賈文慶王艷麗郭英姿王政齊慶閆三妮劉會超何松林

(1.河南科技學(xué)院 河南省園藝植物資源利用與種質(zhì)創(chuàng)新工程研究中心 新鄉(xiāng) 453003；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林與藝術(shù)學(xué)院 鄭州 450002； 3.洛陽國家牡丹園 洛陽 471011)

大花黃牡丹(Paeonialudlowii)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan)肉質(zhì)花盤亞組(Subsect.Delavayanae)落葉大灌木，為西藏特有植物，自然僅在林芝、米林、隆子縣等有零星分布，生長勢強(qiáng)，高達(dá)2～3.5 m，是牡丹最高大的種質(zhì)，花鮮黃色，是金黃色牡丹品種來源的主要親本，秋葉紅色，觀賞價(jià)值極高； 其根、花瓣入藥，為名貴的藏藥之一(汪松等，2004)。大花黃牡丹多數(shù)僅有1個(gè)心皮，結(jié)實(shí)率少，加之生境干擾嚴(yán)重和人為盜掘毀壞等原因，致使其野生種群數(shù)量大幅減少，處于瀕危狀態(tài)，現(xiàn)被列為國家二級保護(hù)植物(李嘉玨等，1998； 洪德元等，1999； 汪松等，2004； 楊小林等，2007)。芍藥屬野生種質(zhì)資源中僅有黃牡丹(Paeoniadelavayivar.lutea)、大花黃牡丹具有黃色的基因，栽培牡丹除紫斑牡丹(Paeoniarockii)、楊山牡丹(Paeoniaostii)外，大多數(shù)種類植株低矮、生長纖弱，黃色品種少，嚴(yán)重制約了牡丹的應(yīng)用推廣。因此，研究分析大花黃牡丹花粉的貯存特性，對于開展芍藥屬植物的種間雜交育種工作，培育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的株型高大、黃色系牡丹品種具有重要意義。

牡丹現(xiàn)已確認(rèn)的9種野生種質(zhì)及居群分布在華北、西北、西南、華中等地區(qū)，區(qū)域跨度大，花期存在較大差異，雜交需要貯存花粉，花粉低溫或超低溫貯存能夠延長花粉的壽命，是隨時(shí)隨地為授粉雜交提供足量可育花粉的有效方法，檢測花粉萌發(fā)率是遠(yuǎn)緣雜交前的基礎(chǔ)性工作，花粉離體萌發(fā)技術(shù)是評價(jià)花粉萌發(fā)率以及花粉是否貯存成功的可靠手段(Akhondetal., 2000； Shekarietal.，2016； Sorkhehetal.，2018； Lietal.，2019)。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，花粉貯存期間的萌發(fā)率與活性氧、自由基的清除機(jī)制及膜質(zhì)過氧化程度有關(guān)(譚健暉，2011； 劉艷萍等，2013； 賈文慶等，2015； Liuetal.，2020)，氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷甚至細(xì)胞凋亡可能是貯存花粉萌發(fā)率下降的主要原因之一(石印等，2015； 徐瑾等，2015； Renetal.，2020)。以往關(guān)于大花黃牡丹的研究主要集中在分類學(xué)、生態(tài)學(xué)(蘇建榮等，2010； 楊翔等，2010)、遺傳學(xué)(林啟冰等，2004； 唐琴等，2012)、孢粉學(xué)(何麗霞等，2005； 曾秀麗等，2009)等方面，芍藥屬不同牡丹種質(zhì)花粉萌發(fā)適宜的培養(yǎng)基差異較大(蓋偉玲等，2010； 律春燕等，2010； 賈文慶等，2012； 施江等，2013)，王士泉等(2012)報(bào)道了大花黃牡丹花粉的育性情況，但僅限于用孔雀綠-醋酸洋紅測定花粉生活力，而關(guān)于培養(yǎng)基成分對花粉萌發(fā)，不同貯存溫度對花粉壽命及細(xì)胞內(nèi)生理指標(biāo)的影響，尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以大花黃牡丹隆子縣居群花粉為試驗(yàn)材料，對其花粉萌發(fā)特性、低溫下花粉的貯存特性進(jìn)行研究，并測定貯存期間抗壞血酸(AsA)含量等生理指標(biāo)的變化，旨在找出大花黃牡丹花粉短期、中期和長期貯存的適宜溫度，并明確貯存期間不同溫度下大花黃牡丹花粉萌發(fā)率降低的生理機(jī)制，為進(jìn)一步開展大花黃牡丹的雜交育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大花黃牡丹花粉采自西藏隆子縣，2018年5月上中旬9:00—11:00，采集含苞待放的大花黃牡丹花朵，迅速放入冰盒，在實(shí)驗(yàn)室將花萼和花瓣剝?nèi)?，去除花柄，然后倒置放入培養(yǎng)皿中，置于(22±1) ℃培養(yǎng)箱內(nèi)散粉，24 h后取出花朵，左手用鑷子夾住倒置的花朵，右手用鑷子輕彈，收集花藥開裂散出及掉落的花粉。將收集的花粉分成2份，一份直接用于花粉萌發(fā)的測定； 另一份30 ℃鼓風(fēng)干燥箱干燥24 h后(含水量降至6.5%±0.5%)，分裝至2 mL帶蓋離心管中蓋口貯存，備用。

