許杏萍，蘇 帆，楊子祥，劉俊男，萬瓊蓮，蔡 紅

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南 元謀 651300；3.玉溪師范學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100)

植原體(phytoplasma)是一類非螺旋狀、無細胞壁且專性寄生于韌皮部的植物病原微生物。植原體主要依靠葉蟬和飛虱等媒介昆蟲進行傳播，亦可由植物營養(yǎng)繁殖材料和菟絲子等方式進行傳播，感病植株通常表現(xiàn)為叢枝、花變?nèi)~、黃化、矮化和節(jié)間縮短等癥狀，目前植原體可危害1 000 多種植物，給多種經(jīng)濟作物的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響[1-3]。

植原體的系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系及分類鑒定主要依賴于高度保守的16S rRNA基因序列的遺傳變異性[4-5]。目前基于16S rRNA基因序列RFLP分析的相似系數(shù)對植原體株系進行劃分，已確定了36 個16Sr 組和150 多個亞組[6-7]。然而在植原體分類鑒定體系中，以高度保守的16S rDNA序列信息作為唯一的系統(tǒng)發(fā)育依據(jù)，在鑒定親緣關(guān)系密切的植原體株系上存在缺陷且難以對組內(nèi)植原體株系進行更精確的分類鑒定[8]。為解決植原體分類學(xué)的局限性，研究人員開始利用保守性相對較低的非核糖體基因，如核糖體蛋白(rp)基因和secY基因等作為輔助分類的分子遺傳標(biāo)記，有助于更準(zhǔn)確地對植原體16Sr 組內(nèi)株系的真實系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行更精細的劃分，可進一步將植原體16Sr 組劃分為多個不同的亞組[9-12]。

小駁骨(Gendarussa vulgarisNees)又名駁骨草、接骨草等，屬于雙子葉植物綱唇形目爵床科(Acanthaceae)駁骨草屬(GendarussaNees)，具有極高的藥用價值[13-14]。2019 年，課題組在元謀地區(qū)發(fā)現(xiàn)的疑似感染植原體而誘發(fā)的叢枝癥狀小駁骨病株，其植株生長緩慢、矮化、節(jié)間縮短、腋芽叢生為簇狀并且大部分葉片萎縮變小并黃化，這將會降低小駁骨的產(chǎn)質(zhì)量和藥用價值。

基于作為系統(tǒng)發(fā)育分子標(biāo)記的rp和secY基因具有能夠高度準(zhǔn)確地辨別16Sr 組中亞組間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的能力，同時利用多個系統(tǒng)發(fā)育參數(shù)可以更好地識別和定義植原體株系。本研究將采用PCR 技術(shù)等研究方法對小駁骨植原體16S rRNA、rp及secY基因進行擴增及序列測定，根據(jù)這3 個基因的序列信息構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的比較分析，最終從亞組水平上準(zhǔn)確高效地鑒定小駁骨叢枝植原體株系的分類地位。同時通過對secY 蛋白亞基的蛋白特性、蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽進行分析，從蛋白分泌途徑初步了解植原體病害的致病機理，為研究小駁骨植原體病害的發(fā)生及防治提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要試劑

自然表現(xiàn)叢枝癥狀的小駁骨植株采自云南省元謀縣，并保存于實驗室，并以實驗室保存的苦楝叢枝植原體病株為陽性對照。

新型快速植物基因DNA 提取試劑盒及PCR產(chǎn)物純化試劑盒由百泰克生物技術(shù)有限公司提供；DNA Marker、TransStart?FastPfu DNA Polymerase 和克隆載體試劑盒pEASY?-Blunt Simple Clonging Kit 均來自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由碩擎生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 感病小駁骨植株總DNA 提取和PCR 擴增

選取感病小駁骨植株幼嫩葉片進行總DNA提取，提取總DNA 步驟參照新型快速植物基因DNA 提取試劑盒說明書。

以小駁骨病樣總DNA 為模板，參照PéREZLóPEZ 等[7]和LEE 等[8]設(shè)計的植原體通用引物對P1/P7 和R16F2n/R16R2 對植原體16S rRNA基因通過巢式PCR 進行擴增，同時采用引物對rp (II) F1/rp (II) R1、secY-F/secY-R 分別對rp和secY基因進行直接PCR 擴增。引物合成序列見表1。16S rRNA及rp基因的PCR 擴增反應(yīng)條件參考萬瓊蓮等[15]的研究；secY基因的PCR 擴增反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s，45 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，35 cycle，72 ℃延伸 5 min。

