齊 蕾 仵心軍 徐 超,2 張波波 沈 玥 艾志錄,2 謝新華,2

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院1，鄭州 450002) (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大宗糧食加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，鄭州 450002) (鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所3，鄭州 450006)

大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)是大豆中主要的蛋白成分，與大多數(shù)谷物蛋白相比，含有人體必需的八種氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛[1]。在實(shí)際生產(chǎn)中，干熱處理會使蛋白發(fā)生一定程度的變性，不利于蛋白功能性質(zhì)的保持[2，3]。有很多研究通過蛋白質(zhì)與聚電解質(zhì)的靜電復(fù)合來抑制蛋白受熱后變性聚集的現(xiàn)象，提高蛋白的熱穩(wěn)定性。Jones等[4]研究發(fā)現(xiàn)，熱處理后β-乳球蛋白與果膠的復(fù)合物在廣泛的pH內(nèi)均具有良好的穩(wěn)定性；Xiong等[5]通過對卵白蛋白-羧甲基纖維素?zé)嵴T導(dǎo)的凝膠行為分析，發(fā)現(xiàn)隨著羧甲基纖維素添加量的增大，熱處理后的卵白蛋白的聚集體逐漸消失；Chang等[6]的研究結(jié)果也表明，添加殼聚糖提高了油菜分離蛋白的峰值變性溫度和變性焓值，提高了蛋白的熱穩(wěn)定性。

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid, γ-PGA)是一種由D-或L-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基形成γ-酰胺鍵結(jié)合而成的陰離子聚電解質(zhì)，具有良好的水溶性、增稠性、保水性及可食用性，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛[7，8]。在pH 3.5時(shí)SPI與γ-PGA帶有相反的電荷，可形成較多靜電復(fù)合物，為提高大豆分離蛋白的熱穩(wěn)定性，本文在此條件下對不同濃度及不同水浴加熱時(shí)間下復(fù)合物的濁度值、粒徑、ζ-電位以及蛋白表面疏水性進(jìn)行測定，分析γ-聚谷氨酸對大豆分離蛋白熱穩(wěn)定性的影響，為γ-聚谷氨酸在酸性大豆分離蛋白溶液中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%)、γ-聚谷氨酸(食品級)、8-苯氨基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid, ANS)；鹽酸(HCl)和氫氧化鈉(NaOH)均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5430R型高速冷凍離心機(jī)，752型紫外可見光分光光度計(jì)，LS 13 320型激光衍射粒度分析儀，Zetasizer Nano S90型電位儀，Lumina型熒光分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 SPI溶液與γ-PGA復(fù)合體系的制備

將SPI和γ-PGA粉末分別溶于蒸餾水中，在室溫下攪拌2 h，得到質(zhì)量濃度為10 g/L 的SPI溶液和γ-PGA溶液作為儲液[9]。分別取合適體積的SPI和γ-PGA儲液混合，用蒸餾水稀釋至所需濃度，使大豆分離蛋白的質(zhì)量濃度恒定為5.0 g/L，γ-PGA的質(zhì)量濃度分別為0.5、2.0、5.0 g/L，制備完成后用2 mol/L的HCl以及NaOH調(diào)節(jié)復(fù)合溶液的pH值至3.5。

1.3.2 水浴加熱過程

將復(fù)合溶液于80 ℃下進(jìn)行水浴加熱，加熱時(shí)間分別為1 min(T1)，2 min(T2)，3 min(T3)和 4 min(T4)。將未經(jīng)加熱的復(fù)合物(T0)作為對比[10]。

1.3.3 濁度的測定

將制備好的不同濃度的樣品搖勻，取2 mL樣品倒入比色皿中，用蒸餾水作為空白對照，使用分光光度計(jì)于600 nm處測定其吸光度值，測定溫度為25 ℃[11]。

1.3.4 粒徑的測定

復(fù)合物的粒徑大小使用Beckman Coulter激光粒度分析儀在室溫下進(jìn)行測定，采用通用液體模塊，設(shè)置運(yùn)行長度為60 s，由3個(gè)獨(dú)立樣品的3次進(jìn)樣計(jì)算出體積加權(quán)平均直徑D[4,3][12]。

1.3.5 ζ-電位的測定

采用Malvern Nano ZS 90對復(fù)合體系的ζ-電位進(jìn)行測定，選擇電位測量模式，將復(fù)合溶液放入測量池中進(jìn)行測定，分散介質(zhì)選擇為水，樣品平衡時(shí)間為120 s，測定溫度為25 ℃[13]。