1.2 花粉萌發(fā)試驗(yàn)及花粉掃描電鏡觀察

在前期牡丹花粉萌發(fā)研究(賈文慶等，2020)基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，一個(gè)對照(表1)，對硼酸、蔗糖、GA3、CaCl2進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，每培養(yǎng)基(5 g·L-1瓊脂，pH6.0)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)基配制后，分裝至35 mm一次性培養(yǎng)皿中，冷卻后，將1.1收集的新鮮花粉放入1 mL蒸餾水中，充分?jǐn)嚢柚瞥蓱腋∫?，然后用滴管將懸浮液移至培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻，然后放入盛有少量水的大號培養(yǎng)皿里，加蓋。置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)18 h后，在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率，每樣品觀察200粒以上，以花粉管長度大于花粉粒直徑作為花粉萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。花粉飽滿率觀察方法如下：將1.1收集的花粉酒精梯度脫水后，將花粉均勻撒在粘有雙面導(dǎo)電膠的圓形電極板上，噴金后在日立SU-1510掃描電鏡下觀察花粉并進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)飽滿的花粉比率。

1.3 不同貯存溫度對花粉萌發(fā)和花粉壽命的影響試驗(yàn)

將1.1所得的大花黃牡丹干燥花粉分成5份，每份分裝20～30個(gè)2 mL帶蓋離心管(將花粉裝入放有1～3粒變色硅膠的離心管，每管1.2 g左右花粉，封口貯存)，分別放在室溫(地下室陰涼干燥處，18～25 ℃)、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃、-196 ℃(放入液氮罐中，定期添加液氮)下貯存。貯存第24、40、72、120、184、264、365天后，分別從5種溫度中取1～2只離心管，取少許花粉用2.1節(jié)最佳培養(yǎng)基檢測萌發(fā)率(冷凍下花粉經(jīng)35 ℃水浴快速化凍)，確定5種溫度下的花粉壽命(花粉壽命=花藥散粉到萌發(fā)率降低到50%時(shí)所經(jīng)歷的天數(shù))，其余花粉用于保護(hù)酶活性等生理指標(biāo)測定。

1.4 不同貯存溫度對丙二醛(MDA)和抗壞血酸(AsA)含量的影響試驗(yàn)

MDA含量采用北京索萊寶科技有限公司提供的試劑盒測定：稱取約0.100 g花粉，加入1 mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿； 8 000×g4 ℃離心 10 min，取上清，置冰上待測?；旌弦涸?100 ℃水浴中保溫60 min后(蓋緊，防止水分散失)，置于冰浴中冷卻，10 000×g常溫離心10 min。取上清至1 mL玻璃比色皿中，測定各樣品在450 nm、532 nm和600 nm處的吸光度，換算出MDA含量。

AsA含量測定成分提取方法與MDA相同，反應(yīng)體系參照李合生等(2000)的方法，采用分光光度計(jì)測定525 nm處的吸光度值，根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定抗壞血酸的含量。

1.5 不同貯存溫度對3種保護(hù)酶活性的影響試驗(yàn)

酶液的提取參照賈文慶等(2020)方法。超氧化物岐化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用可見光分光光度法測定(李合生等，2000)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL2016處理數(shù)據(jù)和作圖，并利用SPSS22.0進(jìn)行方差分析、多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花黃牡丹花粉萌發(fā)適宜培養(yǎng)基的篩選及花粉飽滿率觀察

不同正交組合處理培養(yǎng)基對大花黃牡丹花粉萌發(fā)率影響的研究結(jié)果(表1)表明，不同培養(yǎng)基條件下花粉萌發(fā)率存在顯著差異(P<0.01)，其中處理5萌發(fā)率最高，平均達(dá)92.10%，對照無任何添加物的培養(yǎng)基萌發(fā)率最低，平均僅為23.50%，這表明大花黃牡丹花粉雖然能夠借助于自身積累的養(yǎng)分萌發(fā)，但萌發(fā)率較低。采用EXCEL2016 對花粉萌發(fā)率數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析，蔗糖、硼酸、CaCl2和GA34因素的極差(R)分別為23.78、19.86、6.78、6.34，可以確定對花粉萌發(fā)的誘導(dǎo)效應(yīng)表現(xiàn)為蔗糖>硼酸> CaCl2> GA3。根據(jù)分析結(jié)果，確定大花黃牡丹花粉萌發(fā)的最優(yōu)組合為120 g·L-1蔗糖+45 mg·L-1硼酸+55 mg·L-1GA3+30 mg·L-1CaCl2，其萌發(fā)率顯著高于其他組合。統(tǒng)計(jì)觀察發(fā)現(xiàn)，大花黃牡丹隆子縣居群單株開花3～8朵(圖1A)，秋葉猩紅(圖1B)，每朵花的花粉量平均干質(zhì)量在(180±32) mg，果實(shí)多為單心皮蓇葖果(圖1C)。掃描電鏡結(jié)果顯示，畸形花粉有勺形、三角形、不規(guī)則形等，總量較少，僅占觀察花粉總數(shù)的5.6%，花粉飽滿率高達(dá)94.4%，飽滿率與萌發(fā)率基本符合(圖1D、E)。