1.2.216S rRNA、rp和secY基因序列的克隆及測定

PCR 擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，對PCR 產(chǎn)物進行純化，并與載體pEASY?-Blunt Simple Cloning Vector 連接轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)細胞Trans1-T1 Phage Resistant 中，37 ℃培養(yǎng)1 h 后取100 μL 均勻涂布于經(jīng)IPTG 和X-gal 處理過的LB 培養(yǎng)基平板上，過夜培養(yǎng)，第2 天進行藍白斑的挑選以及菌液PCR 的陽性克隆子檢測，將含有目的基因片段的菌液送生工測序公司進行序列測定。

1.2.316S rRNA、rp及secY基因序列分析

將測序所獲得的16S rRNA、rp及secY基因的核苷酸序列用Vector NTI 11.5.3.軟件去除序列兩端的載體，以確定測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。利用NCBI 中的ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)尋找rp和secY序列的最大開放閱讀框并進行分析。將序列提交到NCBI 中BLAST比對確認，并進行同源序列檢索；采用MUSCLE(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)對序列進行在線同源性比對，分析基于16SrII 組各植原體16S rRNA、rp及secY基因序列的親緣關(guān)系。利用MEGA X 軟件，以鄰接法(neighbour-joining)構(gòu)建分別基于16S rRNA、rp及secY基因的系統(tǒng)進化樹以便進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的比較分析，確定小駁骨叢枝植原體株系的分類地位。16S rRNA基因序列通過植原體在線分析網(wǎng)站iPhyClassifier (https://plantpathology.ba.ars.usd a.gov/cgibin/resource/iphyclassifier.cgi)進行虛擬RFLP 分析鑒定，明確該株系的候選種分類地位。相關(guān)植原體株系信息如表2。

1.2.4secY基因編碼的蛋白亞基的蛋白特性分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測

分別通過生物信息學(xué)在線分析網(wǎng)站Prot-Param (http://web.expasy.org/protparam/)、Protscale (https://web.expasy.org/protscale/)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)對secY基因編碼的蛋白特性、蛋白親疏水性、蛋白跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)和信號肽進行分析。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence listing

表2 植原體各株系16S rRNA、rp 和secY 基因序列登錄號Tab.2 The accession No.of 16S rRNA,rp gene and secY gene sequence of phytoplasma strain

2 結(jié)果與分析

2.1 小駁骨叢枝病癥狀

由圖1 所示：感病小駁骨植株嚴(yán)重矮化，節(jié)間明顯縮短，側(cè)芽細弱，枝條叢生成簇狀，葉片小而黃。

圖1 云南元謀小駁骨叢枝病癥狀Fig.1 The symptom of G.vulgaris Nees witches’-broom disease of Yuanmou County,Yunnan Province

2.2 序列結(jié)果分析

2.2.116S rRNA、rp和secY基因序列擴增結(jié)果

小駁骨感病植株總DNA 經(jīng)PCR 擴增，均得到大小與陽性對照一致的特異性條帶，而雙蒸水和健康植株總DNA 均未擴增出特異性條帶。測序結(jié)果表明：從小駁骨感病植株樣品總DNA中分別擴增得到了1 248 bp 的16S rRNA基因片段(nested PCR) (MN535183)、1 171 bp 的rp基因片段(MN543078)及1 425 bp 的secY基因片段(MN543069)，這與預(yù)期擴增片段長度相符。由此將該植原體株系命名為云南元謀小駁骨叢枝植原體 (Gendarussa vulgariswitches ’-broom phytoplasma，GvWB-YNym)。

