李彩虹 高巧玲 羅幼珍

(三峽大學 第一臨床醫(yī)學院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 婦產(chǎn)科， 湖北 宜昌 443003)

近20年來，卵巢癌發(fā)病率以每年0.1%的速度增長，全球每年新發(fā)約238 700 例，嚴重危害女性身心健康[1]。但在過去30年中卵巢癌患者預后始終沒有顯著提高。由于缺乏早期特異性臨床表現(xiàn)和診斷方法，大多數(shù)患者確診時已達晚期，患者5年存活率從診斷I期的90%降為Ⅳ期的4%，晚期患者5年生存率仍不足30%，致死率高居女性生殖系統(tǒng)腫瘤首位[2]。導致卵巢癌預后差的主要原因是卵巢癌細胞容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。約25%的確診患者對鉑類制劑不敏感，嚴重影響卵巢癌患者的化療效果，顯著降低了患者的5年生存期，同時藥物副作用降低患者生存質(zhì)量[3]。

近年來，采用某些中藥或復方制劑達到協(xié)同化療藥物治療的用藥思路備受國內(nèi)外眾多學者青睞。中藥因其毒副作用小、作用范圍廣，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮極為廣泛的作用[4]。

黃芪多糖(astragalus polysacharide，APS)是黃芪的主要成分之一，具有益氣補虛之功效。隨著研究的深入，學者發(fā)現(xiàn)APS在調(diào)節(jié)免疫功能、抗毒性、心臟保護、促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化中起著重要作用[5， 6]。近年來，其抗腫瘤作用也成為學者研究的熱點。APS是否對卵巢癌的化療產(chǎn)生作用，目前尚無相關報道。本實驗擬通過觀察APS對卵巢癌SKOV3細胞順鉑(cisplatin，DDP)化療的影響，并探討其可能的分子機制，以期為APS聯(lián)合化療改善卵巢癌預后提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及培養(yǎng)

SKOV3細胞購自武漢巴菲爾生物技術有限公司。用含10%胎牛血清和1% Penicillin-Streptomycin Solution(Hyclone，美國)的MC5A培養(yǎng)基(Sigma，美國)，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 藥物和試劑

DDP注射液購于江蘇豪森藥業(yè)有限公司(批號：Z20040813)，注射用APS購于天津賽諾制藥有限公司(批號：Z20040086)，純度≥95%。碘化丙啶(propidium iodide，PI)、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購買于Sigma公司?？股?，DY14011，由Hyclone公司生產(chǎn)。0.25% Trypsin，購自Gibco公司(批號：15050065)。胎牛血清，購自Hyclone公司(批號：SV30087.02)。細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物(貨號：KGA108)。兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗Caspase-3、小鼠抗β-Actin均購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 MTT比色法檢測各組SKOV3細胞增殖情況

取對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的SKOV3細胞，調(diào)整細胞密度到5×104/mL，以100 μL/孔接種96孔板。根據(jù)不同藥物及濃度進行分組：APS組(濃度分別為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL、1 600 μg/mL)，DDP組(濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL)，聯(lián)合組(APS濃度分別為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL、1 600 μg/mL，DDP濃度為10 μg/mL)，另設對照組(有細胞含培養(yǎng)液和溶劑)，空白組(無細胞只含培養(yǎng)液)。每組3個復孔，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。每孔加入10 μL MTT，37℃培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO震蕩10 min，30 min內(nèi)于酶標儀上568 nm處測定其吸光度(A)值用于計算細胞增殖抑制率，計算方法如下：抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%。為評估聯(lián)合用藥的兩藥作用方法，按金氏公式求出q值進行判斷：q=E(a+b)/(Ea+Eb)-Ea×Eb，其中E(a+b)為兩藥聯(lián)合使用時的抑制率，Ea及Eb為各藥單用時的抑制率。所測值意義：當q<0.85時，表示兩藥拮抗；q>1.15時，表示兩藥協(xié)同；0.85≤q≤1.15時，表示兩藥作用相加。以上實驗重復3次。

1.4 流式細胞儀分析各組SKOV3細胞的細胞周期比例及凋亡率

細胞分為對照組、DDP組(終濃度為10 μg/mL)、APS組(終濃度為800 μg/mL)及聯(lián)合組(DDP終濃度為10 μg/mL，分別聯(lián)合200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL、1 600 μg/mL APS)。各組細胞經(jīng)藥物處理后常規(guī)培養(yǎng)24 h，用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集SKOV3細胞， 1 200 rpm離心5 min，去上清后加PBS重懸，使用PBS清洗細胞2次。

采用細胞凋亡檢測試劑盒(AnnexinV-APC/7-AAD)進行染色，流式細胞儀上機檢測。細胞周期檢測：細胞離心后棄上清，PBS清洗2次，緩慢加入預冷的80%乙醇700 μL，乙醇終濃度為70%， 4℃固定24 h以上，1 000 rpm離心5 min，預冷PBS清洗2次；加入50 μg/mL RnaseA 100 μL，37℃水浴30 min，加入50 μg/mL PI 400 μL，4℃避光染色30 min后檢測。以上實驗重復3次。