表1 不同培養(yǎng)基對大花黃牡丹花粉萌發(fā)率的影響①Tab.1 Effects of different medium on pollen germination of Paeonia ludlowii

圖1 大花黃牡丹植株?duì)顟B(tài)及花粉飽滿率Fig. 1 Plant status and pollen plumpness rate of Paeonia ludlowiiA.開花狀態(tài)； B.示紅葉； C. 示單心皮； D, E. 畸形花粉。A. Flowering state; B. Red leaf; C. A follicle with only one carpel; D, E. Deformed pollen.

2.2 不同貯存溫度對花粉壽命的影響

花粉貯存是人工保存種質(zhì)資源的重要手段。不同貯存溫度和處理時(shí)間對花粉萌發(fā)率的影響差異較大(P<0.01)(圖2)，除-196 ℃外，其他4個(gè)貯存溫度下，大花黃牡丹花粉萌發(fā)率均隨時(shí)間延長而下降。室溫下貯存花粉萌發(fā)率隨時(shí)間延長迅速降低，說明越來越多的花粉快速喪失發(fā)芽力，貯存24天花粉萌發(fā)率47%，為貯存前新鮮花粉萌發(fā)率的50.87%； 貯存第72天時(shí)，萌發(fā)率降為0，花粉死亡，說明冷涼干燥下花粉貯存壽命為24天。4 ℃貯存72天花粉萌發(fā)率為49%，120天時(shí)萌發(fā)率降為15%，這說明4 ℃下花粉壽命大概為80天左右，第264天時(shí)花粉萌發(fā)率降為0。-20 ℃、-80 ℃和-196 ℃貯存下花粉萌發(fā)率下降趨勢不同。-20 ℃下0～365天時(shí)，花粉萌發(fā)率呈快速下降趨勢，貯存第120天，花粉萌發(fā)率55%，貯存第184 天，萌發(fā)率降為32%，說明-20 ℃下花粉壽命120～184天； -80 ℃下貯存，花粉萌發(fā)率緩慢下降，而-196 ℃貯存下萌發(fā)率曲線保持平緩，貯存第365天，-80 ℃花粉萌發(fā)率為62.10%，達(dá)到貯存前花粉萌發(fā)率的66.23%，-196 ℃貯存下花粉萌發(fā)率為92.1%，為貯存前萌發(fā)率的99.67%，這表明-80 ℃和-196 ℃花粉壽命均大于1年，-196 ℃更適合花粉的長期貯存，而-80 ℃適合隔年雜交的花粉貯存。綜上所述，大花黃牡丹花粉貯存的最佳溫度為-196 ℃。

2.3 不同貯存溫度及時(shí)間對大花黃牡丹花粉MDA含量的影響

MDA含量是花粉細(xì)胞膜質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)，大花黃牡丹花粉在不同貯存環(huán)境中MDA含量變化如圖3所示。室溫、4 ℃貯存，花粉MDA含量先升高而后快速降低，室溫下首先達(dá)到峰值，4 ℃下隨后出現(xiàn)高峰； 室溫下MDA含量變化相對較大，貯存72天后，升高到24 μmol·g-1(FW)，為貯存前的5.21倍； 4 ℃貯存184天，MDA含量峰值達(dá)20.5 μmol·g-1(FW)； 隨后，2個(gè)貯存溫度下MDA含量迅速下降，推測可能是花粉細(xì)胞凋亡，MDA分解造成的。-20 ℃下MDA則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，貯存第365天時(shí)MDA含量達(dá)到貯存前的4.49倍，說明花粉細(xì)胞膜質(zhì)過氧化嚴(yán)重； 而-80 ℃條件下，大花黃牡丹花粉MDA含量呈緩慢上升的趨勢，貯存第365天MDA含量升高到7.8 μmol·g-1(FW)，為貯存前的1.69倍； -196 ℃下，大花黃牡丹花粉MDA含量總體穩(wěn)定，貯存365天后，MDA含量與貯存前無顯著差異，這表明花粉細(xì)胞在-196 ℃貯存下并未造成膜質(zhì)過氧化，花粉萌發(fā)率高。

圖3 不同貯存溫度及時(shí)間對大花黃牡丹花粉丙二醛含量的影響Fig. 3 Effects of different storage temperature and time on MDA content in pollen

