李梅，歐大明，黃麗芳，謝立虎，張濟(jì)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身炎癥性疾病，其特征性病理改變?yōu)槁曰ぱ准盎そM織增生，最終可致關(guān)節(jié)和骨骼破壞［1］。成 纖 維 樣 滑 膜 細(xì) 胞（fibroblast?like synoviocytes，F(xiàn)LSs）被認(rèn)為是介導(dǎo)RA關(guān)節(jié)破壞的主要效應(yīng)細(xì)胞，釋放多種細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)、滑膜增生、關(guān)節(jié)破壞等過(guò)程中起著重要作用。因此，滑膜組織中的FLSs是RA炎癥介質(zhì)的主要來(lái)源，在RA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［2］。牡丹皮作為我國(guó)傳統(tǒng)藥用植物，其主要成分是丹皮酚（Paeonol），具有抗炎和保護(hù)心血管等多種生物功能［3］。有研究表明，丹皮酚對(duì)皮炎、關(guān)節(jié)炎和急性感染等疾病具有治療作用［4］。然而，丹皮酚對(duì)滑膜炎、RA的治療效果及其作用機(jī)制尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在分析丹皮酚對(duì)白細(xì)胞介素（IL）?1β誘導(dǎo)人類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（HFLS?RA）及膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠的治療作用，為RA治療藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料丹皮酚購(gòu)自國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局，純度98%；IL?1β購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒和腫瘤壞死因子（TNF）?α、IL?6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自南京逸飛雪生物科技有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）?1、MMP?3抗體購(gòu)自武漢博斯特生物技術(shù)公司；Toll樣受體?4（TLR4）、anti?NF?κB p65、甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗和Alexa Fluor 488偶聯(lián)的驢抗羊IgG二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；RIPA裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；Mini?PROTEAN電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio?Rad公司；FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HFLS?RA細(xì)胞購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司，采用DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，添加10%胎牛血清，每2 d更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)HFLS?RA細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為95%時(shí)，采用胰蛋白酶消化，以1∶4進(jìn)行傳代，取第3～8代的HFLS?RA細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活能力將HFLS?RA細(xì)胞以密度1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組（未加IL?1β或丹皮酚處理），10μg/L IL?1β組（HFLS?RA經(jīng)10μg/L IL?1β誘導(dǎo)）及0.1、1、10、100μmol/L丹皮酚組（HFLS?RA經(jīng)10 μg/L IL?1β誘導(dǎo)及0.1、1、10、100μmol/L丹皮酚干預(yù)）。培養(yǎng)24 h后，加入25μL MTT溶液，37℃孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO溶液，振動(dòng)篩上混勻15 min。采用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)540 nm處的光密度（OD）值。

1.4 ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子水平將HFLS?RA細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種至6孔板中，細(xì)胞分組同1.3，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度約為80%時(shí)，吸取各組上清液，2 000 r/min離心20 min，置于無(wú)菌管中，?20℃保存；按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)HFLS?RA細(xì)胞中TNF?α、IL?6水平。

1.5 免疫熒光法觀(guān)察HFLS?RA中NF?κB p65細(xì)胞核移位將HFLS?RA細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)皿，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組（未加IL?1β或丹皮酚處理）、10μg/L IL?1β組（HFLS?RA經(jīng)10μg/L IL?1β誘導(dǎo)培養(yǎng)30 min）及10μmol/L丹皮酚組（HFLS?RA經(jīng)IL?1β誘導(dǎo)培養(yǎng)30 min后，加入10μmol/L丹皮酚作用1 h）。將HFLS?RA固定、滲透、加入anti?NF?κB p65一抗（稀釋比例1∶100）孵育過(guò)夜，然后用Alexa Fluor 488偶聯(lián)的驢抗羊IgG二抗（稀釋比例1∶600）孵育，進(jìn)行DAPI，后進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡拍攝，采用ImagePro Plus 6.0軟件分析p65細(xì)胞核移位。

