張盼濤，盛東北，張 亞，田 輝，段佳蕾，劉武杰，田克恭

(國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽 471000)

H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)為低致病性禽流感病毒，是家禽常見的病毒之一[1]。H9N2亞型AIV雖不會(huì)導(dǎo)致家禽高發(fā)病率和高病死率，但可引起雞上呼吸道感染，產(chǎn)蛋率下降，損害雞免疫系統(tǒng)，引起其他病原的繼發(fā)感染[2]。H9N2亞型AIV不僅影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展，同時(shí)也威脅人類公共衛(wèi)生安全。1998年以來已有多例H9N2亞型AIV感染人的報(bào)道，這也加快了全球?qū)υ搧喰颓萘鞲胁《镜难芯縖3-4]。H9亞型禽流感滅活疫苗有效控制了該病的流行，然而，疫苗免疫失敗的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，在活禽市場中依然能夠檢測到大量的H9N2亞型AIV。引起該現(xiàn)象的原因是其HA基因不斷發(fā)生變異，造成現(xiàn)有疫苗保護(hù)力下降[5-7]。本研究從安徽合肥某雞場分離到1株H9N2亞型禽流感病毒HF株，免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明該毒株具有良好的免疫原性，為了驗(yàn)證由該毒株制備的滅活疫苗對(duì)當(dāng)前流行毒株的保護(hù)效果，篩選2018年和2019年各2株H9N2亞型流行毒株對(duì)免疫HF株滅活疫苗和商品化疫苗的SPF雞進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，評(píng)估HF株滅活疫苗對(duì)流行毒株的免疫攻毒保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 10株H9N2亞型禽流感病毒株，包括HF株、A181877-2018株、A181878-2018株、A182078-2018株、A182096-2018株、A190194-2019株、A190543-2019株、A190759-2019株、A190854-2019株和A191001-2019株，來源于河南、湖南、山西、江西、安徽、山東6個(gè)省份，均由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心分離、鑒定、保存。

1.1.2 疫苗 將HF株經(jīng)滅菌生理鹽水稀釋至10-3，經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1 mL，37℃孵育96 h，收獲雞胚尿囊液，用終濃度為2 mL/L的甲醛溶液滅活病毒，滅活后進(jìn)行HA效價(jià)測定、無菌檢驗(yàn)及滅活檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后按照油相∶水相為1∶2的體積比乳化制苗，并對(duì)疫苗成品進(jìn)行性狀與無菌檢驗(yàn)；某企業(yè)商品化雞新城疫、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗(批號(hào)：01171226)。

1.1.3 SPF雞和SPF雞胚 SPF雞胚購自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司；SPF雞購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 生物安全柜(BHC-1300 Ⅱ A/B3)，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；生物安全型隔離器(GJ-1)，蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HA基因遺傳進(jìn)化分析 對(duì)HF株及其他分離株的HA基因進(jìn)行測序，用MEGA6軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，并根據(jù)遺傳進(jìn)化分析結(jié)果選取代表毒株進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。

1.2.2 雞胚半數(shù)感染量(EID50)測定 將HF株及選取的代表毒株用滅菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-7～10-10稀釋度的病毒液，經(jīng)尿囊腔接種10日齡～11日齡SPF雞胚，0.1 mL/枚，每個(gè)稀釋度接種5枚，37℃培養(yǎng)120 h ，逐胚測定HA效價(jià)，HA效價(jià)大于1∶16判定為陽性，參考Reed-Muench方法計(jì)算出病毒EID50。

1.2.3 分組與免疫 3周齡SPF雞，共100只，其中1～8組每組10只，第1～4組腿部肌肉免疫H9亞型禽流感病毒HF株滅活疫苗，第5～8組肌肉免疫商品化雞新城疫、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗，均為0.3 mL/只。剩余20只分為4組，5只/組，為攻毒對(duì)照組。

1.2.4 采血與攻毒 免疫3周后，各試驗(yàn)組雞只采血并分離血清，用H9亞型禽流感病毒HF株制備的HI抗原檢測HI抗體效價(jià)。同時(shí)進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，攻毒試驗(yàn)共分為12組，1～4組為HF株滅活苗免疫組；6～8組為商品化疫苗免疫組；9～12組為對(duì)照組。采血當(dāng)天進(jìn)行攻毒，疫苗免疫組與對(duì)照組攻毒毒株為A181877-2018、A182096-2018、A190543-2019、A191001-2019，靜脈注射，0.2 mL/只(含107.0EID50)。

1.2.5 病毒分離 攻毒后連續(xù)觀察14 d，至第5天時(shí)，分別采集每只雞的喉頭及泄殖腔拭子，將同一只雞的喉頭及泄殖腔拭子混合后作為1個(gè)樣品，經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.2 mL，孵育觀察120 h，逐胚測定雞胚尿囊液的HA效價(jià)。每個(gè)拭子樣品接種的5枚雞胚中只要有1枚雞胚液的HA效價(jià)不低于1∶16(微量法)，即可判為病毒分離陽性。對(duì)病毒分離陰性的樣品，應(yīng)盲傳1代后再進(jìn)行判定。