2.4 不同貯存溫度及時(shí)間對大花黃牡丹花粉SOD活性的影響

不同貯存溫度及處理時(shí)間對SOD活性有顯著影響(P<0.01)(圖4A)。室溫下貯存，大花黃牡丹花粉SOD活性隨時(shí)間延長總體呈迅速下降趨勢，SOD活性的降低可能是花粉死亡較多，只有少部分花粉具有SOD活性造成的。4 ℃和-20 ℃下貯存，SOD活性升高，分別在第24天、第72天達(dá)到峰值，此后隨著貯存時(shí)間的延長，SOD活性迅速下降，4 ℃下貯存第264天花粉萌發(fā)率降為0，SOD活性僅為3 U·g-1(FW)，-20 ℃下貯存第365天，SOD活性僅為最高峰值的23.90%，這表明，此時(shí)SOD已不足以抵抗花粉膜質(zhì)過氧化導(dǎo)致的傷害，花粉萌發(fā)率也出現(xiàn)了大幅下降。-80 ℃貯存條件下，SOD活性呈先緩慢上升隨后下降再逐漸上升的趨勢，但總體變化幅度比較平緩，貯存第365天，SOD活性達(dá)到貯存前的1.65倍，這表明大花黃牡丹花粉清除活性氧的能力強(qiáng)，花粉仍具有較高活性。而-196 ℃液氮貯存條件下，SOD活性基本保持穩(wěn)定，貯存期間SOD活性無顯著變化，花粉萌發(fā)率與新鮮花粉無顯著差異，SOD活性124 U·g-1(FW)，為貯存前的1.07倍，這表明大花黃牡丹花粉細(xì)胞內(nèi)代謝穩(wěn)定，沒有受到傷害或傷害較小，因此花粉萌發(fā)率高。

2.5 不同貯存溫度及時(shí)間對大花黃牡丹花粉POD活性的影響

大花黃牡丹花粉經(jīng)過不同貯存溫度和時(shí)間處理后，POD活性變化顯著(P<0.01)(圖4B)。花粉POD活性在室溫、4 ℃、-20 ℃下，先升高而后降低。室溫下第24天，POD活性升至59 U·g-1(FW)，達(dá)到最高，為原來的2.32倍，之后隨著時(shí)間的增長，大花黃牡丹花粉自身的保護(hù)能力迅速下降，POD合成受到抑制，至貯存第264天，降為0； 4 ℃貯存，大花黃牡丹花粉的POD酶活性最高峰值出現(xiàn)在第72天，之后隨著時(shí)間增長，POD酶活性開始迅速下降，到第264天時(shí)，活性僅為貯存前活性的8%； -20 ℃，POD活性最高峰值出現(xiàn)在第120天，之后伴隨著花粉萌發(fā)率的下降而迅速下降，貯存365天，POD酶活性僅為3.5 U·g-1(FW)。-80 ℃貯存，POD酶活性同樣呈先升高后下降的趨勢，最高峰出現(xiàn)在第184天，之后下降。-196 ℃貯存條件下，POD酶活性整體波動(dòng)較小，趨勢平緩，365天時(shí)活性是原來的1.04倍，這表明超低溫下，花粉內(nèi)部代謝處于平衡狀態(tài)，自由基產(chǎn)生較少，低POD酶活性協(xié)同其他保護(hù)酶及其他成分等能夠及時(shí)分解自由基，保證花粉細(xì)胞內(nèi)部代謝穩(wěn)定，因而花粉活力較高。

2.6 不同貯存溫度及時(shí)間對大花黃牡丹花粉CAT活性的影響

不同貯存溫度對CAT活性的影響顯著(P<0.01)(圖4C)，室溫、4 ℃、-20 ℃貯存條件下，大花黃牡丹花粉的CAT活性首先升高，分別在第24天、第40天、第120天達(dá)到峰值，之后隨著貯存時(shí)間的延長，室溫、4 ℃下花粉CAT活性迅速下降，分別在貯存第264天和第365天降為0； -20 ℃下，在第120天花粉CAT活性達(dá)到峰值后快速下降，貯存第365天，花粉CAT活性僅為24 mg·g-1(FW)。-80 ℃貯存溫度下，隨著貯存時(shí)間的延長，大花黃牡丹花粉的CAT活性總體上呈起伏不定的曲線，第365天最高峰值達(dá)91 mg·g-1(FW)，為原來的1.25倍； -196 ℃貯存溫度下，CAT活性呈現(xiàn)震蕩下降再上升而后下降的趨勢，但幅度極為平緩，與貯存前無顯著差異。這表明隨著時(shí)間的推移，花粉可以在低溫下分解自由基，從而減少損害，保持較高的生存能力。

圖4 不同貯存溫度及時(shí)間對大花黃牡丹花粉酶活性的影響Fig. 4 Effects of different storage temperature and time on enzymatic activity in pollen

2.7 不同貯存溫度及時(shí)間對大花黃牡丹花粉AsA含量的影響

AsA是細(xì)胞體內(nèi)重要的抗氧化劑，由圖5可以看出，大花黃牡丹花粉經(jīng)過不同貯存溫度和時(shí)間處理后，AsA含量變化顯著不同(P<0.01)。室溫、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃貯存條件下，大花黃牡丹花粉AsA含量隨著時(shí)間的延長，呈現(xiàn)先升高后迅速下降的趨勢，室溫、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃的高峰值分別出現(xiàn)在第24、72、120、184天，之后除-80 ℃貯存溫度外，伴隨著花粉萌發(fā)率的下降，花粉AsA含量均迅速下降； 而-196 ℃貯存溫度下，花粉AsA含量先出現(xiàn)震蕩隨后呈略為上升的趨勢，365天時(shí)AsA含量為3.25 mg·g-1(FW)，僅為原來含量的1.19倍，這表明此時(shí)花粉可以清除保護(hù)酶不能清除的超氧陰離子自由基、羥自由基等自由基，進(jìn)而保護(hù)花粉減少低溫傷害，保持較高的花粉萌發(fā)率。