1.6 Western blot檢測(cè)MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白的表達(dá)將HFLS?RA細(xì)胞分為空白對(duì)照組，10μg/L IL?1β組，0.1、1、10μmol/L丹皮酚組以及陰性對(duì)照組，陰性對(duì)照組HFLS?RA未經(jīng)IL?1β誘導(dǎo)，加入10μmol/L丹皮酚處理1 h，其余組處理方法同1.5。HFLS?RA經(jīng)不同濃度丹皮酚預(yù)處理后，用預(yù)冷PBS清洗，添加RIPA裂解緩沖液，BCA法測(cè)定蛋白濃度并調(diào)至一致。將蛋白樣品和加樣緩沖液混合煮沸至變性，取等量（25μg）蛋白質(zhì)進(jìn)行10%～12.5%SDS?PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，用5%（W/V）脫脂牛奶封閉2 h，MMP?1（稀釋比例1∶1 000）、MMP?3（稀釋比例1∶500）、TLR4（稀釋比例1∶1 000）和GAPDH（稀釋比例1∶1 000）一抗4℃孵育過(guò)夜。隨后，TBST洗膜，用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）結(jié)合的IgG二抗（1∶2 500）室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，曝光成像。采用fluochem?HD2化學(xué)發(fā)光儀和AlphaView?SA軟件對(duì)譜帶光密度進(jìn)行分析。

1.7 動(dòng)物分組與處理24只雄性DBA/1小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，7～8周齡，購(gòu)自桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK桂2015?0012。動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境（24±1）℃下飼養(yǎng)，相對(duì)濕度（56±5）%，本研究方案經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法將小鼠分為對(duì)照組、CIA組和治療組3組，每組8只。CIA組和治療組依據(jù)文獻(xiàn)［5］制作CIA小鼠模型，取500μL雞Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑按1∶1充分乳化，在大鼠尾根部皮下注射0.1 mL乳劑，初次免疫當(dāng)天作為第0天，第7天按上述方法、相同劑量（0.1 mL/只）加強(qiáng)1次；對(duì)照組僅注射等體積的生理鹽水；治療組小鼠造模成功后，于第10～48天每隔1天灌胃10 mg/kg丹皮酚。分別于第0、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48天觀(guān)察小鼠臨床癥狀，并根據(jù)大鼠每個(gè)關(guān)節(jié)的病變程度進(jìn)行累計(jì)積分（四肢累計(jì)評(píng)分）。四肢評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［6］，0分：無(wú)關(guān)節(jié)炎；1分：有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹；2分：關(guān)節(jié)部位中度腫脹；3分：嚴(yán)重腫脹；4分：嚴(yán)重腫脹且不能負(fù)重。四肢累計(jì)評(píng)分≥4分，視為造模成功。在初次免疫后第48天，采用戊巴比妥（90 mg/kg）麻醉小鼠實(shí)施安樂(lè)死。

1.8 HE染色觀(guān)察關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變初次免疫后第48天，處死小鼠后取踝關(guān)節(jié)滑膜組織，用4%多聚甲醛固定，隨后用10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣，石蠟包埋，制作5μm厚切片，行常規(guī)HE染色，進(jìn)行組織學(xué)觀(guān)察。

1.9 ELISA法測(cè)定大鼠滑膜組織中炎性因子水平各組小鼠處死后，無(wú)菌條件下，鈍性分離踝關(guān)節(jié)周?chē)募‰?、韌帶和脂肪組織等，剝離滑膜組織，按照質(zhì)量（g）∶體積（mL）1∶9加入預(yù)冷的生理鹽水，制成10%勻漿液，機(jī)械勻漿，2 000 r/min離心20 min，吸取上清液保存。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)小鼠滑膜組織中TNF?α、IL?1β水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以x±s表示，不同時(shí)點(diǎn)各組間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD?t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)HFLS?RA細(xì)胞增殖情況與空白對(duì)照組比較，10μg/L IL?1β可促進(jìn)HFLS?RA細(xì)胞增殖（P＜0.05）；與10μg/L IL?1β組比較，0.1、1、10、100μmol/L丹皮酚對(duì)IL?1β誘導(dǎo)HFLS?RA細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

Fig.1 Effects of paeonol on IL?1βinduced cell proliferation in HFLS?RA圖1 丹皮酚對(duì)IL?1β誘導(dǎo)HFLS?RA細(xì)胞增殖的影響

2.2 ELISA法檢測(cè)HFLS?RA細(xì)胞中TNF?α、IL?6水平10μg/L IL?1β組TNF?α、IL?6水平明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；0.1、1、10、100μmol/L丹皮酚組TNF?α、IL?6水平均低于10μg/L IL?1β組（P＜0.05）；1、10μmol/L丹皮酚組TNF?α水平低于0.1 μmol/L丹皮酚組（P＜0.05），100μmol/L丹皮酚組TNF?α水平與0.1、1、10μmol/L丹皮酚組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；0.1、1、10μmol/L丹皮酚組IL?6水平依次降低（P＜0.05），100μmol/L丹皮酚組IL?6水平低于0.1μmol/L丹皮酚組，高于10μmol/L丹皮酚組（P＜0.05），與1μmol/L丹皮酚組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

