袁浩鑫，邢利青，盧 燁，范清娥

（1.大同市第五人民醫(yī)院，山西大同 037000；2.山西大同大學第一臨床醫(yī)院，山西大同 037009）

子宮頸癌（cervical cancer）是來源于子宮頸上皮的惡性腫瘤，主要組織學類型是鱗癌,腺癌次之[1]。在世界范圍內(nèi),子宮頸癌是女性發(fā)病第4 位的惡性腫瘤。生活在較不發(fā)達地區(qū)的婦女,子宮頸癌是繼乳腺癌之后的第2 大常見婦女惡性腫瘤,占全球新發(fā)病例的84%，其病死率在所有女性惡性腫瘤中居于第2 位[2]。近年來該病發(fā)病率呈上升趨勢且年輕化[3-4]。子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展嚴重影響患者的身體健康和生活狀況[5]。探索表達異常的生物學標志物,為早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療宮頸癌提供新的思路具有重要意義。激活的蛋白激酶C 受體1（receptor for activated C kinase 1，RACK1）蛋白是一種高度保守的細胞內(nèi)接頭蛋白,是一種錨定蛋白,可參與細胞內(nèi)多種信號傳導通路,進而影響細胞的生長、遷移和分化等過程,與腫瘤的發(fā)生和進展有關(guān)[6-8]。RACK1 在多種惡性腫瘤中陽性表達較高，但其在子宮頸癌中的表達研究較少。本研究采用免疫組化兩步法及RT-PCR（反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶連鎖反應）測定RACK1 在宮頸癌組及癌旁組的表達，旨在探討RACK1 在宮頸癌中的表達情況，探討其在宮頸癌中的作用，為宮頸癌的早期診斷和治療帶來新的契機。

1 資料

選取大同市第五人民醫(yī)院2015 年1 月-2018 年12 月收治的經(jīng)腹腔鏡或開腹手術(shù)治療且病理學檢查確診為子宮頸癌的組織標本100例作為宮頸癌組，同時取距宮頸癌組織3 cm 以上的宮頸組織作為癌旁組60 例。病例年齡在32～69 歲之間，平均49±7 歲。病理類型：鱗癌67例（其中特殊類型隆起型中分化鱗癌2 例、非角化型鱗狀上皮癌1 例），腺癌33 例（其中特殊類型宮頸基底細胞樣腺癌1例）。采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO，2009 年）的標準對實驗組進行臨床分期：Ⅰ期22 例，Ⅱ期40 例，Ⅲ期27 例，Ⅳ期11 例。分化程度：高31例，中41例，低28例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74 例。納入標準：①符合宮頸癌臨床診斷且均經(jīng)手術(shù)治療者；②病理學檢查最終確診為子宮頸癌的病例；③臨床資料完整，輔助檢查完善；④手術(shù)前未經(jīng)過化療、放療及免疫治療。排除標準：①轉(zhuǎn)移性子宮頸癌；②年齡較大，且合并嚴重的心腦血管疾病及精神疾病等系統(tǒng)性疾病無法耐受手術(shù)者；③合并其它生殖系統(tǒng)惡性腫瘤者；④患有其它系統(tǒng)惡性腫瘤者；⑤臨床資料不完整，缺失，難以進行統(tǒng)計分析及缺少病理標本者。本研究獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準同意，所有參與者均知情同意并簽署知情同意書。

2 方法

2.1 免疫組織化學染色

2.1.1 方法（En Vision 兩步法）

將各組織石蠟包塊切成5 μm 厚度的石蠟切片，常規(guī)脫蠟，免疫組化采用En Vision 兩步法，DAB 顯色。PBS緩沖液代替一抗為陰性對照，已知陽性切片做陽性對照，具體染色步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。檢測試劑盒、一抗RACK1 均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2.1.2 結(jié)果判讀

RACK1 蛋白陽性染色定位于細胞質(zhì)和細胞核，著色呈淺黃色、黃色、棕黃色和黃褐色。取有代表性的10 個高倍視野在高倍鏡（×400）下觀察計數(shù)，根據(jù)著色強度和陽性細胞所占比例進行評分。著色強度：淡棕色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3 分。陽性細胞所占比例，按百分比計數(shù)：1 分（＜25%），2 分（25%～50%)，3 分（＞50%～75%)，4分（＞75%）。每張切片染色陽性細胞占比評分×每張切片染色強度評分得出的結(jié)果，即為免疫組化反應評分，＜4分為陰性，≥4分為陽性。