圖5 不同貯存溫度及時(shí)間對大花黃牡丹花粉AsA含量的影響Fig. 5 Effects of different storage temperature and time on AsA content in pollen

2.8 大花黃牡丹花粉萌發(fā)率與生理指標(biāo)的相關(guān)性

由相關(guān)性分析結(jié)果(表2)可知，大花黃牡丹花粉萌發(fā)率與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與AsA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，SOD活性與花粉萌發(fā)率相關(guān)系數(shù)達(dá)0.816 5，這表明大花黃牡丹花粉在5個(gè)貯存溫度下，SOD活性是影響花粉萌發(fā)、花粉壽命的最主要因子，其他主要影響因子依次是CAT活性、AsA含量和POD活性； 膜質(zhì)過氧化是導(dǎo)致花粉凋亡的主要因素。表2表明，MDA含量與SOD呈顯著負(fù)相關(guān)，與POD、CAT、AsA呈負(fù)相關(guān)，SOD、POD、CAT、AsA含量相互呈顯著正相關(guān)，這說明大花黃牡丹花粉中3種保護(hù)酶和AsA含量協(xié)同作用較強(qiáng)，花粉SOD可以有效清除活性氧過多積累造成的花粉細(xì)胞膜質(zhì)過氧化。

表2 花粉萌發(fā)率、MDA、AsA含量以及3種保護(hù)酶活性的相關(guān)分析①Tab.2 Correlation between pollen germination, protective enzymes activity, MDA, and AsA content

3 討論

3.1 不同培養(yǎng)基及不同貯存方法對花粉萌發(fā)的影響

蔗糖、H3BO3、Ca2+和GA3是花粉萌發(fā)率離體檢測最常用的添加物 (Feietal.，2003； Gokbayraketal.，2017； Flores-Renteriaetal.，2018)。其中，蔗糖不僅為花粉的萌發(fā)和花粉管的生長提供了必要的能量，而且在一定程度上維持了外界環(huán)境的滲透壓，保證了花粉的萌發(fā) (Hiroseetal.，2014)； H3BO3可以增加花粉細(xì)胞對糖的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，誘導(dǎo)Ca2+從外界進(jìn)入細(xì)胞，建立花粉管頂端生長所需的Ca2+梯度； Ca2+在花粉管極性生長和生長方向的調(diào)節(jié)中具有重要的作用(Renetal.，2020)； GA3對花粉萌發(fā)和花粉管生長有重要作用，低濃度GA3可顯著提高杏(Prunusarmeniaca)花粉萌發(fā)率(Feietal.，2003； Gokbayraketal.，2017； Flores-Renteriaetal.，2018)。植物基因型不同，適宜的花粉檢測培養(yǎng)基亦不同，芍藥屬植物花粉萌發(fā)適宜的蔗糖濃度為50～150 g·L-1，硼酸濃度30～100 mg·L-1(李秉玲等，2010； 律春燕等，2010； 賈文慶等，2012； 施江等，2013)。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，蔗糖、H3BO3、Ca2+、GA3不同組合對大花黃牡丹花粉萌發(fā)有顯著影響，萌發(fā)適宜的蔗糖濃度達(dá)120 g·L-1，高于矮牡丹(Paeoniajishanensis)的90 g·L-1(賈文慶等，2012)，低于黃牡丹的150 g·L-1(律春燕等，2010)，這表明不同牡丹野生種質(zhì)花粉適宜的培養(yǎng)基不同。花粉萌發(fā)率與飽滿率具有相關(guān)性(賈文慶等，2012； 王士泉等，2012)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大花黃牡丹隆子縣居群開花多、花粉量大，花粉畸形率較低，平均僅5.6%，結(jié)合萌發(fā)率(可育花粉率)90%以上來分析，二者具有關(guān)聯(lián)，飽滿率高可能是大花黃牡丹新鮮花粉萌發(fā)率較高的原因，這與成仿云等(1997)研究發(fā)現(xiàn)種子是大花黃牡丹唯一的繁殖途徑是一致的，表明大花黃牡丹具有較強(qiáng)的有性生殖能力。

