黃志勇 林智遠(yuǎn) 陳淑賢

結(jié)直腸癌是常見的消化道腫瘤之一，全球每年約有50 多萬(wàn)人死于此病[1]，僅次于乳腺癌、前列腺癌和肺癌[2]。腫瘤患者通常確診時(shí)平均年齡69 歲，其中大于65 歲占60%，大于75 歲占36%[3]。結(jié)直腸癌的發(fā)展與飲食習(xí)慣和生活方式有關(guān)。在這些危險(xiǎn)因素中，肥胖[4]、吸煙[5]、酗酒以及高脂肪和低膳食纖維的食物[6]起主導(dǎo)作用。結(jié)直腸癌早期臨床癥狀很不明顯，因此患者被確診時(shí)一般都處于腫瘤中晚期，已錯(cuò)過(guò)最佳治療期[7]。用于檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物，也稱為生物標(biāo)志物，是由癌細(xì)胞或身體其他細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)癌癥的反應(yīng)。癌胚抗原（CEA）是結(jié)直腸癌最常用的腫瘤標(biāo)志物，其次是CA125、CA19-9[8]，但CEA、CA125、CA19-9 敏感性均較低，無(wú)法早期診斷結(jié)直腸癌[9，10]。目前，尚無(wú)有效的早期生物標(biāo)志物用于診斷結(jié)直腸癌，因此我們需要尋找結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)志物，以期達(dá)到早期診斷。

miRNA 是小的非編碼RNA 序列，通過(guò)與mRNA結(jié)合而誘導(dǎo)基因降解或翻譯受阻，從而抑制基因表達(dá)，在很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[11]。miRNA作為臨床生物標(biāo)志物的潛在用途成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，其穩(wěn)定性高和相對(duì)容易的檢測(cè)使其成為快速、無(wú)創(chuàng)診斷的理想指標(biāo)[12]。miRNA 微陣列可以同時(shí)識(shí)別同一樣本中幾百個(gè)基因的表達(dá)，為檢測(cè)miRNA 的表達(dá)提供了一種穩(wěn)健的方法[13]。這些高通量陣列的廣泛和全面使用使miRNA 表達(dá)的量化和其在物種內(nèi)和物種間的鑒定成為可能[14]。目前有很多研究已經(jīng)指出多種miRNA 對(duì)腫瘤的診斷和預(yù)后具有較高價(jià)值，例如計(jì)算Delta 循環(huán)閾值法比較Ct miR-503 與Ct miR-511 之間的差異，對(duì)腎上腺皮質(zhì)癌與良性腺瘤的診斷具有高度的敏感性和特異性[15]；miR-451 表達(dá)下調(diào)與胃癌預(yù)后不良相關(guān)[16]；慢性淋巴細(xì)胞性白血病中miR-34a 低表達(dá)，可以作為其預(yù)后不良的標(biāo)志[17]等。miRNA 在結(jié)直腸癌的診斷中也發(fā)揮了重要作用，結(jié)直腸癌患者血清外泌體中的某些特定的miRNA（miR-638、miR-5787、miR-8075、miR-6869-5p 和miR-548c-5p）可以作為結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物[18]。研究顯示，miR-424-5p 在結(jié)直腸癌組織和正常組織中也存在顯著差異，且可以通過(guò)靶向CCNE1 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性發(fā)展[19]。

本研究通過(guò)檢測(cè)并比較89 例結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織中miR-424-5p 的表達(dá)水平，繪制ROC 曲線研究其在結(jié)直腸癌中的診斷意義。同時(shí)對(duì)這89 例患者隨訪，探究miR-424-5p 表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)后價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料本研究選擇2016年7月～2019年3月我院收治的89 例結(jié)直腸癌患者，均通過(guò)病理確診為結(jié)直腸癌。其中男45 例，平均年齡（63.4±9.2）歲，女44 例，平均年齡（60.3±12.7）歲?；颊咝g(shù)前均未接受任何放化療或免疫治療，臨床病理資料完整，患者及其家屬知情且簽署知情同意書。在手術(shù)期間獲得患者結(jié)直腸癌組織樣本及配對(duì)癌旁正常組織樣本（距離腫瘤組織2cm），樣本切除后均于液氮中快速冷凍。樣本的腫瘤組織學(xué)均經(jīng)過(guò)資深病理醫(yī)生認(rèn)證，樣本獲取過(guò)程符合我院倫理委員會(huì)的要求。

1.2 檢測(cè)方法通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR（qRT-PCR）對(duì)患者的結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的miR-424-5p 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。使用mirVana 試劑盒（Life Technologies）操作說(shuō)明分離miRNA。然后使用Superscript Ⅱ試劑盒（Invitrogen）將總RNA 反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa，Dalian，China）說(shuō)明操作，在Applied Biosystems 7500 序列檢測(cè)系統(tǒng)（Applied Biosystem）上進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃ 30s（變性）；95℃ 5s（復(fù)性），60℃ 34s（延伸），40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)反應(yīng)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物設(shè)計(jì)：has-miR-424-5p：正向特異性引物：5'-CAGCAGCAATTCATGT-3'，反向特異性引物：5'-TGGTGTCGGAGTCG-3'；U6 內(nèi)參基因：正向特異性引物：5'-CTCGCTTCGGCACGACA-3'，反向特異性引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。用2-ΔΔCt值計(jì)算miR-424-5p 的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)過(guò)程在GraphPad Prism 軟件（8.0 版，GraphPad software, Inc.， La Jolla, CA，USA）和SPSS 軟件（26.0 版，SPSS Inc.， Chicago，IL）進(jìn)行。采用Kaplan-Meier 曲線分析結(jié)直腸癌患者的總生存期。利用ROC 曲線檢測(cè)miR-424-5p 在結(jié)直腸癌中的診斷能力。通過(guò)SPSS 26.0 繪制ROC 曲線，使用秩和檢驗(yàn)計(jì)算曲線下面積（AUC）。面積越大，判斷值越高。

