文 霞， 陳漪汶， 張淑瑤， 謝小保

廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室,廣東 廣州 510070

1 VBNC的研究現(xiàn)狀

活的但不可培養(yǎng)(viable but nonculturable,VBNC)狀態(tài)是微生物的一種生存策略，在這種狀態(tài)下，微生物不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長，但是其生命狀態(tài)是活的，可以以呼吸或發(fā)酵形式表現(xiàn)出活躍的新陳代謝和蛋白質(zhì)合成功能。在適宜的條件下，微生物可以恢復(fù)到可培養(yǎng)狀態(tài)[1]。一般的不利于生長的環(huán)境條件可誘導(dǎo)微生物進入VBNC狀態(tài)，如不適的溫度[2,3]、pH(酸性環(huán)境)[4]、光照(紫外線、輻射等)[5,6]、高壓[7]、高鹽[8]、缺氧[9]、保存方式[10]等；另外，各種化學(xué)試劑也可促使VBNC狀態(tài)微生物出現(xiàn)，如在食品和醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)，已有研究報道抗微生物劑(防腐劑、抗生素)可促進VBNC狀態(tài)微生物大量產(chǎn)生[11,12]。ROBBEN等用630種表面活性劑/鹽組合物進行的篩選研究表明，表面活性劑與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Listeriamonocytogenes、大腸桿菌Escherichiacoli、腸道沙門氏菌血清變種Salmonellaentericasubsp.enterica、鼠傷寒沙門氏菌Salmonellatyphimurium，金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus和產(chǎn)生毒素的腸致病性大腸桿菌enteropathogenicE.coli中的VBNC誘導(dǎo)和疏水性之間存在相關(guān)性[13]、氯處理可誘導(dǎo)大腸桿菌進入VBNC狀態(tài)[14]、SO2可誘導(dǎo)乳酸菌進入VBNC狀態(tài)[15]。研究發(fā)現(xiàn)壓力環(huán)境會導(dǎo)致毒素和抗毒素蛋白之間的比例失調(diào)，影響蛋白質(zhì)的合成和分裂，從而導(dǎo)致生長停滯和休眠[16]，如Ⅱ型毒素-抗毒素系統(tǒng)(TAS)在誘導(dǎo)VBNC狀態(tài)中起重要作用[17]，VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)的另一個因素是在培養(yǎng)期間過氧化氫酶的損失[18]，暴露于單氯胺后VBNC狀態(tài)的大腸桿菌轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因下調(diào)3倍，蛋白質(zhì)合成代謝減少，應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因(rpoS，uspA)下調(diào)[19]。

細(xì)菌在VBNC狀態(tài)下的特征有如下幾點：1)維持明顯的細(xì)胞完整性；2)具有某種形式的可測量的細(xì)胞活性[20]；3)具有可恢復(fù)培養(yǎng)性的能力[21]；4)通過特定基因表達(dá)對外部刺激作出反應(yīng)[22]；5)代謝活性低[23]；6)細(xì)菌形態(tài)變化，表現(xiàn)出比正常細(xì)胞短小的形態(tài)[24]；7)營養(yǎng)物質(zhì)的運輸減少；8)ATP含量高且具有較高的膜電位[25]；9)對細(xì)胞質(zhì)膜中的脂肪酸組成進行了廣泛的修飾[26]；10)細(xì)胞壁肽聚糖內(nèi)，交聯(lián)增加，帶有共價結(jié)合脂蛋白的多肽增加，聚糖鏈的平均長度縮短[27]；11)比成倍增長的細(xì)胞具有更高的自溶能力；12)保留質(zhì)粒；13)增加抗生素抗藥性，降低代謝活性[28]；14)外膜蛋白質(zhì)譜的變化[29]；15)連續(xù)基因表達(dá)[30]。由于復(fù)蘇和表型研究難以區(qū)分VBNC細(xì)胞和休眠細(xì)胞，VBNC狀態(tài)一直存在爭議[31-33]。無論是VBNC還是持續(xù)性細(xì)胞，都是微生物的一種生存方式，都具有傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法無法檢出的特點，同時具有可復(fù)蘇的能力，基于這些特性，只要涉及到與微生物相關(guān)的行業(yè)，都會有VBNC狀態(tài)微生物的存在。如在食品發(fā)酵行業(yè)，如果微生物進入VBNC狀態(tài)，不僅影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且發(fā)酵食品中一些有害微生物的存在會對人體健康造成威脅。

