陳士剛 秦彩云 王聰慧 才巨鋒 陶晶

摘 要：紅松是重要的用材樹種和堅(jiān)果經(jīng)濟(jì)林樹種。以組織培養(yǎng)的方法，選用三岔子紅松種子園5個家系的未成熟種子作為外植體進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)研究。結(jié)果表明，不同家系未成熟種子在添加萘乙酸（NAA）2 mg/L + 6-芐氨基嘌呤（6-BA ）1 mg/L的培養(yǎng)基上胚性愈傷組織誘導(dǎo)率不同，最佳誘導(dǎo)率為5.68 %。紅松愈傷組織誘導(dǎo)的最適蔗糖濃度為30 g/L。選取長勢良好的胚性愈傷組織進(jìn)行超低溫保存，在恢復(fù)培養(yǎng)10 d后可觀察到不同細(xì)胞系均有明顯新生愈傷組織，15 d后愈傷組織大量增殖。本研究為三岔子紅松種子園紅松優(yōu)良種質(zhì)資源的規(guī)?；敝澈捅４娴於嘶A(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紅松;紅松種子園;胚性愈傷組織;超低溫保存;激素組合

中圖分類號：S791 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? 文章編號：1006-8023（2021）01-0013-05

Abstract：Korean pine is an important timber tree species and nut economic forest tree species. The method of tissue culture was used， the immature seeds of five families from Sanchazi Korean pine seed orchard were selected as explants by tissue culture to study the embryogenic callus induction and cryopreservation. The results showed that immature seeds of different families had different induction rates of embryogenic callus on the medium supplemented with naphthaleneacetic acid （NAA） 2 mg/L + 6-benzylaminopurine （6-BA） 1 mg/L， and the best induction percentage was 5.68 %. The optimal sucrose concentration for the callus induction of Korean pine was 30 g/L. Embryogenic callus with good growth was selected for cryopreservation. After 10 days of recovery culture， it was observed that there were obvious new callus in different cell lines. After 15 days， a large number of callus proliferated. This study laid a foundation for large-scale propagation and conservation of fine germplasm resources of Pinus koraiensis in Sanchazi seed orchard.

Keywords：Pinus koraiensis; Korean pine seed orchard; embryonic callus; cryopreservation; hormone combination

0 引言

植物體細(xì)胞胚發(fā)生是指體細(xì)胞在特定條件下，未經(jīng)性細(xì)胞融合而通過與合子胚發(fā)生類似的途徑發(fā)育成新個體的形態(tài)發(fā)育過程[1-4]。體細(xì)胞胚發(fā)生具有以最低成本實(shí)現(xiàn)迅速繁殖大量高價值苗木的潛能[5-7]。結(jié)合傳統(tǒng)的繁殖技術(shù)和分子細(xì)胞生物技術(shù)，體胚發(fā)生為促進(jìn)商業(yè)樹種的基因改善提供了一個很有價值的工具[8-9]。

紅松（Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.）為松科松屬樹種，樹高可達(dá)40 m。紅松又名朝鮮松、果松、海松，是第三紀(jì)孑遺樹種，同時也是東北溫帶地帶性頂極群落——闊葉紅松林的建群種[10-14]。通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑使紅松優(yōu)良基因型大規(guī)模繁殖，并可實(shí)現(xiàn)優(yōu)良種質(zhì)資源超低溫保存，從而為優(yōu)良種質(zhì)資源選育、大規(guī)模繁殖以及長期保存提供依據(jù)。

本研究以三岔子紅松種子園采集的5個家系球果為試材，探究不同家系胚性愈傷組織誘導(dǎo)差異，并進(jìn)行愈傷組織超低溫保存，為紅松優(yōu)良種質(zhì)資源規(guī)?；庇於ɑA(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅松球果2018年7月上旬采于三岔子紅松種子園的5個不同家系。球果采回后，用75%的酒精擦拭球果表面，在超凈工作臺上剝出種子，用75%酒精滅菌2 min，無菌水沖洗3 ～5次，然后再用10%次氯酸鈉處理15 min，無菌水沖洗3～5次后待用。

1.2 胚性愈傷組織誘導(dǎo)

1.2.1 胚性愈傷組織誘導(dǎo)適宜激素濃度的篩選

以DCR為基本培養(yǎng)基進(jìn)行紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)，研究萘乙酸（NAA）和6-芐氨基嘌呤（6-BA）兩種激素的不同濃度組合對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

基本培養(yǎng)條件為：附加NAA（濃度1 mg/L、2 mg/L和5 mg/L），6-BA（濃度1 mg/L和2 mg/L），培養(yǎng)基內(nèi)均添加500 mg/L水解酪蛋白、 30 g/L蔗糖、3.5 g/L Phytagel凝膠（Sigma-Aldrich P8169-1KG）和500 mg/L L-谷氨酰胺（過濾滅菌加入）。接種后置于23 ℃暗培養(yǎng)，12周后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.2 蔗糖濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將紅松未成熟胚接種于1.2.1篩選出的最佳激素組合中，分別添加蔗糖20、30、40 g/L，培養(yǎng)基添加500 mg/L水解酪蛋白 、500 mg/L L-谷氨酰胺（L-谷氨酰胺過濾滅菌加入）和 3.5 g/L Phytagel凝膠。接種后置于23 ℃暗培養(yǎng)，12周后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3 不同基因型對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將紅松5個開放式授粉家系（編號為01#、02#、03#、04#、05#）的未成熟胚分別接種于1.2.2篩選出的最佳培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基添加500 mg/L水解酪蛋白 + L-谷氨酰胺500 mg/L + 3.5 g/L Phytagel凝膠。接種后置于23 ℃暗培養(yǎng)，12周后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.3 紅松愈傷組織超低溫保存技術(shù)