2.2 反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶連鎖反應RT-PCR

用Oligo6 軟件進行RACK1 引物設計，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。用Trizol 試劑提取宮頸癌組織及宮頸癌旁組織總RNA，并用核酸測定儀測定RNA 含量，取2 μg 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用合成的cDNA 為模板，用PCR 儀分別進行擴增RACK1 mRNA 以及內(nèi)參基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)，其中GAPDH上游引物序列為5′-AGTCTTGCTAGCTACGCG CCT-3′，下游引物序列為5′-CGCTAAAGCTAG CTACGCATCGA-3′，產(chǎn)物長度為195 bp。RACK1上游引物序列為5′-TAGCGGCTAACGTTTACGC C-3′，下游引物序列為5′-AGGCTGCTAGCTAAC CGTCAA-3′，產(chǎn)物長度為324 bp。循環(huán)條件為：90 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共計40個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，12 ℃保存。PCR 結(jié)束后，各取5μL 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，后經(jīng)溴化乙錠染色，采用電泳凝膠成像分析系統(tǒng)測定RACK1/GAPDH 的灰度比，作為RACK1mRNA相對表達量。

2.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)至少重復3 次，采用SPSSl8.0 統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，計量資料數(shù)據(jù)用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 RACK1蛋白陽性表達率

宮頸癌組RACK1蛋白陽性表達率為66.00%（66/100），高于宮頸癌旁組陽性表達率8.33%(5/60)，2 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3.2 宮頸癌組與宮頸癌旁組中RACK1 蛋白表達情況比較

RACK1 蛋白在低分化宮頸癌組織中的表達率高于高、中分化者,在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中的表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）,而在國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO，2009年）臨床分期、浸潤深度及不同病灶直徑宮頸癌組織中的RACK1蛋白陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 宮頸癌組中RACK1蛋白表達差異

3.3 反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶連鎖反應（RT-PCR 法）測定RACK1 mRNA相對表達量

用RT-PCR 法檢測結(jié)果顯示，宮頸癌組RACK1 mRNA相對表達量平均值（0.798±0.124）高于宮頸癌旁組平均值（0.269±0.076），差異有統(tǒng)計學意義（t=33.479，P=0.000）。反應產(chǎn)物條帶見圖1。

4 討論

宮頸癌的惡性程度及對女性身體健康的危害不容置疑。目前已知13～15 種HPV 與子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變和子宮頸癌發(fā)病密切相關(guān)[1]。在發(fā)達國家已建立完善的宮頸癌疫苗接種體系。目前，二價、四價、九價宮頸癌疫苗已在我國獲得批準使用，但疫苗不能覆蓋所有致病的HPV 型別。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療子宮頸癌，對于女性身體健康仍至關(guān)重要。RACK1 分子是一種錨定蛋白，可以調(diào)控多條信號通路，引發(fā)信號分子形成復合物，從而調(diào)控基因表達，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)，RACKl 在乳腺癌、肝癌、食管癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和肺癌等多種惡性腫瘤中表達呈陽性且升高[9-12]。本研究結(jié)果顯示RACK1蛋白在宮頸癌組陽性表達率高于宮頸癌旁組；在低分化宮頸癌組織中的表達率高于高、中分化者，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中的表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。而在FIGO 分期、浸潤深度及不同病灶直徑方面無明顯差異。

綜上所述，RACK1 在宮頸癌組織中陽性表達較高，且其表達與腫瘤的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，隨著進一步的研究與探索，RACK1 有可能會作為評估子宮頸惡性病變生物學行為的潛在分子標志物，為早發(fā)現(xiàn)、早診斷宮頸癌提供理論依據(jù)。針對RACK1靶基因的治療，可能會成為宮頸癌治療的一種全新而有效的方法，可為宮頸癌的治療提供新的思路，為以后進一步的研究和更好的指導臨床工作打下基礎。