2 用于食品發(fā)酵的微生物種類

發(fā)酵食品是微生物群落作用的產(chǎn)物，因為它們以未經(jīng)加工的植物或動物為底物，與器皿，容器和環(huán)境中的天然微生物群落之間進行相互作用或加入含有功能性微生物的發(fā)酵劑。微生物在發(fā)酵過程中改變了原料的化學(xué)成分，豐富了一些發(fā)酵食品的營養(yǎng)價值，給消費者的健康帶來了益處。乳酸菌廣泛存在于許多發(fā)酵食品和飲料中[34]，目前從全球各地分離出來產(chǎn)乳酸的乳酸菌屬主要有Alkalibacteriumsp.，肉食桿菌屬Carnobacteriumsp.，腸球菌Enterococcussp., 乳桿菌屬Lactobacillussp.，乳球菌屬Lactococcussp.，明串珠菌屬Leuconostocsp.，酒球菌屬Oenococcussp.，片球菌屬Pediococcussp.，鏈球菌屬Streptococcussp.，四鏈球菌屬Tetragenococcussp.，漫游球菌屬Vagococcussp.和 魏斯氏菌屬Weissellasp.[35]；芽孢桿菌主要存在于堿性發(fā)酵食品中[36]，種類有解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens、環(huán)狀芽孢桿菌Bacilluscirculans、凝結(jié)芽孢桿菌Bacilluscoagulans、堅強芽孢桿菌Bacillusfirm、地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis、巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium、短小芽孢桿菌Bacilluspumilus、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、和蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis等[37]，微球菌屬Micrococcussp.和葡萄球菌屬Staphylococcussp.從發(fā)酵的牛奶、香腸和魚中分離出來，雙歧桿菌屬Bifidobacteriumsp.、短狀桿菌屬Brachybacteriumsp.、短桿菌屬Brevibacteriumsp.和丙酸桿菌屬Propionibacteriumsp.從奶酪中分離出來[38]，陰溝腸桿菌Enterobactercloacae、肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae、鹽厭氧菌屬Halobacteriumsp.、鹽球菌屬Halococcussp.、丙酸桿菌屬Propionibacteriumsp.、假單胞菌屬Pseudomonassp.[34]從全球的發(fā)酵食品中分離出來。另一類從發(fā)酵食品或酒精飲料中分離出的微生物是酵母菌，包括酒香酵母屬Brettanomycessp., 假絲酵母屬Candidasp.，隱球酵母屬Cryptococcussp.，德巴利氏酵母屬Debaryomycessp.，德克酵母屬Dekkerasp.，耐堿酵母Galactomycessp.，地絲菌屬Geotrichumsp.，漢遜酵母屬Hansenulasp.，漢森氏酵母Hanseniasporasp.，絲孢畢赤酵母屬Hyphopichiasp., 伊莎酵母Issatchenkiasp.，哈薩克斯坦酵母屬Kazachstaniasp.等[39]。另外，絲狀霉菌在發(fā)酵食品和酒精飲料中的主要作用是酶的產(chǎn)生和抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解，主要有放射毛霉屬Actinomucorsp.,淀粉霉屬Amylomycessp.,曲霉屬Aspergillussp.,紅曲霉屬Monascussp.,毛霉屬Mucorsp.,脈孢菌屬Neurosporasp.,Parcilomycessp.,青霉屬Penicilliumsp.,根霉屬Rhizopussp.和黑粉菌屬Ustilagosp.[40]。