2.2.2 小駁骨叢枝植原體(GvWB-YNym)16S rRNA、rp以及secY基因序列分析

(1)16S rRNA基因序列分析

經(jīng)BLAST 搜索，顯示GvWB-YNym 的16S rRNA基因序列與16SrII-A 亞組為最佳匹配同源序列。經(jīng)MUSCLE 進行在線比對結(jié)果(表3)所示：該序列片段與16SrII-A 亞組的番茄巨芽植原體(Tomato big bud，TBB-YM，GenBank 登錄號：JQ923436)的相似率高達100.00%。由圖2 所示：GvWB-YNym 與植原體16SrII 組明顯聚為一枝，且又與歸屬為16SrII-A 亞組的番茄巨芽植原體(Tomato big bud，TBB-YM，GenBank 登錄號：JQ923436)及來自云南元謀的菊苣叢枝植原體(‘Cichorium intybus’ witches’-broom，CiWB-YNym，GenBank 登錄號：KJ735774)處于同一枝。

(2)rp基因序列的分析

將測序所得的rp基因序列提交到NCBI 網(wǎng)站ORF Finder 進行在線分析，分析結(jié)果表明：rp序列包含了rps3(nt550-1170)基因部分序列和rpl22(nt90-476)基因全部序列，分別編碼了206 和128 個氨基酸。由表3 所示：該序列與16SrIIA 亞組各株系相似率均高于99.74%，且與16SrIIA 亞組中的番茄叢枝(TWB-YNym)相似率高達100%。由圖2 所示：GvWB-YNym 與16SrIIA 亞組同處1 個分枝簇上，且與16SrII 組聚為一大進化枝，這與基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹具有相近之處，表明植原體類群之間具有相似的關(guān)聯(lián)性。因此，依據(jù)rp基因序列可將GvWB-YNym 歸為16SrII-A 亞組。

表3 小駁骨叢枝植原體(GvWB-YNym)16S rRNA、rp 和secY 基因核苷酸序列與部分16SrII 亞組株系的同源性分析Tab.3 Homology analysis of nucleotide sequences between GvWB-YNym 16S rRNA,rp and secY gene with other phytoplasma strains of 16SrII subgroup

(3)secY基因序列的分析

將secY基因序列提交至NCBI 網(wǎng)站ORF Finder 進行在線分析，結(jié)果顯示：secY基因序列包含了整個secY基因(nt74-1336)，編碼了420 個氨基酸。由表3 所示：GvWB-YNym 與植原體16SrII-A 亞組中的5 個植原體相似率達99.79%以上，與16SrII-A 亞組中的印度黑豆叢枝(Bg-WB)相似率達到100%。由圖2 所示：secY基因與16SrII-A 亞組的各個成員共同聚為一群，而與16SrII 組其他亞組及其他外組親緣關(guān)系相對較遠；這也與基于rp基因和16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示出相似的主次分枝順序。據(jù)此結(jié)果推斷，將GvWB-YNym 劃分為16SrII-A 亞組。

2.2.3 小駁骨叢枝植原體(GvWB-YNym)16S rRNA基因在線分類鑒定結(jié)果

經(jīng)iPhyClassifier 在線分類鑒定結(jié)果顯示：該株系16S rRNA基因序列與16SrII-A 亞組代表性植原體花生叢枝植原體株系(L33765)相似性最高，相似系數(shù)高達1.00，且二者間的16S rDNA F2n/R2 序列片段模擬RFLP 圖譜完全一致，上述所有分類結(jié)果均顯示GvWB-YNym 歸屬為16SrⅡ-A亞組。同時，在線分析還顯示：GvWB-YNym 與候選種‘CandidatusPhytoplasma aurantifolia’(U15442)同源性最高，達98.2%，因此可確定GvWB-YNym候選種與‘Ca.Phytoplasma aurantifolia’相關(guān)。

2.2.4secY基因編碼的蛋白亞基生物信息學(xué)分析

經(jīng)分析工具ProtParam 對GvWB-YNym 的secY 蛋白理化特性進行分析，結(jié)果顯示其編碼了420 個氨基酸，分子量為47 720.21 u，理論等電點9.68，脂肪系數(shù)為136.45，不穩(wěn)定系數(shù)31.94，屬于穩(wěn)定蛋白，總平均親水性數(shù)值為0.664，表明該蛋白疏水性較好，屬疏水性蛋白。通過在線分析網(wǎng)站Protscale 對secY 蛋白親疏水性作進一步分析，結(jié)果如圖3 所示。從整體來看，該蛋白疏水氨基酸(正值)多于親水氨基酸(負值)，表現(xiàn)為疏水性，與物理特性預(yù)測結(jié)果一致；其在215 和216 位氨基酸疏水性分值最高(3.661)，疏水性最強；在238 和239 位氨基酸親水性分值最低(-2.678)，親水性最強。

