龔 云，李 敏

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要微血管并發(fā)癥之一，在糖尿病患者中發(fā)病率為20%～40%，病變主要累及腎臟小血管和腎小球，引起蛋白尿排泄和濾過異常（許曼音，2012）。目前研究認為，其發(fā)病機制可能與遺傳易感性、糖脂代謝紊亂及腎小球血流動力學(xué)改變等因素有關(guān)。這些因素長期存在可導(dǎo)致腎小球系膜基質(zhì)及基底膜合成增加、降解減少，最終導(dǎo)致腎小球硬化（許曼音，2012）。孟瑞（2008）的研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗大鼠腎小球、腎小管、足細胞等多部位形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且這些變化出現(xiàn)早于糖尿病臨床癥狀。劉曦等（2017）的研究顯示，姜黃素類似物L(fēng)6H4可能通過下調(diào)TGF-β1的表達來抑制FN、Col-IV的大量分泌，減輕細胞外基質(zhì)的沉積，從而起到保護2型糖尿病大鼠腎臟的作用。但鮮見有氧運動對糖尿病大鼠糖代謝、腎臟顯微結(jié)構(gòu)及功能影響的相關(guān)研究。本研究通過8周有氧跑臺運動，觀察糖尿病大鼠糖代謝、腎臟顯微結(jié)構(gòu)與功能的變化，并探討早期有氧運動干預(yù)對2型糖尿病大鼠腎臟的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

選取8周齡健康雄性Wistar大鼠[購自蘭州大學(xué)實驗動物中心，SPF 級，SCXK（甘）2010-0001、SYXK（甘）2010-0002]40只，體質(zhì)量185～220 g，SPF級維持飼料喂養(yǎng)、自由飲食。動物室溫度22℃～23℃，相對濕度38%～42%，自然通風(fēng)、光照，每周紫外線消毒1次飼養(yǎng)室和用具。

1.2 建模、分組及運動

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取10只作為對照組（NC組，普通飼料喂養(yǎng)、自由飲水）。其余大鼠以高脂、高糖飼料（10%蔗糖、10%豬油、5%膽固醇）喂養(yǎng)4周，期間正常飲水，第30天（前1天禁食12～16 h，不禁水）按30 mg/kg體質(zhì)量逐只腹腔注射STZ（鏈尿佐菌素，購自sigma公司，用1%枸櫞酸鈉緩沖液，pH 4.2），48 h后，連續(xù)3天同一時間取血測血糖，若血糖≥16.67 mmol/L且出現(xiàn)“三多一少”體征，即可判為建模成功，成功率約為70%（Matteucci et al.，2008）。NC組大鼠注射等量的枸櫞酸鈉緩沖液。將建模成功的大鼠隨機分為兩組：糖尿病組（DM，8只）和糖尿病運動組（DS，8只）。參考Bedford等（1979）的方法，DS組大鼠先行3天適應(yīng)性跑臺（DSPT-202，中國杭州錢江科工貿(mào)公司制造）運動，強度從15 m/min（15 min，0°）開始，逐漸增加到 25 m/min（30 min，0°）（趙杰修 等，2007），連續(xù)運動8周，1次/天，逢周日休息1天。NC組、DM組大鼠不運動，籠內(nèi)自由活動。期間觀察各組大鼠飲食、尿量及精神狀態(tài)等。