1.5 Western blot檢測各組SKOV3細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達

細胞根據(jù)前述分組處理24 h，收集細胞加入細胞裂解液提取細胞總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒操作說明檢測樣品蛋白濃度。蛋白變性后以10% SDS-PAGE膠電泳分離Bax，以12%SDS-PAGE膠電泳分離Bcl-2、Caspase-3，再將其轉移到PVDF膜，室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST充分洗滌PVDF膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，ECL法顯影，攝片。

1.6 RT-PCR檢測各組SKOV3細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3的mRNA表達

細胞根據(jù)前述分組處理后，收集細胞，Trizol法提取RNA, 根據(jù)OD260/OD280比值，估測RNA質(zhì)量，比值在1.8～2.0之間滿足實驗要求。計算樣品RNA的濃度。逆轉錄成cDNA，行RT-PCR檢測。反應條件：94℃ 4 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 25 s，30個循環(huán)；72℃ 4 min，4℃ 4 min。行溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct方式進行分析。實驗所用引物序列如下：

β-actin: Forward 5’-AGCGAGCATCCCCCAA-AGTT-3’，Reverse 5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’(285 bp)；

Caspase-3: Forward 5’-AGAACTGGACTGTGGCATTG-3’，Reverse 5’-CTTGTCGGCATACTGTTTCA-3’(190 bp)；

Bcl-2: Forward 5’-GCCTTCTTTGAGTTCGGTGG-3’，Reverse 5’-GAAATCAAACAGAGGCCGCA-3’(192 bp)；

Bax: Forward 5’-GGATGCGTCCACCAAG-AAG-3’，Reverse 5’-GTTGAAGTTGCCGTCAG-AAAA-3’(163 bp)。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 APS和DDP對SKOV3細胞增殖的影響

經(jīng)MTT法檢測，DDP單藥組伴隨藥物濃度增加及培養(yǎng)時間的延長，對SKOV3細胞增殖的抑制率明顯增高(P<0.05)，呈濃度和時間依賴性(見圖1A)。單藥APS組培養(yǎng)24 h，隨藥物濃度的增加對細胞增殖的抑制率增高，呈濃度時間依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(F=154.99，P=0.000)。當培養(yǎng)時間延長至48 h和72 h時，不同濃度APS對細胞增殖抑制率的差異無統(tǒng)計學意義(F=2.509，P=0.089；F=1.716，P=0.205)(見圖1B)。聯(lián)合用藥組，DDP為10 μg/mL時，隨著APS濃度的增高及培養(yǎng)時間的延長，SKOV3細胞增殖的抑制率明顯增加(P<0.05)，呈顯著濃度和時間依賴性(見圖1C)。

與單用10 μg/mL DDP相比，10 μg/mL DDP+800 μg/mL APS的聯(lián)合用藥組24 h、48 h和72 h時細胞增殖抑制率均明顯升高(見表1)。10 μg/mL DDP聯(lián)合APS作用于SKOV3細胞24 h、48 h時，當APS濃度達到100 μg/mL后，q>1.15，兩藥表現(xiàn)出協(xié)同作用。在培養(yǎng)72 h時，0.85≤q≤1.15時，兩藥合用有相加作用(見表2)。

參照查閱文獻及MTT實驗檢測結果，24 h時DDP半數(shù)抑制率為10±3.45 μg/mL，最終擬定后續(xù)聯(lián)合用藥中DDP終濃度為10 μg/mL，藥物作用時間為24 h。

注：A：不同濃度DDP對SKOV3細胞增殖抑制率； B：不同濃度APS對SKOV3細胞增殖抑制率；C： 10 μg/mL DDP聯(lián)合不同濃度APS對SKOV3細胞增殖抑制率圖1 APS和DDP對SKOV3細胞增殖抑制率的影響

表1 DDP組與DDP+APS組不同時間點SKOV3細胞增殖抑制率的比較

表2 10 μg/mL DDP聯(lián)合不同濃度APS對SKOV3細胞增殖抑制率的q值

2.2 APS和DDP對SKOV3細胞凋亡的影響

培養(yǎng)24 h后，與單用10 μg/mL的DDP相比，隨APS濃度的增加細胞凋亡數(shù)逐漸增高，各組間凋亡率具有統(tǒng)計學差異(F=71.867，P=0.000)。聯(lián)合用藥組中，APS濃度為200 μg/mL與400 μg/mL間(P<0.05)，400 μg/mL與800 μg/mL間(P<0.01)，800 μg/mL與1 600 μg/mL間(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義(見圖2)。

2.3 APS和DDP對SKOV3細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響

SKOV3細胞經(jīng)藥物處理培養(yǎng)24 h后，隨著APS濃度的增高，細胞中Bcl-2的表達逐漸減少，Bax、Caspase-3蛋白表達逐漸增多，Bax/Bcl-2比值逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(見圖3)。