圖3 secY 蛋白親疏水性分析Fig.3 Hydrophilic analysis of secY protein

以在線跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)預(yù)測軟件TMHMM 分析secY 蛋白的跨膜域，結(jié)果(圖4a)顯示：該蛋白氨基酸序列具有10 個顯著且分布相對均勻的跨膜螺旋區(qū)域，表明該蛋白可能定位于細胞中與膜相關(guān)的結(jié)構(gòu)，屬于跨膜蛋白。信號肽是負責(zé)把蛋白引導(dǎo)到不同膜結(jié)構(gòu)的亞細胞器內(nèi)的短肽鏈，通過SignalP 在線分析工具對secY基因進行信號肽分析，分析結(jié)果如圖4b 所示：GvWB-YNym 的secY 蛋白不存在信號肽。

3 討論

圖4 secY 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽分析Fig.4 TMHMM posterior probabilities and prediction of the signal peptide of secY protein

由于植原體難以體外培養(yǎng)，多方面研究均落后于其他細菌，目前植原體的分類鑒定及其親緣進化關(guān)系的研究領(lǐng)域仍然是熱點。高度保守的16S rRNA基因序列常被用作植原體的系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系及分類鑒定遺傳標(biāo)記[5]。隨著計算機技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的加速發(fā)展和日漸成熟完善，16S rRNA基因的虛擬RFLP 圖譜分析在植原體快速分類鑒定以及流行病學(xué)研究的分類學(xué)中越來越重要[16]。根據(jù)IRPCM (2004)規(guī)定[17]，16S rRNA基因序列與現(xiàn)有序列間的同源性大于97.5%時可被認為是相同組的植原體。然而，基于植原體中高度保守的16S rRNA基因序列的2.5%不同的任意閾值對植原體株系進行分組的依據(jù)，不能滿足16S rRNA基因序列同源性雖大于97.5%但在植物寄主范圍和介體昆蟲等方面具有獨特生態(tài)學(xué)和生物學(xué)的植原體株系進行分類的要求。因此，為了能在分子水平上更準(zhǔn)確地區(qū)分植原體株系，便需要引入額外的分子標(biāo)記。而作為輔助分類的其他遺傳標(biāo)記如核糖體蛋白(rp)基因、secY、tuf和23S rRNA基因以及16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列已被廣泛應(yīng)用。

比較分析給定的PnWB 組(16SrII)各亞組之間的同源性發(fā)現(xiàn)：secY基因的序列相似性變化范圍最大，其次為rp基因和16S rRNA基因；GvWB-YNym 與16SrII-A 亞組的親緣關(guān)系最為接近，16S rRNA和rp基因序列在16SrII-A 亞組各株系上表現(xiàn)出高相似性，但rp及secY基因序列比16S rRNA基因序列能夠呈現(xiàn)出更大的遺傳變異性，而secY基因相較于rp基因的序列又具有更大的可變程度，這些信息能夠極大地增強對植原體組內(nèi)遺傳進化關(guān)系密切但不同亞組的分類鑒定能力，且與前人的研究[12,18-22]具有一致性。通過基于16S rRNA、rp及secY基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，也能夠支持這一論斷。根據(jù)16S rRNA、rp及secY基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，都顯示GvWB-YNym 與16SrII-A 亞組的各植原體株系形成單系群，且與其他16SrII 組植原體聚為一大亞枝，但與16SrII 組外的其他亞組植原體明顯劃分為不同進化枝。這3 個系統(tǒng)進化樹分析能夠顯著區(qū)分開植原體株系組與亞組之間的關(guān)系，進一步證實了以rp及secY基因作為分類輔助標(biāo)記的可信度和重要性，是對利用16S rRNA基因?qū)χ苍w進行分類的補充依據(jù)，也表明了GvWB-YNym 歸屬到16SrII-A 亞組的準(zhǔn)確性。然而，分別基于16S rRNA、rp及secY基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中的各個分枝順序并不完全一致，表明16S rRNA、rp及secY基因在其各自的進化史上遺傳變異程度的不一致性。16S rDNA序列的RFLP 分析代表不同的系統(tǒng)發(fā)育譜系，依據(jù)植原體在線分類網(wǎng)站iPhyClassifier 對GvWB-YNym進行快速分類，結(jié)果表明GvWB-YNym 與候選種‘Ca.Phytoplasma aurantifolia’相關(guān)，且與16SrII-A亞組代表性植原體株系花生叢枝植原體(L33765)的16S rDNAF2n/R2 序列片段模擬RFLP 圖譜完全一致，進一步證實了將GvWB-YNym 歸屬為16SrII-A 亞組分類地位的準(zhǔn)確性。這是小駁骨叢枝植原體的首次報道。