將長勢良好的紅松愈傷組織放入無菌的錐形瓶中，加入12 mL的0.4 mol/L 山梨糖醇，25 ℃條件下震蕩18 h，加入0.8 mol/L 山梨糖醇1.125 mL、二甲基亞砜（DMSO）1.125 mL，加入0.4 mol/L 山梨糖醇0.75 mL，分裝到滅菌的冷凍管中，裝于程序降溫盒中，然后將程序降溫盒放在-80 ℃冰箱2 h后轉(zhuǎn)入液氮中保存。液氮中保存1 d后取出材料進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)（復(fù)蘇培養(yǎng)方法為將冷凍管從液氮中取出，放在37 ℃水中3 min，然后轉(zhuǎn)接到愈傷組織增值培養(yǎng)基中）。在培養(yǎng)過程中定期觀察愈傷組織狀態(tài)和增殖情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel 計(jì)算平均值和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

胚性組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生胚性愈傷組織的外植體數(shù)/接種未染菌外植體數(shù)×100% 。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素濃度對紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

外植體接種（圖1（a））后15 d左右胚性愈傷組織開始長出（圖1（b））。激素濃度對紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)影響較大（表1）。當(dāng)6-BA濃度為1 mg/L 時，隨著NAA濃度的升高，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先增大后減小趨勢。當(dāng)6-BA濃度為2 mg/L時胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低于1 mg/L處理。在本試驗(yàn)的6個處理中，NAA 2 mg/L + 6-BA 1 mg/L的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高（5.68 %），為紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的適宜激素濃度。

2.2 蔗糖濃度對紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

蔗糖濃度對紅松愈傷組織誘導(dǎo)率的影響見表2，隨著蔗糖濃度的升高，愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。當(dāng)蔗糖濃度為30 g/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為紅松愈傷組織誘導(dǎo)的適宜蔗糖濃度。

2.3 紅松不同家系未成熟種子胚性愈傷組織誘導(dǎo)比較

針對紅松不同家系未成熟種子胚性愈傷組織誘導(dǎo)率差異見表3。紅松5個家系未成熟胚均可誘導(dǎo)胚性愈傷，但是誘導(dǎo)率差距很大。1#家系胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最好，是易于誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的基因型;3#的誘導(dǎo)率次之;4#家系愈傷組織誘導(dǎo)率最低。

2.4 紅松胚性愈傷組織增殖和超低溫保存

選取長勢良好的胚性愈傷組織（圖2（a））進(jìn)行超低溫保存，將37 ℃水浴解凍好的冷凍管中愈傷組織用移液槍取出，吸干表面水分后置于增殖培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)，為降低冷凍保護(hù)劑對愈傷組織的傷害，培養(yǎng)1 d后轉(zhuǎn)移至新的增殖培養(yǎng)基上。10 d后可以觀察到不同細(xì)胞系均有明顯的新生愈傷組織，15 d后大量增殖，表明不同家系胚性愈傷組織經(jīng)過超低溫保存后細(xì)胞可以恢復(fù)活力（圖2（b））。

3 討論

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類與濃度是愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素[11]。在試驗(yàn)過程中，較低濃度的細(xì)胞分裂素6-BA與較高濃度的生長素2，4-D或NAA等的組合被證明是針葉樹種愈傷組織誘導(dǎo)的適合植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配比[11]。在長白落葉松（Larix olgensis）胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程中發(fā)現(xiàn)，2，4-D濃度對胚性愈傷組織誘導(dǎo)率影響顯著[15]。在本試驗(yàn)的6個處理中NAA 2 mg/L + 6-BA 1 mg/L組合愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為紅松愈傷組織誘導(dǎo)的適宜激素濃度。

培養(yǎng)基的滲透壓影響著植物的脫分化、再分化及器官的形成，針葉樹種也不例外[9]，糖不僅是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還是培養(yǎng)基的碳源和能源[16-17]，蔗糖濃度對愈傷組織的誘導(dǎo)率具有重要的影響[18-24]，在胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程中一般以蔗糖作為主要碳源[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖30 g/L為胚性愈傷組織誘導(dǎo)的適宜濃度，這個結(jié)果與高等研究結(jié)果不同[24]。

針葉樹愈傷組織在增殖過程中常出現(xiàn)體胚發(fā)生能力逐漸減弱的現(xiàn)象[25]，因此需要將活力旺盛的胚性愈傷組織進(jìn)行超低溫保存，當(dāng)需要時從液氮中取出恢復(fù)培養(yǎng)，以備隨時開展試驗(yàn)。本研究以紅松不同家系的胚性愈傷組織為試材，實(shí)現(xiàn)了紅松胚性愈傷組織超低溫保存與恢復(fù)培養(yǎng)，超低溫保存后細(xì)胞可以恢復(fù)活力，這為紅松優(yōu)良胚性愈傷組織保存提供了保障。

【參 考 文 獻(xiàn)】

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