1.3.6 表面疏水性的測定

使用ANS熒光探針法測定蛋白表面疏水性。將制備好的不同濃度的樣品在4 000 r/min的速度下離心20 min，其上清液用pH 3.5的蒸餾水稀釋，并使用Lowry法測定稀釋后上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，使之達(dá)到0.07～0.67 mg/mL之間。取稀釋后的樣品4 mL，加入50 μL 8 mmol/L 的ANS溶液，將其充分混勻后靜置10 min，在330 nm的激發(fā)波長和490 nm的發(fā)射波長下測定其熒光強(qiáng)度，狹縫設(shè)置為5 nm。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組樣品重復(fù)3次測量，使用SPSS16.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin8.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI-γ-PGA復(fù)合物的濁度分析

由圖1可知，水浴加熱前隨γ-PGA質(zhì)量濃度從0.5 g/L提高至5.0 g/L，復(fù)合物濁度值由1.91顯著增加至2.43，但結(jié)合圖2中復(fù)合物粒徑變化情況可知，隨著γ-PGA的增加，復(fù)合物的粒徑在γ-PGA質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí)達(dá)到峰值，而當(dāng)質(zhì)量濃度比為5.0 g/L時(shí)粒徑減小至1.68μm。其原因可能是隨著γ-PGA的增加， SPI分子可以結(jié)合越來越多的γ-PGA分子，并使之形成復(fù)合物，其濁度值及粒徑增大，但當(dāng)帶有大量負(fù)電荷的γ-PGA持續(xù)增加時(shí)，復(fù)合體系中靜電斥力增大，形成了相當(dāng)數(shù)量粒徑較小的復(fù)合物，因此復(fù)合物的粒徑減小但濁度值并未降低[15]。

圖1 SPI-γ-PGA復(fù)合物在水浴加熱前后的濁度

圖2 SPI-γ-PGA復(fù)合物在水浴加熱前后的粒徑

隨著水浴加熱時(shí)間的增加，γ-PGA質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)復(fù)合物濁度值由1.91逐步增加至2.20，γ-PGA質(zhì)量濃度增加為2.0 g/L時(shí)，其濁度值的增長趨于平緩，當(dāng)γ-PGA持續(xù)增加至5.0 g/L時(shí)，復(fù)合物的濁度值略有降低。這是因?yàn)榧訜崾沟鞍追肿涌臻g結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子間互相靠近聚集，引起復(fù)合體系濁度值增高[16]，隨γ-PGA加入后與SPI形成大量靜電復(fù)合物，提高了蛋白的溶解度從而抑制了濁度值的顯著升高，當(dāng)γ-PGA持續(xù)添加至5.0 g/L時(shí)，體系中具有較強(qiáng)的靜電排斥力，抑制了蛋白分子間的熱聚集，提高了SPI分子熱穩(wěn)定性[17]。

2.2 SPI-γ-PGA復(fù)合物的粒徑分析

蛋白分子的粒徑大小直接影響其聚集程度，粒徑越小，蛋白分子分散越均勻，體系越穩(wěn)定[17]。由圖2可知，水浴加熱前，隨著γ-PGA的增加，SPI-γ-PGA復(fù)合物的粒徑在γ-PGA質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí)達(dá)到最大值為92.33 μm，而當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到5.0 g/L時(shí)顯著減小至1.68 μm，這是由于γ-PGA加入后與SPI分子結(jié)合形成了尺寸較大的復(fù)合物，復(fù)合物的粒徑增大，但當(dāng)γ-PGA持續(xù)增加至5.0 g/L時(shí)，高濃度的γ-PGA使復(fù)合體系中有較多的負(fù)電荷，靜電斥力增強(qiáng)，引起復(fù)合物的粒徑減小[18]。

隨著水浴加熱時(shí)間的增加，γ-PGA質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)復(fù)合物粒徑由90.54 μm增至163.66 μm，當(dāng)其質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí)復(fù)合物粒徑從92.34 μm增大至164.08 μm，而在5.0 g/L下，復(fù)合物粒徑從1.68 μm降低至1.38 μm，綜合圖1中復(fù)合物濁度值隨水浴加熱時(shí)間的變化情況可知，當(dāng)γ-PGA濃度較低時(shí)，蛋白分子過量，加熱使較多的蛋白分子發(fā)生了熱聚集，粒徑增大；隨著γ-PGA的增加，熱處理使SPI與γ-PGA形成的靜電復(fù)合物進(jìn)一步聚集，因此當(dāng)γ-PGA質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí)復(fù)合物濁度并未發(fā)生明顯變化但粒徑卻有顯著增長；但當(dāng)γ-PGA質(zhì)量濃度達(dá)到至5.0 g/L時(shí)，分子間靜電斥力較強(qiáng)，導(dǎo)致聚集物發(fā)生一定程度的解離，其粒徑減小[19]。