常用的糖尿病動物模型的建造方法有手術(shù)法和實驗法兩種，前者行外科手術(shù)切除胰腺后成模，后者多用四氧嘧啶或鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射成模。其中STZ對β細胞有毒性作用，可使β細胞變性、壞死，因其毒性較小、比較穩(wěn)定而多被選用。2型糖尿病屬非胰島素依賴型糖尿病，即胰島素分泌相對不足，其發(fā)病機理存在兩方面因素：胰島素抵抗和β細胞分泌功能障礙。在2型糖尿病大鼠模型具體建造方法上，因成年、雄性成模率高多被選用，通常采用高脂、高糖飼料喂養(yǎng)1月余以誘發(fā)胰島素抵抗，并佐以小劑量單次STZ腹腔注射而成模，整個過程與人類2型糖尿病發(fā)病過程極為相似。國內(nèi)外學(xué)者多采用血糖≥16.67 mmol/L為建模成功的判定標準（Matteucci et al.，2008），這有別于部分學(xué)者采用血糖≥11.1 mmol/L或≥13.8 mmol/L的判定標準。在STZ注射劑量選擇上，常以50 mg/kg為中等劑量判定標準，大于或小于該值均會對模型產(chǎn)生不同影響。模型建立的成功與否是決定實驗成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實驗選用Wistar成年雄性大鼠建模，以高脂、高糖飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周，單次小劑量腹腔注射STZ（30 mg/kg），以血糖≥16.67 mmol/L為成模判定標準，所以本實驗建造的2型糖尿病大鼠模型在質(zhì)量控制上是科學(xué)的、可靠的。

1.3 取材及指標測試

在實驗前、后分別逐只準確測量各組大鼠體質(zhì)量（清晨空腹）。實驗結(jié)束時，將各組大鼠逐一腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉麻醉，真空管心尖取血測血糖（FBG，美國會好血糖儀）、血清胰島素（Ins，放射免疫法，GC-911放射免疫γ計數(shù)器，科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司）及糖化血清蛋白（GSP，比色法）含量；采用Microlab zoo（荷蘭威圖）半自動生化分析儀測血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）及尿酸（UA）值，后置于冰盤上迅速取左側(cè)腎臟，濾紙拭干血漬后用鑷子去除腎包膜，并分離其皮質(zhì)，縱切左腎一半置于10%福爾馬林浸泡過夜，組織切片備用。

1.4 制片、觀察及數(shù)據(jù)處理

隨機切取各組大鼠左腎5 mm3皮質(zhì)2塊，脫水后行常規(guī)石蠟包埋并切片（組織切片機，德國徠卡儀器有限公司），隔2選1脫蠟、H.E.染色，中性樹膠封片，每組制片10張，用Motic數(shù)碼顯微鏡（BA400/450，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）觀察大鼠腎臟顯微結(jié)構(gòu)，每張切片再隨機選取3個視野，分別在100及400倍下拍照。采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以平均值±標準差（M±SD）表示。組間差異采用單因素方差分析，組內(nèi)差異比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，用GraphPad Prism 6.02作圖。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量

多飲、多食、多尿及進行性體重下降是糖尿病患者的重要體征。建模前、后及實驗?zāi)└鹘M大鼠體重變化見表1。

表1 建模前、后及實驗?zāi)┐笫篌w質(zhì)量變化Table 1 The Changes of Body Weight Before，After and End of the Experiment M±SD，g

2.2 實驗前、后各組大鼠血糖

血糖穩(wěn)態(tài)的維持對機體生理生化反應(yīng)十分重要，適時檢測血糖可及時了解機體糖代謝狀況。注射STZ前后及實驗?zāi)└鹘M大鼠血糖變化情況見表2。

表2 注射STZ前、后及實驗?zāi)┐笫笱亲兓疶able 2 The Changes of Blood Glucose Before andAfter Injected STZ and at the End of ExperimentM±SD，mmol/L

2.3 各組大鼠血清Ins及GSP

實驗?zāi)?，各組大鼠血清Ins及GSP測試結(jié)果見表3及圖1。

表3 各組大鼠血清胰島素和糖化血清蛋白的變化Table 3 The Changes of Serum Insulin and GSPby the End of Experiment in Each Group M±SD

圖1 3組大鼠血清胰島素、糖化血清蛋白比較Figure 1. The Comparison of Serum Insulin and GSPin Three Groups at the End of Experiment

2.4 實驗?zāi)└鹘M大鼠腎功的變化

臨床上，血清肌酐、血尿素氮及尿酸是反映腎臟功能狀況的重要指標。實驗?zāi)?組大鼠Scr、BUN及UA測試結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠血清肌酐、尿素氮和尿酸的測定結(jié)果Table 4 The Results of Scr，BUN and UAin Each GroupM±SD