貯存后生物材料生存力的變化是用來決定貯存成功與否的重要指標(biāo)，不同牡丹種質(zhì)花期不同，自然情況下牡丹花粉壽命僅有3～15天，因此雜交需要貯存花粉，合適的貯存環(huán)境對于大花黃牡丹花粉延長壽命進(jìn)而通過雜交選育優(yōu)良新品種具有重要意義。研究表明，芍藥屬植物花粉壽命的長短受多方面因素的制約。一是受其基因型的控制，基因型不同，花粉壽命差異明顯(李秉玲等，2010； 賈文慶等，2012； 石印等，2015)； 二是花粉含水量是影響花粉壽命的主要因素之一，低含水量是延長花粉壽命的有效手段，含水量6%～13%的芍藥屬種質(zhì)花粉貯存壽命長(施江等，2009； 李秉玲等，2010； 石印等，2015)。此外，貯存的環(huán)境極為重要，低溫、干燥和低氧環(huán)境可有效延長花粉壽命，在應(yīng)用較多的室溫干燥、低溫干燥、冷凍干燥貯存和超低溫貯存中，4 ℃貯存芍藥屬種質(zhì)花粉壽命為20～60天，-20 ℃貯存條件下花粉壽命為30～120天，而在-80 ℃、-196 ℃貯存環(huán)境中，矮牡丹、日本牡丹‘島大臣’(Paeoniasuffruticosa‘Shimadaijin’ )、牡丹‘鳳丹白’(Paeoniaostii‘Fengdan Bai’)等花粉壽命均超過1年，尤以-196 ℃液氮貯存條件下萌發(fā)率最高(施江等，2009； 李秉玲等，2010； 賈文慶等，2012； 石印等，2015)。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，室溫干燥下，大花黃牡丹花粉壽命僅有24天，而4 ℃、-20 ℃環(huán)境花粉壽命在3～4個(gè)月，分析可能是較高的溫度下花粉生理代謝較強(qiáng)，造成大量花粉發(fā)芽力喪失； -80 ℃、-196 ℃貯存1年的花粉萌發(fā)率分別達(dá)新鮮花粉的66.23%、99.67%，這表明大花黃牡丹花粉在這2種溫度下花粉壽命均超過1年。以上結(jié)果表明，低溫特別是超低溫是大花黃牡丹花粉長期貯存的最佳環(huán)境，可能是低溫降低了花粉的生理代謝，進(jìn)而延緩衰老延長了花粉壽命。綜上所述，-80 ℃由于經(jīng)濟(jì)適用，適宜大花黃牡丹跨年雜交花粉的貯存，而-196 ℃適合大花黃牡丹花粉的長期貯存。

3.2 花粉萌發(fā)率與MDA、AsA含量及保護(hù)酶的關(guān)系

植物體內(nèi)自由基、活性氧的產(chǎn)生與清除是平衡的，在正常生長條件下自由基、活性氧水平較低，低水平的自由基、活性氧不會造成損傷，且有一定的積極作用(Kanazawaetal.，2000)。在逆境或程序性死亡過程中，細(xì)胞內(nèi)活性氧、自由基種類數(shù)量大幅度增多，活性氧產(chǎn)生與清除的平衡被打破，損害生物膜及功能，植物一般通過提高抗氧化酶活性、合成AsA等抗氧化物質(zhì)啟動(dòng)防御系統(tǒng)，減少或避免對細(xì)胞功能的傷害(Liuetal.，2020； Renetal.，2020)。MDA是植物細(xì)胞膜系統(tǒng)受害、細(xì)胞凋亡的主要標(biāo)志物，測定MDA可以推斷貯存環(huán)境對花粉細(xì)胞是否造成傷害及傷害的程度(Dongetal.，2018； Zafraetal.，2018)。SOD在控制超氧陰離子的積累以防止膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化損傷中起著至關(guān)重要的作用，但SOD升高也增加了細(xì)胞中H2O2的濃度，而CAT、POD和其他抗氧化酶可以平衡H2O2的含量(Renetal.，2020)，且POD能消除酚、胺、醛、苯等的毒性 (Liuetal.，2020)。此外，某些引起植物氧化損傷的劇毒活性氧成分，例如不能被SOD、POD、CAT等抗氧化酶清除的超氧陰離子和羥自由基，也是引起細(xì)胞氧化損傷的主要因素，因此植物只能依靠非酶類物質(zhì)去除這些活性氧成分(Boseetal.，2014)，AsA是非酶抗氧化劑系統(tǒng)中的關(guān)鍵成分，是最有效的抗氧化劑之一，AsA不僅與H2O2反應(yīng)，而且與超氧陰離子自由基、羥自由基和脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)，從而維持活性氧的平衡狀態(tài)，保護(hù)細(xì)胞膜并參與其他抗氧化劑的再生(Renetal.，2020)。

