張瑩瑩，郭緒昆，鄭君毅，劉婷，張瑩，馬靜，劉寅

阿司匹林聯(lián)合血小板P2Y12受體拮抗劑氯吡格雷的雙聯(lián)抗血小板聚集治療（dual antiplatelet therapy，DAPT）在心血管疾病的抗栓治療中發(fā)揮了重 要 的 作 用［1］，但 氯 吡 格 雷 抵 抗（Clopidogrel resistance，CR）的臨床現(xiàn)象不斷被報道［2］，與治療后血小板高反應（high on?treatment platelet reactivity，HTPR）相關的血栓事件也不可避免［3］。有研究表明，藥物相互作用［4］、肝臟細胞色素P4502C19（CYP2C19）基因多態(tài)性［5?6］、合并糖尿?。?］、吸煙［8］等多種因素均與CR相關。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類大約由22個堿基構(gòu)成的短鏈RNA，能靶向結(jié)合mRNA的3'非編碼區(qū)（UTR）于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)mRNA的表達。miRNA異常表達與包括心血管疾病在內(nèi)的多種疾病相關［9］。Landry等［10］首次報道血小板富含大量的miRNA，其中miR-223、let-7c和miR-19a的含量較為豐富；編碼血小板重要受體P2Y12mRNA的3'UTR存在miR-223的結(jié)合位點，并發(fā)現(xiàn)了兩者相結(jié)合的證據(jù)。血小板P2Y12受體是氯吡格雷的作用靶點,但CR是否與miR-223的表達水平相關尚不明確。本課題組前期通過定量血小板和血漿miR-223表達水平已經(jīng)初步證實，血小板反應指數(shù)（platelet reactive index，PRI）與miR-223表達水平呈負相關［11?12］。但也有研究報道在健康志愿者行抗血小板聚集治療會降低miR-223的表達水平［13］。非ST段抬高急性冠脈綜合征（NSTE?ACS）為冠心病的重要類型，本研究連續(xù)納入NSTE?ACS并接受經(jīng)皮冠狀動脈介入（PCI）及DAPT的患者為研究對象，旨在進一步明確血漿miR-223表達水平與患者服用氯吡格雷后血小板反應的相關性，并探索miR-223差異表達與患者臨床預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象連續(xù)納入2016年10月—2017年2月天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科收治的接受PCI及DAPT治療的NSTE?ACS患者208例，其中男119例，女89例，年齡28～80歲，平均（58.5±9.2）歲。NSTE?ACS診斷符合2012年我國《非ST段抬高急性冠脈綜合征診斷和治療指南》［14］。排除標準：（1）肝腎功能嚴重不良者，合并其他終末期疾病，預期壽命小于1年者。（2）先天性心臟病、心臟瓣膜病、嚴重充血性心力衰竭（NYAH分級Ⅳ級）或心源性休克者。（3）入院前長期服用氯吡格雷等抗血小板聚集藥物，或口服華法林、利伐沙班、達比加群等抗凝藥物者。（4）周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病者。（5）急性感染、免疫性疾病、腫瘤患者。（6）血液系統(tǒng)疾病，近期有出血傾向或血小板計數(shù)（PLT）異常（＜100×109/L或＞450×109/L）者。（7）應用炎癥抑制藥物，如非甾體類抗炎藥、類固醇及阿片類藥物。（8）不能完成2年隨訪者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集收集入組患者基本資料，包括性別、年齡、高血壓史、糖尿病史、吸煙史、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、質(zhì)子泵抑制劑（PPI）和他汀類用藥史等?；颊哂谌朐寒斕煨蠨APT，口服300 mg氯吡格雷和300 mg阿司匹林，于次日清晨采集肘正中靜脈血約12 mL分別用于血漿miR-223定量、血小板功能檢測、CYP2C19*2*3基因型鑒定和臨床生化指標檢測。臨床生化指標包括血常規(guī)［白細胞計數(shù)（WBC）、中性粒細胞比例（N）、淋巴細胞比例（L）、PLT］、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT，比色法）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST，比色法）、尿素氮（BUN，比色法）、肌酐（Cr，酶法）、尿酸（UA，比色法）、總膽固醇（TC，酶比色法）、三酰甘油（TG，比色法）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL?C，酶比色法）、同型半胱氨酸（Hcy，酶比色法）、高敏C反應蛋白（hs?CRP，速率散射比濁法）、肌鈣蛋白I（TnI，化學發(fā)光法）、B型尿鈉肽（BNP，化學發(fā)光法）。