2.5 各組大鼠腎臟顯微結(jié)構(gòu)觀察

取各組腎臟組織常規(guī)固定后行石蠟切片、H.E.染色，選定視野后分別在100、400倍顯微鏡下拍照，用Motic數(shù)碼顯微鏡（BA400/450）在100倍照片上測量腎小球周長、面積，由此計算形狀因子（shape factor，SF）（表5）。

表5 各組大鼠腎小球周長、面積及形狀因子推算結(jié)果Table 5 The Results of Perimeter，Area and SF in Glomerulus in Each Group M±SD

NC組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常（圖2a），毛細血管腔開放（圖2b）；DM組大鼠腎小球萎縮變小（圖2c），基底膜出現(xiàn)不均勻增厚，足突融合、消失、系膜細胞增生（圖2d），腎小囊腔變寬（圖2d）；經(jīng)8周有氧運動干預(yù)后，DS大鼠腎組織結(jié)構(gòu)較DM組有明顯改善，腎小球結(jié)構(gòu)基本正常（圖2e），毛細血管腔部分開放（圖2f）。

圖2 各組大鼠腎臟H.E.染色切片F(xiàn)igure 2. The Slices of Kidney H.E.Staining in Each Group

3 討論

隨著人們生活水平不斷提高，糖尿病發(fā)病率也逐年提高，特別是2型糖尿病占比持高不下，可直接累及心、腦、腎等臟器，并出現(xiàn)腎功異常乃至衰竭等并發(fā)癥，嚴重危害患者生命健康。其中，腎臟因其位置深、血流量大，功能變化比較隱匿不常被發(fā)現(xiàn)，一旦功能異?；蜻w延不愈或無法逆轉(zhuǎn)而走向替代療法。因此，關(guān)注2型糖尿病患者腎臟早期變化意義重大。

3.1 各組大鼠體質(zhì)量、血糖、血清Ins及GSP的變化

2型糖尿病患者的典型體征為“三多一少”，即多食、多飲、多尿及體質(zhì)量減輕。體質(zhì)量變化在一定程度上是判定糖尿病病情發(fā)展轉(zhuǎn)歸的易測指標。由實驗結(jié)果（表1）可知，注射STZ 1周后，DM、DS組大鼠體質(zhì)量較NC組明顯下降（P＜0.05），從側(cè)面印證了該模型建立是成功的；8周跑臺運動結(jié)束時，NC組大鼠體質(zhì)量極顯著（P＜0.01）高于建模前及實驗?zāi)〥M、DS組大鼠；此時DS組大鼠體重也顯著（P＜0.05）高于DM組大鼠，表明中等強度有氧運動在一定程度上有延緩2型糖尿病大鼠體質(zhì)量持續(xù)下降的作用。這與本組以前的實驗結(jié)果及同類實驗結(jié)果保持一致。

血糖是反映糖尿病病情及病程的重要指標。機體血糖穩(wěn)態(tài)的維持對各項生理功能影響頗大。2型糖尿病由于機體胰島素的分泌不足或胰島素抵抗，使機體不能有效利用葡萄糖，造成血糖濃度超過腎糖閾而出現(xiàn)尿糖，持續(xù)高血糖易引發(fā)機體諸多不適及并發(fā)癥。因此，血糖濃度成為評判機體糖代謝正常與否的重要指標，但其受諸多因素影響而波動。葡萄糖是機體能量代謝的重要底物，在運動與血糖關(guān)系上，前期研究證明運動能增強胰島素的敏感性（Maiorana et al.，2002），并能上調(diào)骨骼肌GLUT4的基因和蛋白表達水平而提高其轉(zhuǎn)運效率（龔云等，2017），抑制糖異生，也可改善蛋白質(zhì)和脂肪代謝而降低糖、脂毒性（王桂芳 等，2019），降低機體炎癥反應(yīng)（Mathur et al.，2008），改善氧化應(yīng)激水平及血管內(nèi)皮損傷狀況，進而有效降低糖尿病患者的血糖水平（Lukács et al.，2015；Riddell et al.，2017）。有研究顯示，對T2DM患者進行中等強度運動干預(yù)后，血糖水平明顯下降（王耀光等，2004；徐國琴等，2002）。李俊等（2017）的研究提示，有氧運動可能通過改善胰島素敏感性，降低血糖，減輕機體糖應(yīng)激。朱洪竹等（2016）的研究表明，6周有氧游泳訓(xùn)練能顯著降低2型糖尿病大鼠的血糖。注射STZ 1周后，DM、DS組大鼠血糖比注射前及NC組大鼠血糖極顯著增高（P＜0.01，表2），說明注射STZ并復(fù)合高糖、高脂飼料建造的2型糖尿病模型是成功的。經(jīng)過8周的跑臺運動，DS組大鼠血糖盡管仍比NC組大鼠血糖極顯著增高（P＜0.01），但與DM、運動前DS組大鼠相比，有顯著下降趨勢，說明中等強度有氧運動有阻抑糖尿病病情持續(xù)發(fā)展的作用。