原核生物細胞的生長和發(fā)育依賴于Sec 分泌蛋白轉(zhuǎn)運機制，多數(shù)分泌蛋白和整合膜蛋白都需要經(jīng)由此途徑進行轉(zhuǎn)運，其中起重要作用的是膜蛋白三聚體SecYEG 和動力蛋白secA。在Sec 轉(zhuǎn)運酶中，secY、secE、secG 和secA 構(gòu)成作為細胞質(zhì)膜的輸出機制中的轉(zhuǎn)位酶復(fù)合物，secA、secE 和secY 是蛋白質(zhì)易位和細胞活力必不可少的部分。在蛋白轉(zhuǎn)運過程中，前體蛋白經(jīng)由secA 攜帶的伴胞分子的引導(dǎo)，同時利用ATP 酶的水解活性促進該蛋白質(zhì)穿過三聚體SecYEG 形成的跨膜通道到達膜外[23]。植原體有2 個分泌系統(tǒng)，YidC 和Sec，后者幾乎是絕大多數(shù)或所有植原體的共同分泌系統(tǒng)，KAKIZAWA 等[24]發(fā)現(xiàn)：植原體中存在Sec 系統(tǒng)，而secA 和secY 蛋白是其中重要組成部分，但其并不清楚Sec 系統(tǒng)在植原體中的作用機制。岳紅妮等[25]研究發(fā)現(xiàn)：泡桐叢枝(PaWB)植原體中同樣存在的Sec 分泌蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，并猜測該系統(tǒng)可能會直接將細菌蛋白質(zhì)如毒素等轉(zhuǎn)運到宿主細胞質(zhì)或寄主昆蟲細胞中，從而誘發(fā)宿主病癥。本研究通過對secY 蛋白進行生物信息參數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)：該蛋白作為疏水性穩(wěn)定跨膜蛋白存在于感病小駁骨植株中；secY 蛋白含10 個顯著疏水跨膜區(qū)域，與大腸桿菌中的secY 蛋白具有相似的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)[26]，這種膜包埋的結(jié)構(gòu)可賦予secY 蛋白“轉(zhuǎn)運蛋白”功能，為膜蛋白的分泌提供通道，但secY 蛋白中不存在信號肽。由于植原體缺乏細胞壁，其細胞膜可直接與寄主植物的細胞內(nèi)環(huán)境進行接觸，一些與致病性相關(guān)的致病因子可能通過Sec 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)直接釋放到宿主細胞中，導(dǎo)致植株韌皮部功能受損，從而誘發(fā)寄主產(chǎn)生抗病性，影響植物的防御響應(yīng)，進而直接或間接地導(dǎo)致寄主植物或介體昆蟲發(fā)生互作，誘使寄主植物發(fā)生典型植原體病害癥狀。但secY 蛋白在植原體內(nèi)轉(zhuǎn)運機制中扮演的具體角色尚不明確，還有待進一步研究和證實，本研究將為了解Sec 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在植原體的分子致病機制及防治植原體病害上提供更大的幫助。

4 結(jié)論

本研究是首次對小駁骨叢枝植原體病害的相關(guān)報道，明確了小駁骨叢枝病是由植原體所侵染發(fā)生的，確定了該植原體株系16S rII-A 亞組的分類地位；同時對secY 蛋白在Sec 分泌蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的作用進行了初步探討，為了解Sec 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在植原體的分子致病機理及防治此類病害提供幫助