3 微生物VBNC狀態(tài)對食品發(fā)酵過程的影響

食品發(fā)酵環(huán)境中的微生物種群繁多，它們有不同的來源和生長需求，由于微生物極其多樣且高度動態(tài)，因此在食品微生物發(fā)酵中存在的許多不同類型的微生物物種可以有多種生理狀態(tài)，這些生理狀態(tài)對生存和維持生長具有不同的作用。在微生物發(fā)酵過程中，水活度、酸堿度、氧化還原電位，饑餓或者使用保存的發(fā)酵劑進行發(fā)酵都可使微生物進入VBNC狀態(tài)，并且持續(xù)存在。催化活性的定量化可以測量不同細(xì)胞亞型對整個發(fā)酵過程的貢獻(xiàn)，這對生物過程的優(yōu)化至關(guān)重要。盡管在標(biāo)準(zhǔn)條件下喪失了可培養(yǎng)性，但VBNC細(xì)胞仍然是活著的，可以維持運輸系統(tǒng)和生物合成，并且能夠進行基因表達(dá)和代謝底物。LAHTINEN等報道[41]了在發(fā)酵產(chǎn)品貯藏過程中含有乳雙歧桿菌、長雙歧桿菌和動物雙歧桿菌的VBNC益生菌。MILLET和LONVAUD-FUNEL等報道[42]，葡萄酒發(fā)酵菌株Oenococcusoeni在缺乏O2的情況下可進入VBNC狀態(tài)。釀酒酵母菌Saccharomycescerevisiae也可響應(yīng)二氧化硫壓力而進入VBNC狀態(tài)[43]。因此，研究這些菌株在VBNC狀態(tài)下的形成和復(fù)蘇對其在食品發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用具有重要價值。

有研究者選擇蘋果汁蘋果酸乳酸發(fā)酵(MLF)為模型系統(tǒng)，闡明了希氏乳桿菌LactobacillushilgardiiVBNC細(xì)胞在生物發(fā)酵過程中的作用。作者首先添加一定量的SO2誘導(dǎo)乳酸菌存活但不可培養(yǎng)的細(xì)胞亞群的產(chǎn)生，通過發(fā)酵動力學(xué)模型分析了活的可培養(yǎng)的細(xì)胞與VBNC細(xì)胞在蘋果酸乳酸發(fā)酵過程中的作用，結(jié)果顯示進行MLF的VBNC細(xì)胞表現(xiàn)出代謝活性降低的狀態(tài)。在所有測試中，VBNC細(xì)胞均占總微生物數(shù)量的大部分(70%至90%)，VBNC亞群的特定蘋果酸攝取率約為存活種群的50%，而與培養(yǎng)基組成和SO2濃度無關(guān)。這些結(jié)果可能有助于從數(shù)量上闡明VBNC亞群對發(fā)酵過程的真正貢獻(xiàn)，該結(jié)果對于工業(yè)規(guī)模的生物過程控制和優(yōu)化是有價值的[44]。