1.2.2 采用實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測血漿miR-223表達2～3 mL枸櫞酸鈉抗凝全血，1 000 r/min常溫離心10 min，收集上清350μL，轉(zhuǎn)移至無RNase EP管中，加入1 mL RNAiso for Small RNA（TaKaRa，中國大連），按照說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA（One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit，TaKaRa，中國大連），按以下體系進行PCR反應：總體系25μL，SYBR Green master mix 12.5μL，上、下游引物各1μL（TaKaRa，中國大連），cDNA模板1μL，RNase Free dH2O補足至25μL。反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火1 min，產(chǎn)物自55～95℃溶解，共45個循環(huán)。PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。以內(nèi)參基因Human-5srRNA進行標化，采用2?ΔΔCt法計算miR-223的相對表達量。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 血小板功能檢測通過流式細胞術(shù)測定血小板血管舒張刺激磷蛋白（VASP）磷酸化水平，計算PRI，即VASP?PRI。取枸櫞酸鈉抗凝全血30μL平均分裝至3個抗凝管中，按試劑盒說明書（PLT VASP/P2Y12，BIOCYTEX，法國）操作加樣，分別加入前列腺素E1（PGE1）或PGE1+二磷酸腺苷（ADP）。低速振蕩混勻，室溫孵育10 min，多聚甲醛固定后分別加入抗VASP?P鼠單克隆抗體+破膜劑或陰性同型對照+破膜劑，室溫孵育。以CD61?PE進行血小板熒光標記。通過流式細胞儀定量每個樣本中ADP抑制VASP磷酸化的能力。根據(jù)靜息態(tài)（PGE1）和激活態(tài)（PGEI+ADP）校正的平均熒光強度（MFI）按公式由計算機計算出PRI。

1.2.4 CYP2C19*2/*3基因型鑒定采用Genomic DNA Purification Kit（Promega）試劑盒提取人基因組DNA，按照試劑盒說明書進行操作。PCR反應總體系50μL，2×Taq PCR Master Mix（博邁德生物）25μL，上下游引物各1μL、基因組DNA模板500 ng，RNase Free dH2O補齊總體系至50μL。循環(huán)條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0）純化PCR產(chǎn)物，純化后的PCR產(chǎn)物分別用相應的限制性內(nèi)切酶QuickCutSmaⅠ（TaKaRa）、QuickCutBamHⅠ（TaKaRa）消化酶切。酶切后的產(chǎn)物分別進行3%、2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用GEL DOC2000凝膠成像系統(tǒng)分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶SmaⅠ消化后，野生型純合子，在限制性內(nèi)切酶作用下被切斷呈兩條帶；突變型純合子，因失去了限制性內(nèi)切酶的酶切位點，電泳結(jié)果呈一條帶。呈三條帶即為雜合子。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ消化后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，野生型純合子被切斷呈兩條帶。突變型雜合子，呈三條帶，未見突變型純合子。根據(jù)電泳結(jié)果可以判斷患者是否攜帶突變基因。引物序列見表1。

1.2.5 SYNTAX評分回顧性分析患者冠狀動脈造影病變特點，包括冠狀動脈的優(yōu)勢分布、病變部位、狹窄程度與病變特征（開口病變、分叉病變、完全閉塞、病變長度＜20 mm、嚴重迂曲、嚴重鈣化等），根據(jù)SYNTAX評分計算網(wǎng)站www.syntaxscore.com所提供的計算器得出SYNTAX評分［15］。