2.3 SPI-γ-PGA復(fù)合物的ζ-電位分析

SPI與γ-PGA之間的相互作用力主要是靜電相互作用力，復(fù)合物的表面電荷對于體系的穩(wěn)定性具有重要意義，當(dāng)溶液體系的ζ-電位絕對值升高時(shí)，溶液的斥力位能增加，分子熱運(yùn)動所需要克服的能壘加大，體系因此變得更加穩(wěn)定[20]。由圖3可知，隨著γ-PGA添加量的增大，SPI-γ-PGA復(fù)合物的ζ-電位由4.51 mV逐步降低至-27.53 mV。這是因?yàn)殡S著γ-PGA濃度的提高，大豆分離蛋白攜帶的正電荷被部分γ-PGA的負(fù)電荷所中和，其余的γ-PGA分子分散在體系中，體系中凈負(fù)電荷較多，ζ-電位的絕對值增大，復(fù)合體系分散性更好，更為穩(wěn)定[21]。

圖3 SPI-γ-PGA復(fù)合物在水浴加熱前后的ζ-電位

水浴加熱處理后，復(fù)合體系的ζ-電位隨著加熱時(shí)間的增加而逐步降低，在γ-PGA質(zhì)量濃度為5.0 g/L時(shí)，這種降低趨勢得到了抑制。其原因可能是加熱使蛋白分子發(fā)生了一定程度的展開，γ-PGA的陰離子基團(tuán)以及蛋白分子的疏水性氨基酸在熱處理后暴露，使復(fù)合物表面電勢降低[22]，γ-PGA加入后可與SPI形成靜電復(fù)合物，對蛋白分子具有保護(hù)作用，有助于抑制SPI分子因受熱發(fā)生變性，γ-PGA添加至5.0 g/L時(shí)，較多的凈負(fù)電荷使體系中靜電斥力增強(qiáng)，更有利于體系的穩(wěn)定。

2.4 大豆分離蛋白的表面疏水性分析

由圖4可知，水浴加熱之前，添加γ-PGA顯著降低了大豆分離蛋白的表面疏水性，且當(dāng)γ-PGA質(zhì)量濃度增大至5.0 g/L時(shí)蛋白表面疏水性降至最低，這是因?yàn)棣?PGA攜帶有負(fù)電荷，它與蛋白分子通過靜電相互作用形成復(fù)合物，減少了SPI分子表面疏水基團(tuán)的暴露，且當(dāng)γ-PGA濃度較高時(shí)，SPI分子表面的疏水位點(diǎn)也會被γ-PGA分子掩蓋，從而減弱了疏水作用力，使蛋白分子表現(xiàn)出更加親水的特性，抑制了蛋白分子的聚集[23]。

圖4 大豆分離蛋白在水浴加熱前后的表面疏水性

水浴加熱后，隨著加熱時(shí)間的增加，γ-PGA質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)蛋白表面疏水性數(shù)值由3 907.62升高至5 419.39，當(dāng)γ-PGA質(zhì)量濃度增加至5.0 g/L時(shí)，其表面疏水性數(shù)值升高的趨勢趨于平緩，這可能是水浴加熱導(dǎo)致蛋白發(fā)生解折疊，埋藏在內(nèi)部的疏水性殘基暴露到分子外部，表面疏水性升高[24]，當(dāng)γ-PGA加入后與蛋白相互作用形成了靜電復(fù)合物，減少了SPI疏水基團(tuán)的暴露，且較多的γ-PGA分子也起到了掩蓋蛋白分子表面疏水位點(diǎn)的作用，從而減弱了疏水作用力，有利于抑制蛋白受熱后結(jié)構(gòu)的變化。

3 結(jié)論

隨γ-PGA濃度的增加，SPI-γ-PGA復(fù)合物的濁度值增大，但在γ-PGA質(zhì)量濃度達(dá)到5.0 g/L時(shí)其粒徑顯著降低，且復(fù)合體系中ζ-電位及蛋白表面疏水性均降至最低，表明添加γ-PGA提高了復(fù)合體系的穩(wěn)定性。水浴加熱處理后復(fù)合物的濁度值和粒徑增大，其表面電勢降低，蛋白表面的疏水基團(tuán)暴露，蛋白分子易變性發(fā)生聚集，隨加熱時(shí)間的增加這種變化更為明顯，當(dāng)γ-PGA質(zhì)量濃度增加至5.0 g/L時(shí)，復(fù)合體系中具有較強(qiáng)的靜電斥力，有效抑制了SPI分子因熱處理發(fā)生的凝聚，提高了大豆分離蛋白的熱穩(wěn)定性。