Fig.2 The concentration of TNF?αand IL?6 in cell supernatant between groups圖2 各組細(xì)胞上清液中TNF?α、IL?6水平比較

2.3 免疫熒光法觀(guān)察NF?κB p65核移位情況10μg/L IL?1β組HFLS?RA中NF?κB p65核移位陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組和10μmol/L丹皮酚組（P＜0.05），見(jiàn)圖3、4。

2.4 Western blot法檢測(cè)MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白的表達(dá)10μg/L IL?1β組MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；0.1μmol/L丹皮酚組MMP?1、MMP?3和TLR4

Fig.4 Effects of paeonol on nuclear translocation of NF?κB p65 in HFLS?RA圖4 丹皮酚對(duì)HFLS?RA中NF?κB p65核移位的影響

蛋白表達(dá)水平與10μg/L IL?1β組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1、10μmol/L丹皮酚組MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白表達(dá)水平低于10μg/L IL?1β組（P＜0.05）；1 μmol/L丹皮酚組MMP?1、MMP?3蛋白表達(dá)水平低于0.1μmol/L丹皮酚組（P＜0.05），TLR4蛋白表達(dá)水平與0.1μmol/L丹皮酚組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；10 μmol/L丹皮酚組MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白表達(dá)水平低于1μmol/L丹皮酚組，高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖5、6。

Fig.5 The protein expressions of TLR4,MMP?1 and MMP?3 in HFLS?RA detected by Western blot assay圖5 Western blot法檢測(cè)HFLS?RA中TLR4、MMP?1和MMP?3蛋白表達(dá)

2.5 各組小鼠四肢累計(jì)評(píng)分比較初次免疫第0、15、18、21天，3組四肢累計(jì)評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；從第24天開(kāi)始，CIA組四肢累計(jì)評(píng)分明顯高于對(duì)照組；從第27天開(kāi)始，治療組四肢累計(jì)評(píng)分高于對(duì)照組，低于CIA組（P＜0.05）；從第36天開(kāi)始，CIA組和治療組組內(nèi)四肢累計(jì)評(píng)分無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖7。

Fig.6 Comparison of TLR4,MMP?1 and MMP?3 protein expression in HFLS?RA圖6 HFLS?RA中TLR4、MMP?1和MMP?3蛋白表達(dá)情況比較

Fig.7 The clinical score of arthritis in each group圖7 各組小鼠四肢累計(jì)評(píng)分

2.6 HE染色觀(guān)察小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)變化對(duì)照組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織排列整齊，未見(jiàn)充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象；CIA組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)炎、滑膜增生和軟骨組織病理學(xué)破壞；而治療組在第48天時(shí)踝關(guān)節(jié)病理變化較CIA組有所改善，其中炎性細(xì)胞明顯下降，軟骨破壞減輕，見(jiàn)圖8。

2.7 ELISA法檢測(cè)各組小鼠滑膜組織中TNF?α、IL?1β水平與對(duì)照組相比，CIA組小鼠滑膜組織中TNF?α、IL?1β水平明顯升高；與CIA組比較，治療組TNF?α、IL?1β水平降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖9。

Fig.9 The TNF?αand IL?1βcontents in synovium of mice圖9 小鼠滑膜組織中TNF?α、IL?1β水平

3 討論

RA是一種病因不明的慢性全身性疾病，其基本病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥形成侵襲性血管翳，破壞軟骨、骨及周?chē)M織［7］。由于IL?1β、TNF?α和IL?6等各類(lèi)促炎細(xì)胞因子在RA滑膜炎癥中具有重要作用，因此抗炎被認(rèn)為是RA的主要治療方法［8?9］。丹皮酚是從全草和毛茛科芍藥屬植物牡丹、芍藥根皮或蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿干燥根中提取分離出來(lái)的活性成分，其藥理學(xué)活性廣泛［10］。有研究表明，丹皮酚在各種組織和細(xì)胞中具有抗炎作用［11］，然而其對(duì)RA中促炎細(xì)胞因子的影響尚不明確。

