮮有對三葉青地上部分的研究。本文對三葉青地上地下部分提取物抗氧化活性進(jìn)行比較，為其后續(xù)的開發(fā)和研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

三葉青地上、地下部分均采集于武義匯美中藥材有限公司三葉青種植基地，經(jīng)干燥后，過0.125 mm篩備用。

1.2 提取物的制備

取粉碎好的地下、地上部分各50 g，加入1 500 mL 70%乙醇，超聲提取30 min，提取結(jié)束后，過濾，殘渣再加入1 500 mL 70%乙醇超聲提取1次，合并濾液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，進(jìn)一步冷凍干燥，得提取物。

1.3 活性成分含量測定

多酚含量。根據(jù)Singleton等[10]的方法略加改動。準(zhǔn)確移取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL五倍子酸溶液于離心管中，用蒸餾水定容至1 mL，再加入0.5 mL的福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)8 min，再加入2 mL 10%碳酸鈉溶液，搖勻，避光反應(yīng)60 min，于750 nm處測定吸光度，以五倍子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確移取0.5 mL樣品溶液，按上述方法在760 nm處測定吸光度，計算樣品中多酚含量。

總黃酮含量。根據(jù)文獻(xiàn)[11]，具體步驟：準(zhǔn)確移取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于離心管中。用70%乙醇補足至1 mL。首先加入0.3 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，反應(yīng)5 min；再加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻，反應(yīng)5 min；最后加入1 M的氫氧化鈉溶液4.0 mL，搖勻，反應(yīng)10 min。在波長510 nm下測量吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。準(zhǔn)確移取1 mL的樣品溶液，按上述方法在510 nm處測量吸光度值，計算總黃酮的含量。

1.4 抗氧化活性分析

DPPH自由基清除能力[12]。取2 mL樣品置于10 mL 離心管中，加入2 mL現(xiàn)配的0.1 mmol·L-1的DPPH甲醇溶液，混合均勻后，在室溫下置于暗處靜置30 min，于517 nm處測定吸光度。

還原能力測定[13]。在1 mL磷酸緩沖溶液(pH 6.6)中加入0.4 mL樣品溶液，1 mL 1%鐵氰化鉀，混合物在50 ℃水浴保溫20 min，急速冷卻，加1 mL 10%三氯乙酸，5 000 r·min-1離心10 min。取上層清液2 mL，加0.2 mL 0.1% FeCl3，混合均勻，在波長700 nm下測吸光度。

ABTS清除能力[14]。稱量0.031 8 g ABTS+用去離子水定容至10 mL，稱取0.013 4 g過硫酸鉀用去離子水定容至10 mL，將ABTS+和過硫酸鉀溶液按照1∶1的比例混合后，避光保存12～16 h。用磷酸緩沖溶液稀釋ABTS+儲備液，使其在734 nm波長處測定的吸光度值為0.7±0.02。提取物溶液0.5 mL加入ABTS+測定液2.0 mL，準(zhǔn)確振蕩30 s，測在734 nm波長處的吸光度值。

羥基自由基清除能力[15]。1 mL樣品加入1 mL 12 mmol·L-1FeSO4水溶液，再加入1 mL 12 mmol·L-1H2O2溶液，37 ℃下保溫10 min，再加入1 mL 6 mmol·L-1水楊酸，37 ℃下保溫30 min，然后10 000 rpm、4 ℃下離心10 min，取上清液在510 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮和多酚含量

三葉青地上、地下部經(jīng)70%乙醇提取，干燥得率分別為18.40%和14.29%。圖1顯示，地上、地下部黃酮類含量分別達(dá)到12.69%和11.93%，多酚含量分別達(dá)到17.38%和16.94%。由此可知，三葉青地上部分總黃酮和多酚含量略高于地下部分提取物，兩者間并無顯著差異。

柱間無相同字母表示組間差異顯著。圖1 三葉青地上地下部分提取物中黃酮與多酚含量

2.2 DPPH自由基清除能力

由圖2可知，三葉青地下和地上部分的提取物對DPPH自由基均有一定的清除能力，且清除能力隨著濃度的增加而增強。地下塊莖和地上藤葉對DPPH清除率達(dá)到50%時，所需要的效應(yīng)濃度分別為0.190 2和0.139 5 mg·mL-1。地上部分提取物的DPPH清除活性略高于地下部分。

圖2 地下、地上部分不同提取物濃度的DPPH自由基清除活性比較

2.3 總還原力

由圖3可知，地上和地下部分提取物均具有一定的還原能力，吸光度的高低反映了提取物的還原能力?？傔€原力隨溶劑提取物濃度的增加而增大，總還原力為0.092～1.899，各濃度不同提取物的還原力均低于陽性對照。在相同濃度下，地上部分提取物的還原力高于地下部分。

圖3 地下、地上部不同提取物濃度的還原力比較

2.4 對ABTS自由基的清除作用

如圖4所示，地上部分提取物的清除率顯著高于地下部分提取物。在濃度低于0.75 mg·mL-1時，BHA對ABTS自由基的清除率明顯高于地上、地下提取物。當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.75 mg·mL-1時，地上部分提取物與BHA的清除效果持平。

圖4 地下、地上部分不同提取物濃度的ABTS自由基清除活性比較

2.5 對羥基自由基的清除作用

如圖5所示，不同濃度的三葉青地下、地上部分提取物和BHA均具有一定的羥基自由基清除能力。三葉青地下地上部分提取物對羥基自由基的清除作用顯著低于BHA。在0.19～3.0 mg·mL-1，三葉青地下、地上部分提取物清除率分別為7.25%～58.30%和4.96%～68.70%。

圖5 地下、地上部分不同提取物濃度的羥基自由基清除活性

3 小結(jié)

目前對三葉青的研究大多集中在抗炎和抗腫瘤方面，鮮有抗氧化活性的報道，特別是地上部分更是少有報道。提取物為混合物，成分復(fù)雜，難以用單一抗氧化指標(biāo)評價，故采用4種抗氧化評價體系，盡可能全面、客觀地評價不同提取物的抗氧化活性。本文對三葉青地下、地上部分提取物進(jìn)行抗氧化活性比較，并對其多酚和黃酮含量進(jìn)行測定。研究發(fā)現(xiàn)，地上部分提取物中黃酮和多酚含量略高于地下部分，但差異不顯著。在ABTS、DPPH和還原力試驗中，地上部分提取物的抗氧化活性顯著高于地下部分提取物，而地下部分提取物的羥基自由基清除活性顯著高于地上部分。以上差異可能是由于提取物中活性成分的作用機(jī)理不同導(dǎo)致。本試驗中，三葉青地上部分比地下部分顯示了較強的抗氧化活性，這對于進(jìn)一步開發(fā)利用三葉青地上部分具有很重要的意義。