胰島素是體內(nèi)唯一的降血糖激素，由胰島β細胞分泌。血清蛋白及其他肽鏈N端為纈氨酸的蛋白質(zhì)可與葡萄糖發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)，形成高分子酮胺化合物，結(jié)構(gòu)類似于“果糖胺”（GSP），其半衰期較短，可有效地反映患者1～3周前的血糖均值，是追蹤病情、觀察糖尿病療效的重要指標。本實驗結(jié)果（表3、圖1）顯示，實驗?zāi)cNC組比較，DM、DS組大鼠血清Ins水平均極顯著下降（P＜0.01），但DS組Ins水平較DM組顯著上升（P＜0.05），表明中等強度有氧運動可升高DM大鼠血清Ins水平；在GSP方面，與NC組相比，DM組極顯著升高（P＜0.01），而DS組較DM組顯著下降（P＜0.05），仍顯著高于NC組大鼠，提示有氧運動可以顯著改善DM大鼠血糖水平。叢琳等（2001）曾對DM大鼠進行12周中低強度跑臺運動訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠血清Ins和C肽水平顯著增高，糖代謝紊亂得到改善，并可減輕胰島素抵抗。這與本實驗結(jié)果基本一致。其機制可能是機體糖尿病狀態(tài)下，因STZ對胰島β細胞的損害而導(dǎo)致胰島素分泌相對減少，血糖順應(yīng)性升高，而8周有氧運動應(yīng)激后血糖幾近耗竭，且這種下降的糖負荷或可反饋調(diào)節(jié)胰島β細胞、外加受損的部分β細胞得到修復(fù)而分泌較多的胰島素。具體機制可能涉及胰島β細胞分泌胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控過程。

3.2 有氧運動對DM大鼠腎臟結(jié)構(gòu)的影響

腎臟是糖尿病累及的主要臟器，DN是糖尿病最嚴重和最常見的慢性并發(fā)癥之一。糖尿病可通過多種途徑損害腎臟，并累及從腎小球到腎小管和腎間質(zhì)的幾乎所有結(jié)構(gòu)，但以腎小球病變最為突出。有研究證明，DN的病理變化主要表現(xiàn)為腎小球血管間質(zhì)增生和膠原合成增加，造成結(jié)節(jié)型和彌漫型腎小球硬化（趙守香等，2004）。光學(xué)顯微鏡和電鏡觀察可見腎小球基底膜有線狀沉積物，并已證實為IgG、IgM、HbAlc和白蛋白，且常發(fā)生于晚期，沉積反映了基底膜異常及漏出增加。本研究顯示，NC組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，毛細血管腔開放；DM組大鼠腎小球基底膜出現(xiàn)不均勻增厚，足突融合、消失、系膜細胞增生；經(jīng)有氧運動干預(yù)后，DS組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)較DM組有明顯改善，腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，毛細血管腔部分開放。另外，糖尿病屬于內(nèi)分泌性代謝紊亂綜合癥。機體糖代謝紊亂可導(dǎo)致腎臟微血管病變（蔣國彥，1992；孫洞簫等，1997），高血糖使膠原纖維之間的葡萄糖異常交叉聯(lián)結(jié)增多、穩(wěn)定性增強，導(dǎo)致糖化膠原纖維分解緩慢，同時糖化膠原與白蛋白、IgG結(jié)合增加，引起基底膜蛋白沉淀而增厚；高血糖還可使腎小球上皮細胞糖蛋白合成增加，致使基底膜增厚；基底膜纖維聯(lián)結(jié)蛋白糖化，以其為媒介的膠原纖維之間的正常聯(lián)結(jié)減少，造成腎小球濾過膜的孔徑增大，導(dǎo)致微血管損傷，從而引發(fā)糖尿病腎病（關(guān)子安等，2000）。良好的血糖控制可使腎小球濾過率顯著改善，延緩糖尿病微血管病變的發(fā)生。