釀酒酵母是乙醇發(fā)酵最常見的微生物，但也可以引起酒類發(fā)酵產(chǎn)物的腐敗，如布魯塞爾酒香酵母Brettanomycesbruxellensis被認(rèn)為是紅葡萄酒中主要的腐敗酵母菌，這對葡萄酒行業(yè)來說是一個嚴(yán)重的問題，因為它能夠通過酶的轉(zhuǎn)化，將羥基肉桂酸轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性酚，從而使最終產(chǎn)品產(chǎn)生異味，盡管在釀造過程中有很多培養(yǎng)技術(shù)用來檢測這種酵母的存在，但在一些情況下，布魯塞爾酒香酵母是無法檢測到的，從而導(dǎo)致最終發(fā)酵產(chǎn)物受到酵母菌種產(chǎn)生的酚類氣味的影響，造成巨大的經(jīng)濟損失[45]。這一現(xiàn)象最具有說服力的解釋是布魯塞爾酒香酵母進入了VBNC狀態(tài)，無法在分離培養(yǎng)基中檢出[46]。在葡萄酒行業(yè)，已有一些研究表明，用作食品保鮮劑的抗菌劑二氧化硫可以誘導(dǎo)酵母菌進入VBNC狀態(tài)，并證明了酵母菌通過升高培養(yǎng)基的pH和從培養(yǎng)基中除去SO2的方式復(fù)蘇到可培養(yǎng)狀態(tài)[47,48]。考慮到種內(nèi)變異性，有研究者采用熒光顯微鏡觀察了三株布魯塞爾酒香酵母菌株之間可培養(yǎng)性的差異性，旨在觀察SO2與溫度的最佳組合是否可以減少或消除布魯塞爾酒香酵母引起的變質(zhì)，同時利用臺盼藍(lán)染色法對基安蒂地區(qū)不同酒莊的85株酵母分離株中具有代表性的7株菌進行了分析，結(jié)果表明，布魯塞爾酒香酵母菌經(jīng)濃度為1 mg/L的SO2暴露24 h后，不同程度地誘導(dǎo)了不可培養(yǎng)狀態(tài)的產(chǎn)生[49]。關(guān)于不同類型的高溫發(fā)酵已經(jīng)有了較多的研究報告，但是只有少數(shù)報告研究了高溫發(fā)酵過程中細(xì)胞活力的變化。例如，以葡萄糖酸發(fā)酵為例，在38 ℃下可將葡萄糖氧化成葡萄糖酸的耐熱木醋桿菌Acetobactersenegalensis，在不同碳源和生理生化條件下可進入VBNC狀態(tài)。在發(fā)酵過程中，葡萄糖消耗的速率和葡萄糖酸鹽產(chǎn)生的速率逐漸降低，這與細(xì)胞脫氫酶活性，細(xì)胞包膜完整性和細(xì)胞可培養(yǎng)性以及VBNC細(xì)胞形成相關(guān)。靜止期細(xì)胞進入VBNC的部分原因是發(fā)酵溫度高和葡萄糖的長期氧化。在靜止期形成的VBNC細(xì)胞中，有約48%通過向培養(yǎng)基中添加其他低濃度的碳源(乙醇)和/或?qū)⑴囵B(yǎng)溫度降低到30 ℃而得以復(fù)蘇。這表明乙醇作為一種有利的碳源，可促進VBNC細(xì)胞的復(fù)蘇。由于在高溫發(fā)酵過程中通常不可避免地會形成VBNC細(xì)胞，因此使用替代碳源以及不斷改變理化條件可以使VBNC細(xì)胞復(fù)蘇并可用于多個生產(chǎn)周期，從而提高發(fā)酵效率[50]。運動發(fā)酵單胞菌Zymomonasmobilis可以耐受較高的乙醇濃度，其乙醇的生產(chǎn)速度比酵母快五倍，有更高的產(chǎn)量和較低的殘留生物量[51]，該微生物已成為工業(yè)化生產(chǎn)生物乙醇的重要候選微生物[52]，有研究者認(rèn)為當(dāng)乙醇濃度高于臨界濃度時，VBNC狀態(tài)的運動發(fā)酵單胞菌Zymomonasmobilis在恒化器的持續(xù)震蕩中起主要作用[53]，在特定的乙醇濃度條件下，長度達(dá)到500 μm的絲狀細(xì)菌會出現(xiàn)在持續(xù)震蕩的培養(yǎng)液中，這些VBNC細(xì)胞能夠產(chǎn)生乙醇，但是無法自我繁殖。