2.4 APS和DDP對SKOV3細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達的影響

RT-PCR檢測結果顯示，隨著APS濃度的增高，細胞中Bcl-2 mRNA表達逐漸降低，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；Bax和Caspase-3 mRNA表達隨APS濃度增高逐漸增加，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(見圖4)。

注：各組間比較，*P<0.05圖2 藥物作用24 h后SKOV3細胞凋亡情況

注： A：代表性蛋白條帶圖，1：對照組； 2：10 μg/mL DDP； 3： 800 μg/mL APS； 4：10 μg/mL DDP+200 μg/mL APS； 5：10 μg/mL DDP+400 μg/mL APS； 6：10 μg/mL DDP+800 μg/mL APS； 7：10 μg/mL DDP+1 600 μg/mL APS； B～D：以β-actin為內(nèi)參，Bax、Caspase-3和Bcl-2的相對蛋白表達水平； E：Bax/Bcl-2比值變化； 與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01圖3 APS和DDP對SKOV3細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響

注：A～C：以β-actin為內(nèi)參，Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的相對表達水平；與對照組相比，*P<0.05， **P<0.01圖4 APS和DDP對SKOV3細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達的影響

3 討論

APS的結構特點由其分子量、單糖序列構成、糖苷結合位置結構、側支類型及聚合程度、 以及空間結構等因素共同決定。研究表明，大多數(shù)APS為雜多糖，分子量為2.1104、4.8106、8.7103、3.6104 的單糖成分具有抗腫瘤作用[7]。

研究者發(fā)現(xiàn)，低濃度APS使人結腸癌細胞中增殖細胞核抗原表達降低，增殖減慢，凋亡增加，提示APS有抑制人結腸癌細胞增殖的可能[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，APS通過固有線粒體途徑誘導人胃癌MGC-803細胞凋亡[9]。Yang等[10]通過對Ehrlich's腹膜癌小鼠給予APS處理后發(fā)現(xiàn)，APS能夠增加脾臟中白細胞介素(interleukin ，IL)-2的表達和上調(diào)組織中Bax的表達，下調(diào)組織Bcl-2表達，增加CD4+T淋巴細胞比例。表明其可能的作用機制包括改善小鼠免疫功能和調(diào)控細胞凋亡相關因子，抑制Ehrlich's腹膜癌的發(fā)生發(fā)展。亦有學者對APS化療增敏作用進行探討。黃宏思等[11]在APS協(xié)同紫杉醇對腫瘤細胞的殺傷作用研究中發(fā)現(xiàn)，APS與紫杉醇聯(lián)合使用具有協(xié)同抗腫瘤作用，且不同濃度的APS作用于人乳腺癌MCF-7細胞后，能顯著抑制細胞增殖。APS可以使腫瘤細胞阻滯在G1期。張瑩等[12]研究發(fā)現(xiàn)，注射用APS對耐DDP人肺腺癌細胞A549/DDP具有耐藥逆轉作用，能明顯增加A549/DDP耐藥細胞對DDP的敏感性，提高細胞死亡率。提示APS可能通過調(diào)節(jié)細胞周期或通過逆轉耐藥提高化療藥物的敏感性，但進一步的作用機制尚不明確。

細胞凋亡屬動態(tài)平衡機制，由多基因控制的在某些病理生理狀態(tài)中的程序性死亡過程。Caspase-3被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，死亡受體與死亡配體結合后通過“死亡效應結構域”啟動Caspase級聯(lián)反應，激活效應因子 Caspase-3等[13]。同時活化Bcl-2家族的促凋亡因子誘導線粒體釋放細胞色素C，介導內(nèi)源性凋亡途徑，從而導致細胞凋亡。Bcl-2、Bax 基因是Bcl-2 家族中調(diào)節(jié)細胞凋亡最重要的調(diào)控基因[14]。在調(diào)整和執(zhí)行細胞凋亡因素的任何變化均對DDP的敏感性有潛在影響，與DDP耐藥和腫瘤復發(fā)相關。

本研究探討了APS聯(lián)合DDP對卵巢癌細胞株SKOV3增殖的影響，結果顯示，APS能增加DDP對SKOV3細胞的促凋亡作用，提高卵巢癌細胞對DDP化療的敏感性，二者有協(xié)同作用。聯(lián)合用藥組SKOV3細胞中的Bax、Caspase-3蛋白表達和基因變化隨著APS濃度增高逐漸增加，Bcl-2表達逐漸減低。聯(lián)合用藥組中，Bax/Bcl-2比值隨著APS濃度增加逐漸升高，提示細胞凋亡水平顯著增加。由此推測，APS可提高卵巢癌細胞對DDP的敏感性，調(diào)節(jié)凋亡相關因子，促進腫瘤細胞凋亡，其具體的作用機制尚需進一步探討。