SF是反應(yīng)細胞組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的重要參數(shù)，本實驗表示腎小球周長與面積的比值（崔亞南等，2002），可反應(yīng)腎小球形狀的變化。實驗結(jié)果（表5）顯示，DM組大鼠腎小球周長及面積均較NC組大鼠顯著減小（P＜0.05），而SF顯著增大（P＜0.05）；經(jīng)8周有氧運動干預(yù)后，DS組大鼠腎小球面積較DM組大鼠顯著增加（P＜0.05），但仍顯著低于NC組大鼠。據(jù)此推測，8周有氧運動對受損的腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)有顯著改善作用。

3.3 有氧運動對DM大鼠腎功的影響

現(xiàn)已知，Scr是骨骼肌中磷酸肌酸代謝的終產(chǎn)物，而BUN是血漿中除正常蛋白質(zhì)外的其他含氮代謝廢物，二者雖不能作為腎臟結(jié)構(gòu)及功能受損的早期預(yù)警敏感指標，但其升降確也能提示腎臟結(jié)構(gòu)及功能的微細變化，特別是腎小球濾過功能及血尿屏障的微細變化，所以值得高度關(guān)注。本實驗?zāi)I功檢查結(jié)果（表4）顯示，雖然各組Scr、BUN沒有突破正常高值，但DM組大鼠Scr、BUN極顯著高于NC組大鼠（P＜0.01），經(jīng)8周有氧運動干預(yù)后，DS組大鼠Scr、BUN雖仍顯著（P＜0.05）高于NC組大鼠，但比DM組大鼠顯著下降（P＜0.05）。UA是嘌呤代謝的終產(chǎn)物，在本實驗各組間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。提示8周有氧運動可以顯著改善2型糖尿病大鼠腎臟功能，腎小球濾過能力顯著增強。何黛等（2009）的研究提示，6周有氧運動可通過提高糖尿病腎損傷大鼠機體抗氧化能力、減少AR（醛糖還原酶）基因表達，由此抑制多元醇通路激活；并通過下調(diào)TGF-β1mNA和Smad蛋白表達，進而抑制TGF-β1/Smad信號通路傳遞效率?？赡芡ㄟ^這兩條途徑發(fā)揮其對糖尿病腎損傷大鼠腎功能的保護作用。

DN的發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚不完全清楚。但最根本的原因是在遺傳易感的基礎(chǔ)上出現(xiàn)了糖代謝異常、血流動力學(xué)障礙、生長因子和細胞因子等的免疫損傷。糖代謝異常通過晚期糖基化終末產(chǎn)物生成、多元醇通路激活、蛋白激酶C（PKC）的激活3條途徑導(dǎo)致微血管病變，從而損傷腎臟。血流動力學(xué)改變的機械力和剪切力可能引起內(nèi)皮細胞或上皮細胞的損害，從而破壞正常的濾過屏障，并且可直接激活PKC。據(jù)此推測，在DN早期，血流動力學(xué)異?？赡馨l(fā)揮了重要作用，或為上述諸多因素相互作用、相互影響的綜合表征。

4 結(jié)論

中等強度有氧跑臺運動可以顯著降低2型糖尿病大鼠的血糖，阻抑體質(zhì)量下降趨勢，升高血清胰島素水平；顯著改善實驗組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)及濾過功能，促使其結(jié)構(gòu)及功能向良好方向轉(zhuǎn)變，或有延遲或阻抑DN發(fā)生、發(fā)展的作用。