1.4 隨訪89 例患者均至少隨訪1 次?？偵嫫冢∣S）是指從手術(shù)后第1 天到死亡或最后一次隨訪的持續(xù)時(shí)間，無(wú)進(jìn)展生存期（DFS）是指患者從手術(shù)第1 天開始到復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移前的生存時(shí)間。隨訪期從患者接受治療的第1 天開始，截至2019年11月31日，89 例患者隨訪8～30 個(gè)月，中位數(shù)為11.7 個(gè)月。整個(gè)過(guò)程中無(wú)失訪，隨訪率為100%。

2 結(jié)果

2.1 miR-424-5p 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況結(jié)直腸癌組織中的miR-424-5p 表達(dá)水平為0.899±0.197，顯著低于正常組織的1.296±0.241，根據(jù)結(jié)直腸癌組織和正常組織中的miR-424-5p 表達(dá)量差異繪制ROC 曲線（見圖1）。可知曲線下面積（AUC）：0.899，特異性：89.9%，靈敏度：76.4%，約登指數(shù)：66.3%，cut-off 值：1.0915。提示miR-424-5p在結(jié)直腸癌中具有較高的診斷價(jià)值，且具有很好的靈敏度和特異性。

2.2 miR-424-5p 低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系生存分析顯示，在結(jié)直腸癌中，miR-424-5p 低表達(dá)結(jié)直腸患者的總生存期明顯比高表達(dá)的短,低表達(dá)的miR-424-5p 提示了結(jié)直腸癌患者較低的總生存率（見圖2A）。DFS 曲線顯示miR-424-5p高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期明顯長(zhǎng)于miR-424-5p 低表達(dá)。提示miR-424-5p 低表達(dá)代表了較短的無(wú)進(jìn)展生存期（見圖2B）。miR-424-5p在結(jié)直腸癌患者總生存率中的預(yù)后價(jià)值ROC 曲線顯示AUC：0.703，cut-off 值：1.1875，靈敏度68.9%，特異性77.3%（見圖2C）；miR-424-5p 在結(jié)直腸癌患者無(wú)進(jìn)展生存期中的預(yù)后價(jià)值ROC 曲線顯示AUC：0.716，cut-off 值：1.0125，靈敏度67.1%，特異性68.4%（見圖2D）。提示miR-424-5p 低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)，AUC 值提示miR-424-5p 表達(dá)在結(jié)直腸癌中具有較好的預(yù)后價(jià)值，但靈敏度和特異性相對(duì)不高。

圖1 miR-424-5p 在正常組織和結(jié)直腸癌中表達(dá)水平及診斷價(jià)值

圖2 miR-424-5p 總生存率和無(wú)進(jìn)展生存期及對(duì)應(yīng)的預(yù)后價(jià)值

3 討論

2010年歐洲已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌是第三常見的惡性腫瘤[20]。盡管與某些腫瘤相比，結(jié)直腸癌的死亡率較低，但是結(jié)直腸癌的臨床管理常因多種相關(guān)合并癥而變得復(fù)雜，進(jìn)而對(duì)健康經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生負(fù)面影響[21]。而且我們了解到，結(jié)直腸癌治療的主要問(wèn)題包括術(shù)后腫瘤的高復(fù)發(fā)率以及在隨訪期間頻繁的侵入性診斷檢測(cè)。因?yàn)榻Y(jié)腸鏡檢查的高成本和其不便利使得患者依從性很低[22]，所以發(fā)現(xiàn)更優(yōu)異更容易接受的診斷手段和診斷標(biāo)志物成為結(jié)直腸癌治療過(guò)程中亟需解決的問(wèn)題。

研究顯示miRNA 可從不同的生物樣品中提?。ú痪窒抻诮M織），包括血清、唾液[23]、糞便[24]。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA 在腫瘤早期就具有高特異性和靈敏度[25]。本實(shí)驗(yàn)選擇miRNA 作為結(jié)直腸癌診斷及預(yù)后標(biāo)志物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。有研究表明，miR-424-5p 在結(jié)直腸癌組織和正常組織中表達(dá)水平存在顯著差異[19]。我們的檢測(cè)結(jié)果則證實(shí)，根據(jù)組織中miR-424-5p 的表達(dá)水平差異，可以將其作為結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志物。ROC 分析結(jié)果顯示，miR-424-5p 低表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌具有較高的診斷價(jià)值，其靈敏度和特異性也較高；生存分析結(jié)果顯示，miR-424-5p 低表達(dá)時(shí)結(jié)直腸癌患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期均更短，ROC 分析結(jié)果同樣提示miR-424-5p 低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)。

本研究檢測(cè)組織中miRNA 的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)其可以作為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。今后還需進(jìn)一步大樣本研究，以進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)論。