1.2.6 隨訪在患者出院后的1、3、6、9、12、18、24個月，對其進行門診或電話隨訪，隨訪終點為主要不良心血管事件（MACE），包括全因死亡、急性心肌梗死、支架內(nèi)再狹窄、支架內(nèi)血栓形成。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0和Graphpad prism 6.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料先通過Kolmogorov?SmirnovZ法進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。非正態(tài)分布計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann?WhitneyU檢驗。計數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。血漿miR-223表達水平與PRI的相關性采用Spearman相關分析。通過Cox回歸模型檢驗研究指標對MACE的影響因素。診斷效能判斷通過受檢者工作特征（ROC）曲線分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料比較根據(jù)PRI中位數(shù)將患者分為低PRI組（PRI≤56.3%）和高PRI組（PRI＞56.3%），各104例。2組患者年齡、性別、BMI、高血壓病史、糖尿病病史、吸煙史、飲酒史、臨床生化指標、用藥史等差異均無統(tǒng)計學意義；CYP2C19*2/*3基因多態(tài)性、冠脈病變SYNTAX評分差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

2.2 血漿miR-223表達水平與PRI的相關性低PRI組患者血漿miR-223水平高于高PRI組［（1.15（0.58，1.80）vs.0.64（0.26，1.08），Z=0.471，P＜0.05］。Spearman相關分析顯示，血漿miR-223表達水平［0.97（0.34，1.36）］與PRI［（55.93±12.86）%］呈負相關（rs=?0.420，P＜0.05）。

Tab.2 Comparison of basic data between the two groups of patients表2 2組患者基本資料的比較

2.3 NSTE?ACS患者MACE發(fā)生風險分析208例患者中30例（14.4%）發(fā)生MACE，其中死亡1例，再發(fā)急性心肌梗死3例（經(jīng)冠脈造影均證實為急性支架內(nèi)血栓形成），26例隨訪期間復查冠脈造影發(fā)現(xiàn)支架內(nèi)再狹窄，狹窄程度＞50%。低PRI組MACE發(fā)生率低于高PRI組（P＜0.05），見表3。

Tab.3 ComparisonofriskanalysisofMACEoccurrencein NSTE-ACS patients between the two groups表3 2組NSTE-ACS患者MACE風險比較［例（%）］

2.4 NSTE?ACS患者發(fā)生MACE的危險因素以NSTE?ACS患者隨訪期間是否發(fā)生MACE（是=1，否=0）為因變量，以年齡、性別（男=1，女=0）、吸煙史（是=1，否=0）、hs?CRP、TnI、BNP、攜帶CYP2C19*2突變基因（是=1，否=0）、攜帶CYP2C19*3突變基因（是=1，否=0）、SYNTAX評分、miR-223表達、PRI為自變量，進行Cox比例風險回歸分析，結(jié)果顯示，血漿miR-223表達水平高是MACE的獨立保護因素，PRI高是MACE的獨立危險因素（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Cox regression analysis of the risk of MACE in patients with NSTE-ACSs表4 NSTE-ACS患者發(fā)生MACE的Cox比例風險回歸分析

2.5 血漿miR-223表達水平和PRI預測MACE事件的診斷效能ROC曲線顯示，血漿miR-223表達水平和PRI預測MACE的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.700（95%CI：0.609～0.791，P＜0.05）和0.710（95%CI：0.606～0.815，P＜0.05），臨界值分別為0.99、61.5%，敏感度分別為86.7%、63.3%，特異度分別為50.0%、69.1%，Youden指 數(shù) 分 別 為0.37、0.32，見圖1、2。

Fig.1 ROC curve for plasma miR-223 in predicting MACE圖1 血漿miR-223表達水平預測MACE事件ROC曲線

Fig.2 ROC curve for PRI in predicting MACE圖2 PRI預測MACE事件ROC曲線

3 討論

急性冠狀動脈綜合征（ACS）是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂，繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎的一組臨床綜合征。Zampetaki等［16］于2012年最早提出血漿miR-223表達水平與心血管事件相關。有研究顯示血小板P2Y12受體mRNA的3'UTR存在miR-223結(jié)合位點，并發(fā)現(xiàn)了兩者相結(jié)合的證據(jù)［10］，而P2Y12受體是血小板激活的重要受體，也是氯吡格雷的作用靶點。有研究發(fā)現(xiàn)，PLT及血漿miR-223表達水平與PRI呈負相關［11?12］。本研究結(jié)果顯示，208例NSTE?ACS患者血漿miR-223表達水平與PRI呈負相關，與以往研究結(jié)果一致。