4 食品發(fā)酵中VBNC狀態(tài)微生物的檢測方法

由于VBNC狀態(tài)微生物在食品安全及公共衛(wèi)生方面的重要性，使得研發(fā)其有效的檢測方法也尤為重要，特別是在食品發(fā)酵過程中，為了更好的研究發(fā)酵微生物種群的狀態(tài)，需要對發(fā)酵菌種進行準(zhǔn)確檢測。當(dāng)細(xì)菌進入VBNC狀態(tài)時，它們通常具有兩個明顯的特征：細(xì)菌具有代謝活性，但不能在常規(guī)的非選擇性培養(yǎng)基上正常生長而形成菌落。由于VBNC細(xì)胞的不可培養(yǎng)特性，傳統(tǒng)的微生物檢測方法無效。因此，主要基于VBNC細(xì)胞的生存能力建立了一些檢測方法：(1)直接活菌計數(shù)法(DVC)，VBNC細(xì)胞進行抗生素處理(納西地酸，氨曲南，環(huán)丙沙星等)使其伸長而不分裂，通過顯微鏡進行直接計數(shù)，但是，細(xì)菌對抗生素的反應(yīng)在很大程度上取決于物種，有時吸收養(yǎng)分后不會延長，這極大地限制了這種方法的準(zhǔn)確性[54]。(2)LIVE/DEAD Baclight染色法基于細(xì)胞質(zhì)膜完整性，結(jié)合兩種熒光染料SYTO 9和碘化丙啶(PI)來評估細(xì)胞活力[55]。SYTO 9(一種綠色熒光染料)可以滲透完整或受損的細(xì)胞膜，而PI(一種紅色熒光染料)只能穿透受損的細(xì)胞膜并與SYTO 9競爭結(jié)合核酸?？梢酝ㄟ^熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀(FCM)檢查染色的細(xì)胞，進行細(xì)胞計數(shù)。由于VBNC細(xì)胞還具有整合的細(xì)胞質(zhì)膜，因此該方法也可用于量化種群細(xì)胞。(3)分子生物學(xué)的發(fā)展使PCR成為檢測細(xì)菌的最佳方法，多項研究表明，qPCR在檢測發(fā)酵過程中不同的酵母和細(xì)菌方面比其他分子工具更具有特異性[56,57]。但是，普通qPCR的結(jié)果并不夠準(zhǔn)確，因為該檢測只對總DNA進行定量，而沒有區(qū)分死的和活的微生物。有報道在DNA提取前用疊氮溴化丙錠(PMA)處理細(xì)菌細(xì)胞后VBNC細(xì)胞可以通過定量PCR進行定量，因為PMA可以通過受損的膜與DNA結(jié)合并抑制其擴增[58]。有研究者將該方法用于檢測不同食品發(fā)酵樣品中的VBNC細(xì)菌，在紅曲糯米酒中，植物乳桿菌為4.0×100CFU/mL，釀酒酵母為2.6×101CFU/mL，紫紅曲霉為8.8×101CFU/mL[59]。NAVARRO等研究表明利用活染料PMAxx結(jié)合qPCR是一種可靠、特異、快速的混合酒精發(fā)酵種群動態(tài)的監(jiān)測方法[60]。(4)其它新型檢測方法：噬菌體介導(dǎo)的檢測方法主要通過將標(biāo)記的噬菌體附著到其特定細(xì)菌宿主上，使用噬菌體將可測量的標(biāo)記物轉(zhuǎn)運到宿主中或從宿主釋放的子代噬菌體的產(chǎn)物中擴增[61]。另一種檢測方法是使用生物傳感器將生物分子轉(zhuǎn)換為可測量的電或光信號輸出。有報道將其用于活細(xì)胞和VBNC大腸桿菌的定量檢測，該方法在10～106CFU/mL的線性范圍內(nèi)的LOD為22 CFU/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%，表明有較好的重現(xiàn)性[62]。還有一種經(jīng)濟高效的檢測方法是ATP熒光檢測法，即細(xì)菌被裂解后通過熒光素酶的催化作用將釋放出來的ATP與熒光素反應(yīng)，可以記錄熒光值，并將其轉(zhuǎn)換為ATP濃度，其與VBNC微生物的濃度成正比[63]。

5 總結(jié)

經(jīng)過數(shù)十年的研究，人們對VBNC細(xì)胞的生理、生物化學(xué)和遺傳學(xué)方面的知識有了一定的了解，但其功能和生物學(xué)意義仍存在激烈的爭論。對于VBNC細(xì)胞的檢測、形成和復(fù)蘇，還需要進行更深入的研究，尤其是在微生物發(fā)酵工程方面，VBNC狀態(tài)大多數(shù)存在于一個混合系統(tǒng)中，包括損傷細(xì)胞、可培養(yǎng)細(xì)胞及并沒有完全被消除的死亡細(xì)胞，干擾了VBNC細(xì)胞形成和復(fù)蘇的生理特征和分子機制的研究結(jié)果和結(jié)論。另外，VBNC細(xì)胞的檢測對其研究至關(guān)重要，雖然目前也發(fā)展了許多檢測方法，如染料法、流式細(xì)胞術(shù)、PMA-PCR等，但是它們也有其自身的缺點。因此，需要研發(fā)快速，靈敏，廉價且易于操作的用于檢測VBNC細(xì)胞的新方法?？傊谖⑸锇l(fā)酵優(yōu)化和控制過程中，尤其是食品發(fā)酵中，應(yīng)充分考慮到微生物VBNC狀態(tài)的存在。