室溫、4 ℃貯存條件下，大花黃牡丹花粉萌發(fā)率、MDA含量、AsA含量、3種保護(hù)酶活性的變化規(guī)律相似，隨著貯存時(shí)間的延長，花粉萌發(fā)率快速降低，MDA含量、AsA含量、3種保護(hù)酶活性基本呈升高然后迅速降低的趨勢，這可能是因?yàn)橘A存初期，在外界溫度和水分的脅迫下，花粉代謝紊亂，自由基增加，MDA增加膜質(zhì)過氧化加劇，為了維持代謝平衡，花粉細(xì)胞SOD、POD、CAT活性增加，合成AsA，協(xié)同花粉內(nèi)的脯氨酸、維生素E等清除過多的自由基、活性氧，以維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。但隨著貯存時(shí)間的延長，活性氧、自由基的過度積累導(dǎo)致細(xì)胞損傷嚴(yán)重，沒有過多的保護(hù)酶、AsA來防止損傷，出現(xiàn)氧化應(yīng)激，細(xì)胞受到損傷，花粉逐漸衰亡，因此花粉萌發(fā)率迅速下降。室溫下，SOD活性逐漸下降，POD活性在第24天，CAT活性、AsA含量在第40天達(dá)到高峰值，MDA含量第72天達(dá)到峰值； 而在4 ℃條件下，3種保護(hù)酶、AsA含量在第24天、第72天達(dá)到峰值，MDA含量則第184天才達(dá)到峰值，較室溫推遲112天，與SOD、CAT相比，POD、AsA含量的峰值推遲，在-20 ℃和-80 ℃時(shí)更明顯。這表明，與室溫相比，4 ℃下花粉活性氧積累較慢，膜系統(tǒng)傷害來得較遲，MDA含量達(dá)到峰值后下降可能是細(xì)胞凋亡后，MDA分解造成的； POD、AsA含量的峰值推遲可能是因?yàn)橘A存時(shí)花粉細(xì)胞不僅產(chǎn)生SOD、CAT可以清除的活性氧，還可能產(chǎn)生其他有毒物質(zhì)，如超氧陰離子自由基、羥自由基、胺或酚類物質(zhì)(Fecht-Christoffersetal.，2006； Liuetal.，2020)。

-20 ℃貯存下，貯存初期(第0～40天)大花黃牡丹花粉萌發(fā)率下降緩慢，SOD、POD活性及AsA含量持續(xù)增加，而CAT活性則在下降后緩慢上升，MDA含量則緩慢上升，可能是在這一時(shí)期花粉通過協(xié)調(diào)3種類型的保護(hù)酶、AsA含量來維持自由基的產(chǎn)生和消除之間的平衡，從而維持花粉發(fā)芽力。隨著貯存時(shí)間的延長，花粉萌發(fā)率明顯下降，MDA含量持續(xù)上升，SOD活性在第72天出現(xiàn)高峰后迅速下降，而POD、CAT活性及AsA含量則在120天達(dá)到高峰隨后下降，這表明第72天到120天，花粉中活性氧種類及其他有毒物質(zhì)如酚類或胺類物質(zhì)在增加，花粉通過不斷增加POD、CAT活性及AsA含量消除這些有毒物質(zhì)，從而減緩花粉活性的喪失(Fecht-Christoffersetal.，2006)。-20 ℃貯存第365天后，花粉萌發(fā)率僅為貯存前萌發(fā)率的12.9%，分析可能是因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)花粉中，自由基、活性氧積累過多，膜質(zhì)過氧化嚴(yán)重，花粉細(xì)胞損傷加劇，導(dǎo)致花粉無法萌發(fā)，只有一小部分花粉能夠產(chǎn)生保護(hù)酶、AsA來維持活性(賈文慶等，2015)。譚健暉(2011)的研究表明，在-20 ℃貯存358天后，馬尾松(Pinusmassoniana)的花粉仍然保持較高的萌發(fā)率(42.20%)和較強(qiáng)的抗氧化能力。這表明由于遺傳因素的不同，不同植物花粉的萌發(fā)和貯存特性不同。

-80 ℃貯存的早期(第0～72天)，大花黃牡丹花粉通過增加SOD活性、AsA含量來維持內(nèi)部代謝平衡，花粉萌發(fā)率緩慢下降； 貯存第72～184天，MDA含量持續(xù)增加，SOD活性不斷上升，CAT活性在下降后又上升，POD活性、AsA含量則持續(xù)上升，分別在第120、184天達(dá)到高峰，這表明此階段活性氧持續(xù)增加，需要協(xié)調(diào)3種保護(hù)酶及AsA含量清除有毒物質(zhì)維持花粉活性。貯存后期(184～365天)，花粉中的活性氧逐漸積累，MDA含量逐漸增加顯示膜質(zhì)過氧化逐漸加重，導(dǎo)致花粉萌發(fā)率逐漸下降，為了消除細(xì)胞中過多的活性氧，細(xì)胞SOD活性升高，在此期間，細(xì)胞內(nèi)的其他有毒物質(zhì)可能逐漸減少，所以細(xì)胞只需要增加CAT活性來清除H2O2，因此，POD活性、AsA含量緩慢下降，而CAT活性逐漸增加。因此，在花粉貯存過程中，影響花粉萌發(fā)率的不僅是活性氧，還有其他有毒物質(zhì)，具體還需要進(jìn)一步的研究。綜合來看，大花黃牡丹-80 ℃貯存期間，花粉3種保護(hù)酶、AsA含量、MDA含量總體變化幅度較-20 ℃、4 ℃、室溫下小，這可能是大花黃牡丹花粉貯存1年后萌發(fā)率仍保持在較高水平的原因。