ACS患者由于動脈粥樣硬化斑塊破潰激活血小板，血小板胞漿中的致密顆粒釋放ADP作為血小板的次級激活劑。ADP與血小板膜表面的P2Y12受體相互作用，持續(xù)激活血小板。氯吡格雷的作用靶點正是P2Y12受體,而VASP是P2Y12下游信號通路產(chǎn)物，可被磷酸化激活。根據(jù)上述機制，通過流式細胞術(shù)定量檢測VASP磷酸化比例，計算VASP?PRI，可評價血小板受抑制的程度。已有多項臨床研究表明，根據(jù)VASP?PRI定義的HTPR與臨床缺血事件相關性良好［3，17?18］。因此,本課題采用VASP?PRI檢測方法來定義血小板反應性，PRI的中位數(shù)為56.3%。筆者前期小樣本探索性研究納入冠心病患者62例，PRI中位數(shù)為55.0%［12］，與本研究結(jié)果接近。國外早期研究報道以50%作為CR的診斷標準［2］。一項歐洲的研究納入486例PCI術(shù)后患者，以63.3%作為CR分界標準［19］，可見VASP?PRI的分界標準在世界范圍內(nèi)存在差異，與入選研究對象的種族差異、年齡、性別、疾病構(gòu)成不同有關，但范圍在50%～63%，本研究采用PRI中位數(shù)56.3%對患者分組，結(jié)果顯示，低PRI組患者血漿miR-223表達水平高于高PRI組。

氯吡格雷需經(jīng)過肝臟細胞色素P450酶代謝轉(zhuǎn)化后才能發(fā)揮抗血小板活性作用，而CYP2C19為其中的限速酶，CYP2C19基因突變會影響氯吡格雷的體內(nèi)激活。CYP2C19等位基因突變可能與氯吡格雷抵抗和缺血性心血管事件增加有關［5?6，20］。因此，本研究檢測了亞洲人群中最為常見的2個CYP2C19功能缺失等位基因［21?22］，結(jié)果顯示，低PRI組與高PRI組CYP2C19*2/*3等位基因攜帶無明顯差異。SYNTAX評分廣泛應用于評估冠狀動脈病變的嚴重程度和指導血運重建。本研究結(jié)果顯示，低PRI組與高PRI組SYNTAX評分亦無明顯差異。

有研究報道，新型P2Y12受體拮抗劑替格瑞洛和普拉格雷由于更強的抗血小板聚集作用，較氯吡格雷能進一步降低缺血并發(fā)癥，已經(jīng)在高?；颊咧械玫捷^廣泛的應用［19，23］。應用替格瑞洛或普拉格雷的患者血漿miR-223表達水平較應用氯吡格雷的升高，而其PRI較應用氯吡格雷患者降低［24］。以上研究結(jié)果進一步證實了miR-223表達水平升高與血小板受抑制程度相關。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-223表達水平與2型糖尿病患者發(fā)生缺血性腦卒中有關，miR-223低表達患者更易發(fā)生缺血性腦卒中，推測原因是miR-223低表達導致血小板活性增高，進而增加了缺血性腦卒中的風險［25］。結(jié)合以往研究，吸煙 史［26］、攜帶CYP2C19*2/*3突 變 基因［5］、SYNTAX評分［27］、BNP［28］、TnI［29］、hs?CRP［30］是心血管疾病患者發(fā)生MACE的影響因素，本研究將年齡、性別、吸煙史、hs?CRP、TnI、BNP、攜帶CYP2C19*2突變基因、攜帶CYP2C19*3突變基因、SYNTAX評分、miR-223表達、PRI等指標納入Cox比例風險回歸模型，分析NSTE?ACS患者發(fā)生MACE的影響因素，結(jié)果顯示，血漿miR-223表達水平高是MACE的獨立保護因素，PRI高是MACE的獨立危險因素。ROC曲線顯示，miR-223、PRI預測MACE的AUC≥0.700，診斷價值可靠。

綜上所述，循環(huán)miR-223表達水平與服用氯吡格雷后ACS患者PRI呈負相關，循環(huán)miR-223表達水平和PRI是ACS患者PCI術(shù)后發(fā)生MACE的獨立預測因子。