2 結(jié)果

2.1 HA基因遺傳進(jìn)化分析

選取2018年H9亞型禽流感病毒分離株4株、2019年H9亞型禽流感病毒分離株5株，與HF株一起進(jìn)行HA基因的遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，包括HF株在內(nèi)的10株分離株均屬于當(dāng)前流行毒株所屬的h9.4.2.5譜系，綜合考慮毒株的分離時(shí)間、地點(diǎn)、親緣關(guān)系及區(qū)域流行情況，本研究選取2018年和2019年分離的A181877-2018株、A182096-2018株、A190543-2019株、A191001-2019株作為代表毒株進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)(圖1)。

2.2 病毒株EID50測定

經(jīng)測定，HF株、A181877-2018株、A182096-2018株、A190543-2019株和A191001-2019株每0.1 mL的病毒含量依次為109.2EID50、108.4EID50、108.4EID50、108.5EID50和108.7EID50，對(duì)應(yīng)的HA效價(jià)依次為9 log2、9 log2、8 log2、8 log2和8 log2。

表1H9亞型AIV流行毒株攻毒保護(hù)結(jié)果

2.3 HI抗體測定和攻毒試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)雞以0.3 mL/只免疫HF株滅活疫苗，3周后其HI抗體效價(jià)可達(dá)9.1 log2～9.5 log2；以同樣劑量免疫商品化雞新城疫、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗后，其HI抗體效價(jià)為5.7 log2～6.3 log2，兩者抗體滴度存在3 log2的差異，表明HF株滅活疫苗相較于商品化疫苗能誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生更高水平的HI抗體滴度，具有更好的免疫原性(表1)。

對(duì)相同條件下的免疫組和空白對(duì)照組雞分別攻毒4株分離株(107.0EID50/0.2 mL/只)，所有雞只在攻毒后14 d觀察期內(nèi)均無任何臨床癥狀，精神狀況、采食良好，無全身和局部不良反應(yīng)。采集攻毒后第5 d雞的喉頭及泄殖腔拭子，接種雞胚檢測排毒情況，計(jì)算病毒分離陽性率和攻毒保護(hù)率。結(jié)果顯示，4組空白對(duì)照組雞攻毒后拭子分離均為陽性，排毒率均為100%(5/5)；HF株疫苗對(duì)A181877-2018株、A182096-2018株、A190543-2019株病毒的攻毒保護(hù)率均為100%(10/10)，對(duì)A191001-2019株的攻毒保護(hù)率為90%(9/10)；商品化疫苗對(duì)A181877-2018株、A182096-2018株、A190543-2019株、A191001-2019株病毒的攻毒保護(hù)率分別為60%(6/10)、70%(7/10)、60%(6/10)、40%(4/10)。以上結(jié)果表明，以HF株為抗原制備的滅活疫苗相較于商品化疫苗，更能保護(hù)免疫雞抵抗當(dāng)前流行毒株的攻擊，具有更好的免疫保護(hù)效果(表1)。

▲分離株，●商品化疫苗代表株▲ isolate strains,●commercial vaccine represent strains

3 討論

疫苗株與流行毒株間的基因同源性和抗原差異性決定了疫苗對(duì)流行毒株的保護(hù)效果[8]，不同時(shí)期、不同地點(diǎn)分離的H9亞型AIV相較于前幾年有一定程度的變異[9-10]。因此，需要評(píng)估不同禽流感病毒株的抗原性，從而篩選具有良好保護(hù)效果的疫苗株。毒株之間的交叉攻毒保護(hù)試驗(yàn)是篩選疫苗候選株最可靠的辦法[11]。本研究根據(jù)HA基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果篩選攻毒用流行毒株，結(jié)果表明HF株及9株H9N2亞型禽流感病毒分離株的HA基因均屬于當(dāng)前流行毒株所屬的h9.4.2.5譜系[12-13]。 2007年之后，我國H9亞型AIV流行主要以A/Chicken/Guangxi/55/2005類的病毒為代表的h9.4.2.5分支為主[14]。綜合考慮毒株的分離時(shí)間、地點(diǎn)、親緣關(guān)系及區(qū)域流行情況，選取2018年和2019年各2株分離株進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。

將研制的禽流感病毒HF株滅活疫苗和商品化雞新城疫、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗分別以0.3 mL/只的劑量接種21日齡SPF雞，3周后采血測定HI抗體效價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HF株滅活疫苗相較于商品化疫苗能誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生更高水平的HI抗體滴度，具有更好的免疫原性。以107.0EID50的劑量分別靜脈注射4株代表流行毒株后，免疫HF株滅活疫苗的雞總攻毒保護(hù)率接近100%。本研究中，分離自2015年的HF株制備的滅活疫苗能夠保護(hù)免疫雞抵御2018年-2019年H9N2亞型禽流感流行毒株的攻擊，具有良好的免疫原性，HF株是當(dāng)前預(yù)防H9N2亞型禽流感良好的疫苗候選株。