在RA病理機(jī)制中，F(xiàn)LS活化增殖起著關(guān)鍵作用，其產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和炎性趨化因子，如IL?6、IL?8和IL?15等，還能促進(jìn)白細(xì)胞自血管內(nèi)遷入滑膜、聚集于關(guān)節(jié)滑膜組織，使RA患者進(jìn)入FLS過(guò)度增殖、遷移以及骨和軟骨破壞的惡性循環(huán)中，最終導(dǎo)致殘疾［12］。本研究MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，10μg/L IL?1β作用48 h可顯著提高HFLS?RA細(xì)胞增殖能力，而丹皮酚在0.1～100μmol/L劑量下對(duì)IL?1β誘導(dǎo)的HFLS?RA細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用；ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，IL?1β誘導(dǎo)后HFLS?RA細(xì)胞中TNF?α和IL?6水平明顯升高，提示炎性環(huán)境下會(huì)促使HFLS?RA釋放炎性因子；而經(jīng)不同濃度丹皮酚預(yù)處理后，HFLS?RA中TNF?α和IL?6水平降低，提示丹皮酚具有調(diào)節(jié)HFLS?RA介導(dǎo)的炎癥作用；HE染色結(jié)果示CIA小鼠踝關(guān)節(jié)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)炎、滑膜增生和軟骨組織病理學(xué)破壞，這與ELISA檢測(cè)結(jié)果基本一致。經(jīng)丹皮酚治療后能減輕CIA小鼠滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞，進(jìn)一步提示丹皮酚具有治療RA滑膜炎癥的作用。

在調(diào)節(jié)促炎基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子中，NF?κB是一種能調(diào)節(jié)多種炎癥和免疫基因表達(dá)的誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［13］。TLR4是天然免疫系統(tǒng)識(shí)別主要受體，可引起NF?κB活化和炎性因子分泌，激活NF?κB，促使其核轉(zhuǎn)位，啟動(dòng)下游炎性因子和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯［14］。免疫熒光法觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，IL?1β誘導(dǎo)HFLS?RA中NF?κB?p65核移位，而丹皮酚抑制NF?κB p65的核移位，提示丹皮酚能靶向治療NF?κB介導(dǎo)的滑膜炎癥。此外，Western blot結(jié)果顯示，丹皮酚顯著抑制IL?1β誘導(dǎo)的HFLS?RA中TLR?4蛋白的表達(dá)，筆者推測(cè)丹皮酚可能通過(guò)下調(diào)TLR?4表達(dá)，抑制NF?κB信號(hào)通路激活，從而抑制促炎細(xì)胞因子釋放。這與ELISA檢測(cè)結(jié)果基本一致，丹皮酚可顯著降低小鼠滑膜組織中炎性因子TNF?α和IL?1β水平。

MMPs是一組鋅離子依賴(lài)性?xún)?nèi)肽酶，滑膜細(xì)胞來(lái)源的MMPs是導(dǎo)致關(guān)節(jié)病理?yè)p傷的重要因素之一［15］。MMPs可降解關(guān)節(jié)骨與軟骨中的膠原、蛋白多糖及其他的細(xì)胞外基質(zhì)大分子，促進(jìn)血管翳對(duì)軟骨的侵襲［16］。另有研究報(bào)道，活化的NF?κB轉(zhuǎn)位到核內(nèi)與靶基因的κB基序結(jié)合，以調(diào)節(jié)包括細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的表達(dá)，如可誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子、黏附因子等的表達(dá)［17］。本研究Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，IL?1β誘導(dǎo)HFLS?RA中MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白表達(dá)水平升高，而1、10μmol/L丹皮酚處理后MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白表達(dá)水平降低，提示丹皮酚可能減輕MMPs導(dǎo)致的關(guān)節(jié)病理?yè)p傷，這與HE觀(guān)察結(jié)果基本一致。筆者推測(cè)其機(jī)制可能與丹皮酚下調(diào)TLR4表達(dá)，抑制NF?κB p65核移位，從而減少M(fèi)MPs表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，丹皮酚具有抑制IL?1β誘導(dǎo)HFLS?RA炎性因子表達(dá)的作用，其機(jī)制可能與丹皮酚通過(guò)下調(diào)TLR4表達(dá)，抑制NF?κB信號(hào)通路激活，從而減少促炎細(xì)胞因子及MMPs釋放有關(guān)。同時(shí)，丹皮酚還可以降低CIA小鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生和軟骨破壞，降低關(guān)節(jié)炎臨床評(píng)分，這些結(jié)果表明丹皮酚在治療RA方面具有潛在的應(yīng)用前景。

Fig.3 Subcellular localization of NF-κB p65 observed by immunofluorescence assay(×400)圖3免疫熒光法觀(guān)察NF-κB p65亞細(xì)胞定位（×400）

Fig.8 Effects of paeonol on joint histology of CIA mice(HE Staining,×400)圖8丹皮酚對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)組織學(xué)影響（HE染色，×400）