許多植物花粉在超低溫貯存時(shí)出現(xiàn)“冷刺激”現(xiàn)象，日本牡丹、矮牡丹等芍藥屬植物花粉也有類似發(fā)現(xiàn)(李秉玲等，2010； 賈文慶等，2012)，其發(fā)生原因可能與貯存后花粉細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加、存在差異蛋白有關(guān)(李秉玲等，2010)。本研究發(fā)現(xiàn)，-196 ℃下大花黃牡丹花粉貯存前期(第0～40天)，花粉并非處于生理停滯狀態(tài)，同-80 ℃一樣，貯存第40天，花粉萌發(fā)率升高，出現(xiàn)“冷刺激”現(xiàn)象，較貯存前新鮮花粉分別提高1%和1.5%，伴隨著花粉萌發(fā)率的提高，花粉MDA含量降低，而SOD、POD、CAT、AsA含量升高，這表明超低溫下大花黃牡丹花粉細(xì)胞自由基、活性氧較少，膜質(zhì)過氧化程度低，花粉細(xì)胞健康程度提高，推測這可能是大花黃牡丹花粉萌發(fā)率“冷刺激”現(xiàn)象發(fā)生的生理原因，具體有待進(jìn)一步研究。貯存中后期(第40～365天)，MDA含量處于較低的水平，一直保持穩(wěn)定，而SOD、CAT、POD及AsA同樣保持穩(wěn)定，貯存過程中無顯著差異，這表明-196 ℃下貯存1年的過程中，花粉細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、POD及AsA協(xié)同作用，有效清除了多余的活性氧和其他有毒物質(zhì)，處于代謝平衡狀態(tài)，未造成嚴(yán)重的膜質(zhì)過氧化，這是大花黃牡丹花粉貯存后萌發(fā)率仍較高的原因。

前人研究表明，馬尾松、銀杏(Ginkgobiloba)、大花紅山茶(Camelliamagniflora)、芍藥(Paeonialactiflora)等植物花粉的保護(hù)酶活性、MDA和AsA含量與萌發(fā)率具有相關(guān)性(譚健暉，2011； 劉艷萍等，2013； 賈文慶等，2015； 石印等，2015)。花粉萌發(fā)率與5個(gè)生理指標(biāo)的相關(guān)分析表明，大花黃牡丹花粉在貯存過程中，SOD活性是影響花粉萌發(fā)、花粉壽命的最主要因子，其次的因子依次為CAT活性、AsA含量和POD活性； 膜質(zhì)過氧化是導(dǎo)致花粉凋亡的主要因素。這些結(jié)果表明SOD在大花黃牡丹花粉貯存過程可以有效清除活性氧，防止或減輕膜質(zhì)過氧化程度過高引起的細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)結(jié)果表明，室溫下隨著貯存時(shí)間的延長，大花黃牡丹花粉POD活性首先快速升高后降低，隨著花粉萌發(fā)率的迅速降低，SOD活性逐漸降低，CAT則緩慢升高后降低，之后隨著貯存時(shí)間的延長3種保護(hù)酶活性均迅速降低，說明POD在室溫下較為敏感。4 ℃下，SOD和CAT在第24天同時(shí)出現(xiàn)峰值，但2種酶的抗氧化能力有限，脅迫的加重POD活性升高，AsA含量增加，在第72天達(dá)到峰值，之后迅速降低，與此同時(shí)，花粉萌發(fā)率迅速下降，說明花粉SOD和CAT在4 ℃下較為敏感。-20 ℃、-80 ℃下，花粉SOD活性則首先快速升高，說明SOD較為敏感。綜上所述，POD在大花黃牡丹花粉室溫貯存時(shí)為敏感的保護(hù)酶，SOD在-20 ℃和-80 ℃貯存時(shí)為敏感的保護(hù)酶，而SOD和CAT在4 ℃貯存時(shí)為敏感的保護(hù)酶，這與本試驗(yàn)的相關(guān)分析一致。

4 結(jié)論

大花黃牡丹自然環(huán)境下花粉畸形率低，花粉的萌發(fā)率與飽滿率具有相關(guān)性； 適宜大花黃牡丹花粉萌發(fā)率檢測的培養(yǎng)基為120 g·L-1蔗糖+45 mg·L-1硼酸+55 mg·L-1GA3+30 mg·L-1CaCl2； 花粉貯存溫度直接影響大花黃牡丹的花粉萌發(fā)率，室溫適合大花黃牡丹花粉1～24天的短期貯存，4 ℃、-20 ℃適合雜交時(shí)間間隔在80～120天大花黃牡丹花粉的中期貯存，-80 ℃適合花粉的跨年貯存，而-196 ℃適合大花黃牡丹種質(zhì)花粉的長期貯存； 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，SOD活性是影響貯存期間大花黃牡丹花粉萌發(fā)、花粉壽命的最主要因子，其他因子依次為CAT活性、AsA含量和POD活性，膜質(zhì)過氧化是導(dǎo)致花粉死亡的主要因素?；ǚ奂?xì)胞內(nèi)代謝處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)、細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定是-196 ℃下大花黃牡丹花粉保持高萌發(fā)率的生理響應(yīng)； 室溫、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃貯存期間，花粉保護(hù)酶活性、抗壞血酸含量顯著升高后迅速降低，清除活性氧、自由基能力下降，活性氧、自由基積累過多，膜質(zhì)過氧化程度加劇，細(xì)胞損傷嚴(yán)重是貯存期間花粉萌發(fā)率下降的主要原因。